Summary
C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.
Abstract
Kalsiyum göstergeleri kullanımını büyük ölçüde sinirsel dinamikleri ve yönetmelik anlayışımızı geliştirmiştir. Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans, tamamen eşleştirilmiş sinir sistemi ve şeffaf anatomi, kalsiyum göstergeler kullanarak gerçek zamanlı sinirsel dynamics anlamak için ideal bir model sunar. Mikrosıvısal teknolojileri ve deneysel tasarımlar ile birlikte, hem ücretsiz taşıma ve kapana kısılmış hayvanlarda kalsiyum görüntüleme çalışmaları bu göstergeler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, içinde Chronis ve ark., açıklanan koku çip gibi yakalama aygıtları kullanan en önceki çalışmaları olarak daha az yaygın erkek hem morfolojik ve yapısal olarak daha yaygın hermafrodit olarak kullanılmak üzere tasarlanan aygıt var birbirine benzemeyen. Adapte bir koku çip tasarlanmıştır ve genç yetişkin hayvanlar kullanarak erkek nöronal görüntülemede verimlilik artışı için fabrikasyon. Bir dönüş hayvanlar döndürmek için ve 2D görüntülemede ikili bir çift bireysel nöronlar ayrılması için izin vermek için bağlantı noktası yükleme solucan içine dahil oldu. Solucanlar propil mikrosıvısal aygıt içinde kontrollü bir akış önceki hermafrodit çalışmalarda açıklandığı gibi maruz kalır. Kalsiyum geçişler sonra açık kaynak yazılım ImageJ kullanarak analiz edilir. Burada açıklanan yordamı erkek tabanlı C. elegans artan miktarda için izin vermelidir çalışmalar seks özgü nöronal sinyal verme mekanizmaları bizim anlayış derinleştirilmesi, Imaging kalsiyum.
Introduction
Yuvarlak solucanlar C. elegans,-ebilmek var olmak deneysel olarak işlenmiş1gibi mikrosıvısal aygıtları tam kontrollü ortamlarda, artan erişim hayvanlar, neyin sağlar. Bu çalışmalar davranış deneyleri, kalsiyum görüntüleme çalışmaları veya hatta gösterimleri deneysel sonuçlar1,2,3,4daha kesin ölçümler sonucu belirli fenotipleri için dahil, 5,6. Havacilik hangi aracılığıyla detaylı deneyler reaktifler en az miktarda gerçekleştirirken çalıştırılabilir küçük ölçekli sıvı koşulları sağlamak. Yeni mikrosıvısal cihaz tasarımları sürekli üretim ve her kullanımı, sinirsel görüntülemede kullanılan aygıtları yakalamak doğal sinüsoidal hareketi C. elegans davranış deneyleri ve sinirsel görüntüleme çalışmaları için izin arenalar gelen değişir ve yüksek üretilen iş fenotipik analizde genetik4,5,6,7ekranlar için izin aygıtlara koku çalışmaları. Ana kalıp imalatı mikrosıvısal aygıt oluşturmak ucuzdur — efendi kullanılırlığı verilen — ve kullanımı kolay, bırakmak için hızlı veri üretimi ile yüksek-den geçerek çalışmalar. Fabrikasyon polimerler polydimethylsiloxane (PDMS) gibi kullanan aygıtların saat içinde yeni cihazlar yaratılması için izin verir.
Kalsiyum görüntüleme çalışmaları ifade hedef hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Turk) gerçek zamanlı8,9,10,11bu hücrelere sinirsel dinamikleri ölçmek için kullanın. C. elegans şeffaf doğası bu proteinler Canlı hayvanlarda floresan düzeyde kayıt sağlar. Geleneksel olarak, Turk yeşil flüoresan protein (GFP) üzerinde itimat-sensör GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), her ne kadar daha yeni çalışmalar daha iyi sinyal-gürültü oranı ve kırmızı kaymıştır uyarma profiller için izin vermek için bu sensörler adapte olması dayalı. GCaMP3 gelişimini, bu özellikleriyle proteinler çeşitli, GCaMP6s ve GCaMP6f gibi sensörler dahil olmak üzere (yavaş ve floresan kapalı-fiyatlar, sırasıyla hızlı), RFP-Calmodulin-M13 peptid (lebomm) yanı sıra, sahip olduğu kırmızı kaymıştır harekete geçirmek profil. Bu Turk C. elegans hücre özel gen organizatörü dizileri ile kombinasyonu ilgi, özellikle duyusal sinir hücreleri12,13,14,15 hücreleri hedef alabilirsiniz , 16.
