Summary
Biz toplama misfolded proteinlerin ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim protocol detayları lentiviral istikrarlı hücre satırı üretimi, otomatik confocal görüntüleme ve görüntü analizi protein toplamları indüklenen. Açıklayıcı bir uygulama olarak SOD1 toplama bir saat ve doz bağımlı şekilde teşvik küçük moleküller etkisini okudu.
Abstract
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) gen kodlama bakır-çinko süperoksit dismutaz 1 (SOD1) devralınan mutasyonlar neden ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. SOD1 yapısal istikrarsızlık ve ailesel ALS hastalarında SOD1 pozitif kapanımlar tespiti ALS patoloji misfolded ve/veya toplanan SOD1 için potansiyel bir nedensel rolü destekler. Bu çalışmada, canlı hücreler toplamada SOD1 dinamikleri ölçmek için yaklaşımlar eleme yüksek içerik tarafından tasarlanmış bir hücre tabanlı tahlil gelişimini açıklar. Lentiviral vektörler kullanarak, biz vahşi tipi ve mutant A4V sarı floresan protein ile öğesini ve her iki proteinler sitozol toplama belirtisi olmadan ifade edildi bulundu SOD1 ifade istikrarlı hücre satırları oluşturulur. İlginçtir, sadece SOD1 A4V stabil HEK-293 ile ifade ancak U2OS veya SH-SY5Y hücre hatlarında proteasome inhibitörü tedavisi üzerine toplamları biçimi değil. Çeşitli proteasome inhibitörleri doz-yanıt analize göre toplama ölçmek ve toplama-oluşumu Kinetik tarafından hızlandırılmış mikroskobu izlemek mümkün olduğunu göstereceğiz. Yaklaşımımız ALS mutasyonlar rolünü SOD1 toplama oluşumunda etkisi miktarının yanı sıra SOD1 A4V toplama önlemek küçük moleküller için tarama olanağı sunar.
Introduction
Protein toplama biyolojik bir işlem tarafından hangi kadar proteinler grup misfolded ve nörodejeneratif hastalıklarda (Amiloidoz) etken ajanı olarak hareket edebilir olur. Protein toplama karakterize patoloji başlangıcı etkileyen yeni faktörler keşfi kolaylaştırılması olduğu gibi hücresel disfonksiyon de toplamları rolünün anlaşılması önemlidir. Floresans öğesini proteinler canlı hücreler arasında görselleştirme deneyleri (HCS)1,2,3,4eleme yüksek içeriğe uygun geliştirilmesine yardımcı olabilir güçlü bir yöntemdir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS) toplamak ve ailesel ALS (fALS) ve sporadik ALS (sALS)5,6 motor nöronlarda birikir eğilimi ile misfolded proteinlerin kaynaklanan bir proteopathic hastalık olarak kabul edilir . Bir alt fALS olguların % 20 ~ ilişkili baskın mutasyonlar gen sitozolik antioksidan enzim kodlama ile bakır-çinko süperoksit dismutaz yazın 1 (SOD1)7,8. Bu genetik olarak türetilmiş disfonksiyon için birkaç olası nedeni, yapısı ve SOD1 türevleri, anormal istikrar, artmış unfolding hızı ve toplam9eğilimi gibi fonksiyon değişiklikleri de dahil olmak üzere önerilmiştir, 10. Özellikle tek doğrulanmış ve potansiyel olarak toksik özelliği her iki SOD1 ALS bağlantılı türevleri tarafından paylaşılan ve vahşi-tipi (WT) SOD1 bölümlere protein toplamları veya proteinaceous kapanımlar11,12 oluşturmak için artan bir eğilimi olduğunu . Misfolded mutant SOD1, ısrarla polyubiquitinated olduğunu ve ubiquitin-proteasome sistemi tarafından bozulmuş. Proteasome aktivitesinin inhibisyonu düşük düzeyde SOD113,14hangi formu amorf çözünür mutant SOD1 ile alışverişi yapabilirsiniz çözünür bileşenler yapılarından, agrega mutant birikimi sonucu olarak, yol açar sitozol15' te. Özellikle, SOD1 mutant A4V içinde (alanin kodon 4, Valin için değişti) en yaygın ALS neden mutasyon ve hızlı ateş hastalığı başlangıcı16sonra daha az 2 yıllık bir ortalama yaşam süresi ile yol açar. Biyokimyasal olarak, SOD1 A4V monomerize, toplamak ve amiloid gözenekleri oluşturmak için artan bir eğilim vardır; onun gözenek benzeri toplamları diğer hastalık bağlı mutant gibi form α-synuclein ve β-amiloid protein17amiloid gözeneklerin benzer. SOD1-agrega birikim dinamiklerini incelemek için geliştirilecek çözünür ve çözünmez SOD1 toplama formları izlemek için yöntem kalır.
Biz daha önce canlı hücre Imaging'i kullanma göstermiştir ve HEK-293 hücreleri geçici ALS ilişkili mutasyonlar SOD1 dimerization ve toplama11zarar floresan protein etiketli SOD1 ile transfected. Her ne kadar geçici ifade sistemleri kısa vadeli gen overexpression biyolojik sonucu hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir, istenen genlerin istikrarlı entegrasyon sağlayan yöntemleri tahlil geliştirme için tercih edilebilir. Bu nedenle, lentiviral vektörler uzun vadeli ve düzenlenmiş gen ekspresyonu memeli hücreleri 18tarihinde bir görüşme olanağı sunuyoruz. Bu çalışmada rekombinant lentivirus WT taşıyan transduced istikrarlı hücre hatları nesil üzerinde duruldu ve mutant SOD1 sarı floresan protein (YFP) ile Etiketlenmiş. Canlı hücre görüntüleme mikroskobu ve SOD1 toplama otomatik miktar kullanarak, biz tetiklenir ve SOD1 toplama olayları üzerine proteasome inhibisyonu sayılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lentivirus üretim
Not: üretim ve işleme lentiviral vektörlerin gerçekleştirildiği rekombinant içeren araştırma için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) esaslarına göre DNA'SI. Gelişmiş YFP (SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP) ile A4V mutant SOD1 ve vahşi-türü öğesini plazmid kodlama Kim ark içinde açıklanmıştır. 11 PCR astar çifti 5 kullanarak her iki gen füzyon ürün güçlendirilmiş ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ ve 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ ve pTRIP-delta U3 CMV eklenmiş Plazmid 19 XhoI ve BsrGI kısıtlama siteleri kullanarak. Önceki deneyler, iki günde 1:4 1:6 oranında HEK-293T hücreleri ayrılmış. 20'den fazla geçit ve bakım hücre iyi transfection verimliliği sağlamak için daha az % 60 confluency yardımcı olur, kaçınma.
- Gün hücre kültür orta (%10 FBS ve 4 mM L-glutamin ile yüksek glikoz DMEM) virüs üretim için 10 ml % 30-40 izdiham bir 10 cm çapında doku kültürü plaka (3 x 10 6 hücreler/çanak), HEK-293T hücreleri bölme 1 tarihinde,.
- 10 cm çapında doku kültürü plaka (37 ° C, % 5 CO 2) bir CO 2 kuluçka makinesine gecede devam.
- On gün 2, 10 µg lentiviral vektörlerin içeren bir DNA transfection çözüm hazırlamak (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP ya da - SOD1A4V-YFP) lentiviral ile birlikte ambalaj plazmid (5 µg pVSVg; pCMV-dR8.71 10 µg) () şekil 2A) 20. 1 M CaCl 2 125 µL ekleyebilir ve 500 µL distile su kullanarak birime ayarlayabilirsiniz. Yavaşça 0,05 M HEPES 500 µL karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Değiştir HEK-293T 1 mL DNA transfection solüsyon ile karışık orta 10 mL Önceden ısıtılmış taze kültür orta ile antibiyotik içermeyen hücreleri ve gecede 37 ° C, % 5 CO 2 kuluçkaya.