Mikrosıvısal çalışmalarda C. elegans kullanım kolaylığı belirgin olsa da, hemen hemen tüm çalışmalar hünsa üzerinde odaklanmıştır. Erkekler sadece 0,01-0,02 için muhasebe rağmen vahşi türü nüfusunun %, çok değerli bulgular--dan onların karakterizasyonu çıkabilir. Hermafrodit sinir sisteminin fiziksel connectome tam on yıl17için eşlenen süre erkek connectome özellikle hayvan18kafa bölgesinde eksik, kalır. Kalsiyum görüntüleme erkeklerde kullanımı erkek sinir sistemi ve iki cinsiyetler arasında ortaya çıkan farklılıklar bir anlayış oluşturmak için yardımcı olacaktır. C. elegans Yetişkin erkekler daha küçük boyutu daha büyük hermoafroditler için tasarlanan geleneksel koku aygıt yükleme noktalarından etkili ve güvenilir yakalama engeller. Bu sorunu çözmek için Chronis koku çip19 değiştirilmiş bir versiyonu daha dar bir yükleme limanı ile alt kanal yüksekliği, geliştirilmiş ve ikili sol/sağ görselleştirme için izin (hangi hayvan döndürmek) solucan yükleme limanı, döner nöronal çiftleri. Bu tasarım izin verir: genç yetişkin erkekler (1 etkili bindirme, ikili eşleştirilmiş sinir hücreleri iki üye ve (3) erkek nöronlar sinirsel aktivite hassas görüntüleme görselleştirme için hayvan daha güvenilir (2) bir yönünü.
C. elegans erkek farklı hünsa daha için a değişiklik-in ascarosides (ascr) veya Yuvarlak solucanlar Feromonlar20,21,22,23 yanıt çalışmalar giderek, göstermek ,24. Bu nedenle, sinirsel dynamics ve temsilcilikleri erkek connectome içinde bir anlayış geliştirmek bile daha uygun oldu. Erkek C. elegans içeren 87 seks özgü nöronlar hermafrodit25,26' da yok içinde connectome olarak değiştirme-henüz belirlenmemiş yolları. Bu benzersiz sinirsel dinamikler resim edememek bizi daha iyi seks özel yanıt ve sinirsel ifadeleri anlamak izin verir.
Bu iletişim kuralı bir erkek adapte koku çip erkek C. elegans sinirsel görüntüleme için açıklar chemosensation. ASH, güvenilir bir şekilde 1 M gliserol için erkeklerde, önceki ile tutarlı hermaphroditic yanıt nosiseptif nöron27çalışmalar. Ascarosides maruz gerektiren test edilecek hayvanlar daha çok sayıda hayvan hayvan, değişken olan yanıt-e doğru çıkarmak. Erkek özel CEM nöronların yanıt daha önce Elektrofizyoloji ve çalışmalar, Imaging kalsiyum degisken ascaroside #323için yanıt vermek için gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cihaz imalat
Not: bkz: başvuru 1.
Not: silikon ana kalıpları fabrikasyon SU-8 fotorezist silikon ana 1 , 7 desenlendirme için standart photolithographic teknikleri kullanarak. Photomasks gofret desenlendirme için 25.000 dpi çözünürlükte basıldı. 19 bağlantı noktası yükleme, M. Zimmer (özel yazışmaları, 2016) elde edilen bir tasarım adapte solucan bir değişiklik ile tasarım erkek adapte aygıt özellikleri Chronis koku çip. Bir dönüş hayvanlar dönüşü kontrol için bulunur. Bağlantı noktası Kanal yükleme solucan genişliğini için 50 mikron daralmış. Tüm kanallar 32 mikron uzun boylu vardır. Silikon ana kalıp kullanıcı için kullanıma hazır olduğunda, kullanıcı sonraki takip edebilirsiniz, protokol 1 daha önce açıklandığı gibi.
- Mix PDMS temel ve kür Ajan ağırlık tarafından 10:1 oranında.
- Karıştırın iyice transfer Pipetler ile.
- Tüm görünür kabarcıklar kaldırılana kadar 1s için bir vakum desiccator karışımı degas. 5 mm kalınlığında (100 gr) kadar
- bir silikon kalıp yöneticisinde bir 150 mm çapında çanak üzerine karışımı dökün. Herhangi bir kabarcıklar veya karışıma ortaya konan toz kaldırmak için bir Pasteur pipet kullanın.
- İçin en az 3 h ya da bir gecede 65 ° C'de pişirin.
- PDMS neşter kullanarak kalıp uzak kesmek ve ayrı aygıtlar ayrı bir jilet kullanarak kesti.
- 1 mm dermal yumruk ile giriş ve çıkış delikleri yumruk.
- Sifonu dH ile delik 2 O, etanol ve parçacıklar yumruk kaldırmak için tekrar dH 2 O ile. Bir hava akışı darbe cihazda kuru.
- Temiz kanal taraf ve yapışkan bant, toz ve başarılı bağ için izin vermek için cihaz üzerinde kalan enkaz kaldırma cihazın üst kısmında.
- Plazma-bond cihazın bir No 1 kapak cam kanal tarafı aşağı,.
- Maruz kapak cam ve aygıt (kanal-tarafına kadar) 100 W 30 gibi uygun bağ için izin koşulları kullanarak hava plazma s veya 24 W 60 s.
Not: Ayarları bağ etkinliğini artırmak için ayarlanabilir. Plazma-bağ koşullar bağ etkinliğini artırmak çalışırken uygun temizlik olarak kritik değildir. Yeterince temizlenmiş bir aygıt, hatta ideal plazma koşullar altında bağ değil. - İle 5 için başparmak aşağı cam kanal yan aygıt ve basın üzerine ters çevir s.
- Maruz kapak cam ve aygıt (kanal-tarafına kadar) 100 W 30 gibi uygun bağ için izin koşulları kullanarak hava plazma s veya 24 W 60 s.
2. Arabellek hazırlık
- Dilute 1 x S Bazal (100 mM NaCl ve 0,05 M KPO 4, pH 6.0) steril 10 x stoktan.
- Tüm çözümleri arabellek için 1 M tetramisole hisse senedi 1 S Bazal x 1 mM son bir konsantrasyon için oranında seyreltin.
- Fluoresein için her iki ekleyin " akış denetimi " ve " tampon " rezervuarlar.
- Fluoresein 100-mg/mL stokunun 1 x S Bazal oluşturun.
- Hisse senedi için akış denetimi 1 µg/mL ve 0.1 µg/mL arabellek son konsantrasyonları sulandırmak.
- Uyaranlara oluşturmak.
- Son konsantrasyonu 1 m 1 X S Bazal seyreltik gliserol.
- Seyreltik ascaroside #3 (ascr 3) 1 µM son bir konsantrasyon 1 X S Bazal içine için.
3. Aygıt Kurulumu
Not: bkz: 1.
şekil 1. Mikrosıvısal aygıt ayarları. (A) rezervuar ve boru. 30 mL şırınga olmadan bir dalgıç olarak hizmet veren " rezervuar. " bu üç akış seçenekleri ile bir radarı Vana bağlı olduğu. Diğer mikrosıvısal cihaza baðlanýr tüp takılı olduğundan bir iğne (turuncu) için bağlı olduğu sırada bir çıkış pompası, 3 mL şırınga bağlıdır. (B) genel deneme Imaging mikrosıvısal kuruluşu. Cihazın objektif lensler üzerinde bir ters epifluorescence mikroskop bir sahnede yer alıyor. " Akış denetimi " arabellek seyahatleri ile belgili tanımlık tertibat üstünde rafta bir birimi tarafından kontrol edilir bir 3-yollu vana. Arabellek içeren satırların sonra uygun aygıt bağlantı noktaları eklenir. (C) mikrosıvısal aygıtının bağlantı noktalarını. " Akış denetimi " bağlantı noktaları diğer giriş bağlantı noktalarını yan: " uyarıcı " ve " tampon " bağlantı noktaları. " Çıkış " en sağdaki port limanıdır. Solucan yükleme arena, konumu nedeniyle " yükleme solucan " Merkez-çoğu bağlantı noktası aygıt üzerindeki bağlantı noktasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- hazırla üç sıvı su depoları. İğne mikrosıvısal aygıta uzanan boru bağlanmak ( şekil 1A olduğu gibi -B).
- Hava kabarcıkları rezervuar ve boru çıkarın.
- 1 S Bazal x ile ekli boru ile 3 mL şırıngaya doldur ve prize takın limanda
- Arabellek giriş delikleri üst kısmında görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.
- Akış denetimi, arabellek ve uyarıcı boru uygun giriş delik bağlantısı ( şekil 1B olduğu gibi -C), her iki yükleme noktasındaki sıvı damla mevcut sağlama delik ve bağlanmak tampon tüp.
- Yine yavaşça damlacıkları bağlantı noktası giriş yükleme solucan görününceye kadar çıkış bağlantı noktasına bağlıysa şırınga basınç uygulamak.
- Limanda yükleme solucan içine sağlam bir engelleme çiviyi yerleştirmeden
- Şırınga çıkış bağlantı noktasından çıkarın ve ev vakum (-670 Torr) bağlı çıkış satırına ekleyebilir.
- Kontrol aygıtı akışında herhangi bir kabarcık açısından kanalları, görsel ve fotoğraf makinesi ile uyumlu bir yazılım yoluyla video onay aracılığıyla, kullanılan açık kaynak yazılım Mikro-yemlik gibi. Adım 6 mikro-Yöneticisi'ni kullanma hakkında ipuçları için bkz:.
- Herhangi bir kabarcıklar varsa beklemek onları çıkarmak veya PDMS absorbe duvar herhangi bir hayvan önce yükleme; kabarcıklar varlığı sıvıların uygun akış aygıtı aracılığıyla rahatsız edemeyecek.
- GFP filtreyi kullanarak onaylamak uygun akış dinamiği içinde belgili tanımlık aygıt yükleme 3-yollu vana aktüatör ve arabellek geçiş gözlemleyerek solucan önce.
- Belirleme uygun akış dinamikleri: akış denetimi ve tampon çözümlerinde mevcut floresein gözlemlemek ( şekil 2B -2E) denetim basarak akış denetimi değeri değiştiğinde değiştirme 3-yollu vana Vana bağlantısını ( şekil 1B) karşılık gelen düğmeyi.
- Mikro-Yöneticisi'ni açtıktan sonra tıklayın " Live " cihazın canlı bir görüntü gözlemlemek için. Cihazın arabellekleri akışını Floresan ışık kaynağı açın ( şekil 2B -2E).