- 3 günde, hücrenin süpernatant ile taze kültür orta yerine.
- Gün 4, üzerinde 15 mL tüp ve ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için 500 x g de 5 dk santrifüj süpernatant hasat. Daha fazla süpernatant büyük 60 mL şırınga kullanarak 0,45 µm filtreden geçirerek arındırmak. Hemen tek kullanımlık aliquots (300 µL) dağıtmak ve-80 ° C'de depolayın En fazla ürün etkinliğini korumak için donma-çözülme döngüsü önlemek.
2. Lentiviral iletim
- bölünmüş % 60 izdiham bulaşması için hücre kültürünü (HEK-293 hücreleri ve SH-SY5Y; de başına 5 x 10 5 hücre ve U2OS; iyi başına 1 x 10 5 hücre) 6-iyi doku kültürü plaka DMEM medya ile takıma 2 ml % 10 FBS.
- 6-iyi doku kültürü plaka 37 ° C kuluçka makinesine %5 CO 2 adlı gecede devam.
- Donmuş lentivirus-80 ° C dondurucudan kaldır ve bir aliquot her kullanımdan önce buz çözme; değil refreeze. Virüs çözdürme iken,
- sıcak ilgi hücre satırı ile uyumlu serum içeren hücre kültür orta. Bir kez virüs tamamen çözdürülen, dilutions bir dizi hazırlamak (1:3, 1:10, 1:30 ve 1: 100) içinde bir taze 1.5 mL microfuge tüp DMEM.
- Düşük serum medya ile 1 ml tüpler hacmindeki getirmek.
- Polybrene (adlı bir hazır 4 µg/µL) eklemek 2 µL virüs/medya 1 ml. De pipetting tarafından mix ve hücrelere 1 mL karışımı ekleyin. Virüs 24 h için hücrelerle kuluçkaya
- Virüs medyayı çıkarın ve normal DMEM medya % 10 ile desteklenmiş yerine FBS. 37 ° c, % 5 CO 2 hücreleri korumak.
- Hücrelerinin büyümesini izlemek ve her iki günde kültür ortamı değiştirin. İzdiham 6-iyi çanak 10 cm çapında doku kültürü plaka genişletin. Hücreleri yeterince genişletilmiş oldu bir kez
- , 50 µL DMEM medya 384-iyi tahlil plakaları YFP ifade düzeyini denetlemek için bir kuyu başına tohum 1.5 x 10 4 hücre protein mikroskobu ile etiketledi. YFP etiketli protein hücre ifade bir sinyal-gürültü oranı gösterir ≥ 3, hücre hisse senedi karşılık gelen hücre satırı için hazır olun.
3. Zaman bağımlı proteasome önleyici etkisi protein toplama
Not: otomatik bir mikroskop kullanarak resim alma gerçekleştirmek (malzemeleri görmek).
- % 100 DMSO (ALLN, 2 mM) 384-şey düz dipli Tabaklarda çözünmüş DMSO veya proteasome inhibitörü 0,25 µL dağıtmak.
- El ile DMEM 50 µL kuyuda başına tohum 1.5 x 10 4 hücre medya aynı plaka tahlil. Proteasome inhibitörü (ALLN) son konsantrasyonu 10 µM olmalıdır.
- 37 ° C ve % 5 CO 2 mikroskop sistem çevre kontrol birimine ayarlayın. Deneysel kurulumunun bir ekran görüntüsü şekil 3 ' te gösterilen.
- Mikroskop yazılımı aşağıdaki ayarlarla kullanarak geniş alan Floresans modunda çalışır: LWD 20 X amaç, confocal modu, 4 alanları/iyi, bir saat yakalama aralığı ile. Her çalışma sonunda, çektiğiniz resimleri otomatik olarak sunucuya karşıya.
4. Canlı hücreler YFP ifade için atlamalı görüntüleme süresi ve görüntü analizi (tek kanal)
Not: Aşağıdaki adımlarda, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı (örneğin, Columbus) uygulanması açıklanmaktadır.