Resim 2: Bir erkek adapte mikrosıvısal koku çip. (A) akışını desenleri solucan maruz kaldığında cihazın tampon. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. Bağlantı noktası yükleme solucan solucan yönlendirme daha iyi kontrol için sağlar bir eğri eklemek için uyarlanmıştır. (B) akışını desenleri solucan için uyarıcı maruz kaldığında cihazın. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. (C) ölçümleri fabrikasyon olarak adapte cihazın. Bağlantı noktası yükleme solucan, erkek genişliği için tasarlanmış bir 50 µm kanal açılarak bir 42 µm biter. Ölçülen Kanallar tasarımı 25 µm hedef rağmen 32 µm yüksekliğidir. (D-E) A tuzak erkek ifade p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 organizatörü kül özgü değildir ve hiçbir kalsiyum geçişler ASI tespit edildi, ancak bazı ifade ASI nöron gözlenen. (E) sadece floresan ise (D) alan parlak ve floresan aydınlatma, bir arada görüntüdür. Ölçek çubukları 42 µm. (F) ASH nöron tepki 1 M gliserol stimülasyon ile sağlam sinirsel aktivite gösterir. Mavi alanı 1 M gliserol uyarıcı zamanı gösterir. Gölgeli bölge n ile standart hatasını gösterir yedi solucanlar dan 20 bakliyat =. Kırmızı izler depolarize yanıt-e doğru göstermek. Axes ΔF/F 0 göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
4. hayvan hazırlık
Not: bkz: başvuru 23.
- 1 M gliserol yanıtlarını görüntüleme kül.
P sra-6 için olumlu
- yer yaklaşık 20 C. elegans erkek:: GCaMP3 dizi ifade nematodunun büyüme orta (NGM) agar plaka üzerine numaralı seribaşı OP50 E. coli çim ile. Floresan GECI ifade ve/veya bir ortak enjeksiyon marker dizi pozitif hayvanların tanımlanması için kullanın.
Not: Dizi olumlu hayvanlar kullanılan GECI göre belli (Yani, hayvanlar GCaMP ifade bulabilsem yeşil mavi ışık stimülasyon altında lebomm hayvanlar kırmızı yeşil ışık stimülasyon altında belli iken). Ortak enjeksiyon işaretçileri GFP ve RFP, gibi floresan diğer proteinler gibi rol-6, fenotipik işaretleri alanı kullanılabilir veya pha-1 mutasyon 28 gibi baskın bir fenotip kurtarabilirsiniz.- Eğer hemen tahlil önce çekme genç yetişkin erkekler toplama
- . Gün önce tahlil, L4 larva erkekler cevap.
- yer yaklaşık 20 C. elegans erkek:: GCaMP3 dizi ifade nematodunun büyüme orta (NGM) agar plaka üzerine numaralı seribaşı OP50 E. coli çim ile. Floresan GECI ifade ve/veya bir ortak enjeksiyon marker dizi pozitif hayvanların tanımlanması için kullanın.
- 1 µM ascr 3 CEM yanıtlarını görüntüleme.
- Çekme yaklaşık 20 L4 C. elegans erkekler (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); onu-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dsRed ortak enjeksiyon marker ifade için olumlu.
Not: dsRed ray nöronlar içinde erkek masalı gözlemlemek ve GCaMP ifade dört CEM nöronlar içinde daha onaylamak daha kolay ifadesidir. - İzole hünsa görüntüleme deneme yapmadan önce bir çim OP50 E. coli için 5-14 h seribaşı NGM agar tabakta gelen bu erkek.
Not: en az 5 h için izole değil erkek davranışsal ascr 3 yanıt vermeyen ve bu nedenle ascaroside için burada görülmektedir daha bile az kalsiyum geçişler sergileyebilirler.
- Çekme yaklaşık 20 L4 C. elegans erkekler (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); onu-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dsRed ortak enjeksiyon marker ifade için olumlu.
5. Hayvan yükleme
Not: bkz: refefence 1.
- Standart solucan bakım teknikleri kullanarak bir seribaşı NGM agar plaka üzerine bir solucan seçin.
- Çekme solucanlar bakteri çekme üzerine toplama (düzleştirilmiş Platin tel yapılmış) bir çekme, alev ve " dabbing " almak için bir solucan. Yavaşça solucan kapalı, kendi tarama izin yeni plaka üzerine yerleştirin.
- Plaka sular altında olacak yaklaşık 5 mL 1 x S Bazal seribaşı plakasına eklemek.
- 1 x S Bazal ile önceden doldurulmuş oldu bir yükleme şırınga (Yani, 3 mL şırınga ile ekli boru) içine belgili tanımlık kurt çizin.
- Solucan değil sonuna kadar içine şırınga, sadece tüp içine emmek için emin olun.
Not: solucan şırınga geçerse, yakın olduğunu onu geri içine tüp imkansız.
- Solucan değil sonuna kadar içine şırınga, sadece tüp içine emmek için emin olun.
- Çıkış radarı kapak kapatarak akışını durdurmak için vakum kapatmak.
- Sağlam iğneyi limanda yükleme solucan engelleme kaldırma
- Açmak böylece bu havalandırma ( şekil 1B) çıkış bağlantı noktasına bağlı radarı Vana.
Not: bir canlı video solucan yüklenirken konumunu ve yönünü hayvan (Adım 5.8-5.13) onaylamak için kullanın. - Limanda yükleme solucan tüpüne yükleme solucan Ekle
- Solucan yükleme kanalda görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.
- Solucan kuyruk-ilk kanal başlanır, solucan kanal girmesini önlemek için şırınga pistonu üzerinde çekin.
- Uygulama ve baş kanal ilk girene kadar basınç ters arasındaki geçiş.
- 3'lü radarı kapak kapatarak vakum atmosfer yerine vakum açmak için çıkış noktasına bağlı açık.
- El ile yönlendirmek ve arabellek akışı kanal, ama henüz maruz öyle ki solucan kafa yerleştirmek için şırınga dalgıç tarafından iç karartıcı baş serbestçe taşıyabilirsiniz basınç uygulayın ( Şekil 2 D-2E).
6. Uyarıcı ve satın alma
- bir açık kaynak mikroskobu yazılımını kullanarak, mikro-Yöneticisi gibi tarafından esir alma imge: 10 kare/s Mavi ışıklı uyarma kullanarak TIFF yığını olarak kaydetmek (470 nm) 30 s.
- Açık 100 Bayan için ana menüsünde pozu ayarlamak " çok D alma. " yazılım ana menüden. Ayarla " numarası " için " 300, " ve " Aralık " için " 0. "'ı tıklatın " edinme! " video kazanmaları.
- Uygula 10 s nabzı satın alma başlatılıyor sonra uyarıcı 5 s. İstediğiniz gibi uyarıcı uygulama süresi ayarlamak.
- 5 edinme sonra s video, değiştirme uyarıcı test edilen hayvan uygulamak için akış denetimi arabellek kontrol 3-yollu vana. Vana bağlantı ( şekil 1B) en sol düğmesini.
- Sonra 10 s uyarana maruz kalma (Bu sefer ayarlanabilir kullanıcı tarafından istediğiniz gibi), yine Vana linke en soldaki düğmeye basarak akışı arabellekleri alter.
- Kayıt sadece 30-s pencere temele dönmek GECI Floresans izin vermek için tamamlanana kadar tampon altında.
- İstediğiniz şekilde yineleyin. Bekle 30 s edinme sonu ve sonraki deneme inisiyasyon arasında.
7. Görüntü analizi
- dosya ImageJ penceresine sürükleyerek açık kaynak yazılım ile ImageJ, TIFF yığın açın.
- İmleç kullanarak tıklatın ve faiz (ROI) faiz nöron çevresinde bölge ayarlamak için sürükleyin. Faiz (olduğu gibi şekil 3A) nöron soma içerecek şekilde bölgesi ayarlayın.
- Aç'ı tıklatarak yığınları arasında yatırım Getirisi floresan yoğunluğu z yığını arsa-> görüntü - > yığınları - > z ekseni profil çiz.
- Tıklama " listesi " açılır penceresinde. Düzenle-'yi > değerleri kopyalamak için Kopyala. Değerleri Yapıştır bir elektronik tablo programına.
- GCaMP ifade içermeyen solucan bir bölgeye yatırım Getirisi sürükleyerek her darbe için arka plan Floresans analiz.
- Arka plan Floresans nöron floresan yoğunluğu değerinden çıkararak her darbe için arka plan çıkarma gerçekleştirmek.
- ΔF/F 0 her darbe her çerçeve için hesaplamak.
- Olarak yatırım Getirisi için ilk 1 ortalama yoğunluk değerini hesaplamak F 0 s satın alma (Örneğin, çerçeve 1-10).
- ΔF/F 0 faiz çerçeve arka plan düşülen değeri hesaplanan F 0 değerine göre bölerek hesaplamak.
- Görüntüsü her nöron ve her uyarıcı darbe için yineleyin.
- Nöronlar ile tutarlı yanıt profilleri, ASH gibi tüm darbeleri her neuron için ortalama ve SEM (olduğu gibi şekil 2F) hesaplamak için.
- Her neuron için zaman içinde SEM ile ortalama ΔF/F 0 arsa.
Not: Bu durumda, bu heatmaps her deneme de bireysel nöronal tepkilerin dahil etmek yaygın uygulamadır. Kalsiyum geçişler tekrarlanan elektrodlar arasında uyarıcılara maruz üzerine tutarlı değişiklikler sergi değil nöronlar, veya farklı kişiler 23, bireysel darbe izlemeler (olarak göstermek için daha uygun olabilir şekil 4). Ayrıntılar için tartışma verilerin nasıl görüntüleneceğini belirleme bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel aygıt kurulum örneği şekil 1A-Bgörülebilir. Şekil 1A uygun rezervuar inşaat ve kurulum gösteriyor. Şekil 1B mikrosıvısal aygıt depolar bağlantılarını gösterir. Şekil 1 c ile netlik için etiketli bağlantı noktalarını ayrı ayrı bir mikrosıvısal aygıtı gösteriyor.
Yükleme limanı eğrideki erkek adapte mikrosıvısal aygıt tasarımını içerir, ancak akış dynamics Chronis tarafından tasarlanmış alet aynı ve ark.19(şekil 2A-2 C). Akış Arabellek hangi akış kontrol vanası açık değiştirerek kontrol edilebilir (şekil 2A-2B). Fabrikasyon olarak ölçümleri tasarlanmış dosyasından değişir. Şekil 2C içinde sağlanan ölçümleri "gibi uydurma" ölçüleri vardır.
Erkek adapte koku aygıt, onların yerleşim ve yönlendirme yanı sıra kanal akış dinamikleri erkek C. elegans yükledikten sonra alan parlak ve floresan görüntüleme ile doğrulanabilir (şekil 2B-2E). Nosiseptif nöron, ASH, 1 M gliserol için GCaMP3 ifade solucanlar pozlama Floresans kül nöron, sinir aktivitesinin (şekil 2F) gösterge içinde görünür değişiklikleri sonuçlanır. Floresans ince değişiklikleri gözle görünür olmayabilir, ama yazılım bu değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Ücretsiz ImageJ yazılım analiz ve kül nöronlar 1 M gliserol maruz üzerine floresan yoğunluğu zaman içinde (şekil 2F) ölçmek için kullanılabilir. Bu hünsa27 ' deki ve gliserol kül nöronal cevaben sağlamlığı nedeniyle gözlenen için benzer, bu test tüm hayvanlarda görülmektedir.
Aksiyel veya dönme hareketi az miktarda kez video analiz (şekil 3A) sırasında bir nöron izleme algoritma gerektiren unparalyzed hayvanlarda bekleniyor. Bazı hayvanlar (~ %10) hala denemeler sırasında hareket olsa da (Örneğin, 1 mM tetramisole) arabelleklerindeki bulduğumuz eklenmesi bu etki neredeyse ortadan kaldırır. Bu tarafından atlatılabilmişlerdir: (a) kullanarak daha verimli bir şekilde sıkışıp kalırlar; büyük erkekler (b) genişlik veya bağlantı noktası daha da yükleme solucan kalınlığı azaltmak; veya (c) de kullanılan paralitik veya başka bir felç kullanarak konsantrasyonu artan. Bu da orada değil çok fazla kafa tuzak sonu geçmiş ve koku kanal maruz sağlayacaktır. Bir deneme solucan hareketi ile ortaya çıkarsa, alan analiz taşındı ve sonra hareketi (şekil 3B) oluştuğu çerçeve başlayan yeni nöronal konumundan yeniden okumak. Sinirsel izlemeler kullanıcı tarafından el ile yeniden inşası bu örnekte gerekir. Bu nöron içindeki floresan değişikliklerini çözümlemek ve19da yazılabilir hareket ederken nöron'ın merkezi takip komut dosyaları.
Erkek C. elegans çekici biyojenik Feromonlar dört seks özel CEM nöronlar23üzerinden ascarosides denilen hissediyorum. Kalsiyum geçişler erkeklerde gözlendiğinde, şekli, işaret ve büyüklüğü nöronlar ve hayvanlar (şekil 4A-B) arasında değişken yanıtlardır. Ancak, Feromonlar erkek yanıt olarak güvenilir birçok hayvan (şekil 4 c) kalsiyum geçişler olarak görülmektedir değil. Çoğu ascarosides kalsiyum geçişler hissi13,14,15üzerine temin değil gibi bu cesaret kırıcı, değil.
Şekil 3: adresleme solucan hareketi sırasında görüntü edinme dönemi. (A)ΔF/F0 (floresan yoğunluğu ortalama arka plan floresan yoğunluğu için ilk 1 bölü değiştirmek s Alım) nerede faiz nöron 1 için güvenilir bir şekilde statik bir alanı tanımlayarak ImageJ kullanarak hesaplanan s. (Mavi alanı), uyarıcı darbe sırasında hayvan taşındı, kalsiyum izleme yukarıdaki resimlerde görüldüğü gibi artık analiz alanı (sarı kutu) içinde bulunan nöron sonuçlanan. Ölçek çubukları 42 µm. kesik çizgiler Haritayı her görüntüde solucan konumuna karşılık gelen izleme bölgesi belirtmek. (Alan analiz nöron duruşma sırasında takip etmek taşıdıysanız ve bireysel izleri gerçek sinirsel dynamics iletmek için yeniden oluşturulurB), izleme hayvan kımıldamadı gibi görünür. Kesik çizgiler solucan hareket için düzeltilen izleme bölgesi göster. Hem kül nöronlar, sol ve sağ için izlemleri (yakın (kırmızı) ve ASHR (mavi), sırasıyla) gösterilir. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Erkek C. elegans CEM 1 mikron ascr 3 yanıttır değişken. Erkek özel CEM nöronlar biyojenik Feromonlar için yanıtının benzersiz desenler görüntüler. (A)her CEM nöron bir darbe için bir duyarlı hayvan gözlenen yanıt gösterilir. Dört CEM nöronlar vardır: dorsal sağ (CEM DR), dorsal sol (CEM DL), ventral sağ (CEM VR) ve ventral sol (CEM VL). Üç dört nöronların ile değişen şekli ve büyüklüğü, depolarizations dördüncü ascaroside için yanıt vermiyor ile yanıt. (B) yaklaşık 1 / 3 (2/7 Bu çalışmada test) kapana kısılmış hayvan sonuç sadece üç nöronlar yansıması mümkün. Bir solucan bu yönde tepkiler ilk solucan gözlenen farklı CEM kalsiyum geçişler sonuçlandı. CEM DR hem yönelimleri görünür ve hayvanlar arasında değişken yanıt sergileyen bu solucan yönünü değişikliği nedeniyle değildi. (C) birçok solucan yok (5/7 test bu çalışmada) herhangi bir tespit kalsiyum geçişler ile yanıtla. Gösterilen bireysel temsilcisi görüntüleri araziler yukarıda gösterilen tek hayvanların izleri. ,ölçek çubukları göstermek 42 µm. izlemeler: 1 mikron ascr 3 pozlama zaman mavi alanı gösterir. Kırmızı izler depolarizing tepki gösterir. Siyah izleri gözlenen yanıt göstermek. Axes ΔF/F0göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Erkek adapte koku çip bir dönüş yönünün daha fazla denetim ve erkek C. elegansverimli yakalama sağlar daha dar bir yükleme limanı içine içermektedir. Bu z-istifleme için gerek kalmadan nöronal ikili çift sol ve sağ üyeleri görselleştirme sağlar. Bu eğri bir solucan zamanında yönünü dikey %100 uzak nerede sadece bir ikili çift kül (şekil 2B-E)29,30gibi floresan bir marker ile hedef yol açar. Ancak, nöronal sınıfları gibi CEM, dört Radyal simetrik nöronlar ile tüm dört nöronlar görünür zaman sadece üçte biri. Başka bir üçüncü test solucan var sadece üç dört nöronların görünür ve üçüncü kalan için sadece ayırt fark değil-sol asimetri (veri gösterilmez) dorsal ve ventral hücre organları arasında. Dar bağlantı noktası solucan dalgalanma z ekseni önlemek için daha düşük bir kanal yüksekliği ile birleştirilmiştir. Bu tasarım erkek görüntüleme için gelecekte sağlar çalışmaları, hangi, erkek connectome25,31sürekli artan bilgi ile birleştirildiğinde, daha iyi seks özel sinirsel işlevini anlamak için izin verir.
Floresans nöron ilgi içinde değişiklikleri ölçmek için ücretsiz yazılım ImageJ bu protokol için gerçekleştirilen çözümlemesini kullanır. Geçerli tasarım ile 1 mM tetramisole arabellek etkili solucanlar felç ediyor ve hareket görüntüsü nöronların engeller. Hareket önlenebilir değildir veya kullanıcı bulduğumuz kullanımı istemiyorsa, daha karmaşık izleme komut dosyaları7taşırken bu nöronlar izlemek yazılmalıdır. Etkili bir şekilde yükleme limanı ve gliserol gibi son derece caydırıcı bir uyarıcı görüntülendiğinde kısıtlı için çok küçük olduklarını ancak, bu protokol için erkek solucanlar sadece gitmenizi sağlar. Bu durumlarda bile, hareketin kısa ve izleme ayarlar büyük miktarda gerektirmez — bir yatırım Getirisi yeni nöron konumu ayarlama yanlış floresan dökümanları (Şekil 2) azaltır.
Bir tek-solucan, tuzak tabanlı görüntüleme saat1' de tek bir solucan yansıması kısıtlamasıdır. Başka bir bu tuzakları solucanlar cihaz içindeki sıkışmış almak kısıtlamasıdır tıkanmış için aygıtları ve "kadar kullanılan" sadece birkaç solucan görüntüleme sonra neden. Ancak, yeni aygıtları ana kalıp imalatı için hızlı gerçekleştirme süresi bu zararı azaltır. C. elegans32,33duyarlilik ikna etmek için genişletilmiş mavi ışık aydınlatma da gösterilmiştir. Bu iletişim kuralı görece kısa deneysel zaman dilimi (30 s) ölçülebilir photobleaching olmadan görüntüleme sağlar. Ancak, photobleaching ve daha uzun deneylerde duyarlilik önlemek için ışık kaynağının pulsed7olabilir. Örneğin, her 100 ms pozlama sırasında ışık 10 Bayan bu artan vücut autofluorescence saat7üzerinde ortadan kaldırmak için gösterilmiştir için Geniş puls.
Düzgün erkekler için ascarosides yanıtlarını sınamak için larva sahne 4 (L4) erkek ilk hünsa, en az 5 h için gelen Feromonlar23saf yakınındaki yanıt elde etmek için izole gerekir. Bu süre boyunca daha az yalıtım hayvanlar için ascarosides yanıt vermek başarısız olmasına neden olabilir. Ancak bu yalıtım gliserol gibi sigara ascaroside yardımlar sınarken gerekli değildir. Ancak, tutarlılık uğruna, hayvanlar her zaman kalsiyum görüntüleme için izole en az 5 s önceden vardı. CEM gibi bazı nöronların her stimülasyon nöronal yanıt temin ve yanıt her CEM öyle bir belirli "sinirsel gösterimi kod" oluşturmak için yapar. CEM bu fenomen Elektrofizyoloji çalışmaları, yanı sıra kalsiyum olanlar burada23açıklandığı gibi çalışmalar Imaging ile gözlenmiştir. Böylece, her ascaroside maruz hayvan nöronlarda CEM ölçülebilir kalsiyum geçişler23garanti edilmez. Aslında, birçok tarihi için soruşturma ascarosides ölçülebilir kalsiyum geçişler13,15,34,35temin değil. Ölçülebilir geçişler başarılı yaşla feromon iki faiz (şekil 3) ascaroside için maruz beş hayvanların üç darbeleri yalnızca biri sırasında gözlendi. Bu daha önce diğer labs23' gözlenen başarı oranı ile eşleşir. Bu değişkenliği feromon yanıt okurken bir kısıtlamadır ve bu iletişim kuralı erkek tabanlı odak nedeniyle değil.
Ascarosides yanıt olarak elde edildi kalsiyum geçişler soruşturma zaman, bir daha da soruşturma olmadan tutarlı yanıt alınamaması göz ardı değil. Bu nöronal bir sınıf içinde değişken yanıt onaylamak için Elektrofizyoloji çalışmalar gibi deneyler yoluyla test edilebilir. ASH gibi nöronlar için bu güvenilir, tutarlı yanıt alınamaması hataları uyarıcı kontrolü gibi daha büyük deneysel sorunların göstergesi olabilir yanıt. Değişkenlik yanıtta beklenen yanıt-e doğru tepe yoğunluğunu da araştırılması. İzleri standart sapma veya standart hata (olduğu gibi şekil 2F) ile çizilebilir. Standart sapma küçükse, izlerini çizilen ve bu nedenle analiz. Orta standart sapmalar lider değişimi fark tutarı ise, veri olabilir Cevabıyla yanıt yanıt değişim göstermek için "tip" göre heatmaps eşlik eden ile aynı çizilen. Önemli değişim (şekil 3), neyin doruklarına cant dağıtılacak Gauss bir şekilde, eğer yanıt-e doğru yanıt "türleri" (Örneğin, kutuplarını, hyperpolarizing veya sigara polarize) kategorize edilebilir23. Belirli bir "türü" düşmek yanıt çizilen ve birlikte analiz. Benzer şekilde, heatmaps de bu analiz eşlik etmeli.
İleride, bu aygıt yükleme limanı daha da daraltarak larva sahnelenen nematodlar görüntüleme için izin vermek için adapte edilebilir. Daha fazla yükleme limanı sonuna daralma hayvan kısıtlaması için sadece kirpikler duyusal nöron hücre gövdesi aksine görüntüleme için izin vermek için izin verir. Diğer cihazlar daha yaygın olarak okudu hermafrodit için tasarlanmıştır, bu adapte koku çip erkek sinir devreleri sinirsel aktivite görüntüleme sağlar. Erkek connectome hala aydınlatılmamıştır, seks özel ağlar neural dynamics ölçmek için güçlü olmak tamamen nöronal sinyal anlamak için önemlidir. Hermaphroditic ve erkek yanıt arasındaki farklar şimdi test edilebilir ve bu aygıtı kullanarak ölçülen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Manuel Zimmer erkekler ile kullanmak için adapte oldu ilk tasarım dosya ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum; Frank Schroeder sentezi ve ascr 3 temini için; Ross Lagoy için fikir ve görüntüleme ve çözümleme ile ilgili yardım için; ve bu el yazması gözden geçirme için ana imalat ve kim, Laura Aurilio Christopher Chute, yanında bulunmuştur. Ulusal Sağlık Enstitüleri grant 1R01DC016058-01 (js), Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET 1605679 (D.R.A.) ve Burroughs Wellcome kariyer Ödülü, bilimsel arabirimi (D.R.A.) altında bu iş için fon sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Developer | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art Services | - | Custom order. Printed at 25,000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 1.0 mm Dermal Punches | Acuderm Inc. | P150 | |
| Soft Tubing | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Hard Tubing | IDEX Health & Science | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Blocking Pins | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| 3 mL syringes | BD | 309657 | |
| 30 mL syringes | Vitality Medical | 302832 | Used as buffer reservoirs. |
| Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Mercator Control System LF-5 Plasma System | Mercator | LF-5 | |
| Scotch Tape | Scotch | BSN43575 | |
| Series 20 Chamber | Warner Instruments | P-2 | |
| Vacuum Desicator | Bel-Art Scienceware | 420250000 | 24 cm inner diameter. |
| Weigh Boats | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S/FACT | |
| Glass Pasteur Pipettes | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Transfer pipettes | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Oven | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Model Number: 1500E. |
| 60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss | - | |
| Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Blue Fluorescent Light | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Illumination Adaptor | Zeiss | 423302-0000 | |
| Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve | Parker | 001-0017-900 | 3-way valve for controlling flow. |
| ValveLink8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Flow Switch Controller |
| Micro Manager | Micro-Manager | - | Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release |
| ImageJ | ImageJ | - | Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Agar, Bacteriological Grade | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Store at 4 °C. |
| Fluorescein | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Light Sensitive. Store in photoprotective vials. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | - | Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University). |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library. |
| CEM GCaMP6 line | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle. |
References
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
- Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
- Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
- Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
- Tatro, E. T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
- Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
- McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
- Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
- White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
- Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
- Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
- Ludewig, A. H., Schroeder, F. C.
- Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
- Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
- Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
- Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
- Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
- Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
- Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
- Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
- Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).