- Seçin uygun algoritması (sitozol ve toplamları) birincil nesneleri segmentlere ayırmak için. Gerekirse, arka plan eşik ve kontrast parametreleri ( şekil 4) ayarlamak.
- Hücreleri hesaplama kullanarak ' hücreleri bulma ' 0.1 YFP yoğunluk kanal için bireysel bir eşik değeri ile. Kullanarak toplamları belirlemek bir ' noktalar bulmak ' algoritması bir göreli YFP nokta yoğunluğu ile > 0.2 ve 1.0 yarma katsayısı.
5. Doz yanıt etkisi proteasome inhibitörleri protein toplama onların çekirdek (iki kanal) lekeli canlı hücreler üzerinde
Not: otomatik bir mikroskop kullanarak resim alma gerçekleştirmek. Proteasome inhibitörleri (ALLN, Epoxomicin ve MG132) bir optimum eğri uyum sağlamak için beklenen ŞA 50 değeri üzerinde dayalı konsantrasyon aralığı belirlemek.
- Hazırla seri dilutions 384-iyi depolama polipropilen bileşikler standart tarafından 1:3 seyreltme serisi plaka. Bileşik dilutions mix emin olun de bileşik konsantrasyonları doğru olduğundan emin olmak için.
- Proteasome inhibitörleri boş düz-alt siyah 384-iyi tahlil plakalar üzerinde 0,25 µL dağıtmak. Biz bir 384-kılcal kafa birimleri aktarma yeteneğine sahip ile donatılmış bir sıvı işleyicisi kullanmak.
- Tohum 1.5 x 50 bir kuyu başına 10 4 hücre µL tahlil plakaları DMEM medya. 37 ° C ve % 5 CO 2 24 h için tahlil plakaları kuluçkaya
- DMEM (37 ° C'de önceden ısındı) medya çözüm (Höchst 33342 adlı bir hisse senedi olarak 10 mg/mL) boyama ile 10 µL ekleyin ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya Mikro
- başlatmakyazılımı çalışan baş. Deneysel kurulumunun bir ekran görüntüsü şekil 6 ' da gösterilmiştir. Seçin " yapılandırma " tab ve 20 X amaç ve doğru plaka türü seçin. Emin olmak " yaka " uygun odak farklı plaka türleriyle izin amaç üzerinde doğru değere ayarlanır.
- Select " mikroskop " sekmesini tanımla pozlama 1 olarak YFP (488 lazer) ve pozlama 2 Höchst olarak (405 laser). Her iki pozlama üzerinde filtre etkinleştirin ve pozlama 1 kamera 1 ve kamera 2 2 maruz atayabilirsiniz. ~ 800 ms pozlama 1 için pozlama süreleri ayarlıysa ve ~ 40 ms maruz kalma 2.
- Select pozlama 1. Ayarlayın odak yüksekliği 0 µm. için Select " odak ". Bir kez odaklı, kamera 1 ortaya çıkarmak. Pozlama uçak optimize etmek ve tıkırtı üstünde odak yüksekliğini ayarla " almak yükseklik ". ~ 3.000 en büyük piksel yoğunluğu vermek güç lazer ve pozlama zaman değişiyor. Pozlama parametreleri kaydedin. Tekrar maruz kalma 2.
- Select " deney tanımı " sekmesini oluşturmak bir düzen ve sublayout. Sürükle ve bırak ilgili düzen, pozlama, başvuru yansıması, skewcrop dosya ve sublayout. Deneme kaydedin.
- Select " otomatik deney " tab ve görüntüleri. Her çalışma sonunda, çektiğiniz resimleri otomatik olarak sunucuya karşıya.
6. Görüntü iki kanal görüntü analizi
- (nükleuslar, sitozol ve toplamları) birincil nesneleri segmentlere ayırmak için bilgisayar yazılımı algoritma seçin ( Şekil 7).
- Çekirdeği doğru bir şekilde bölümlenmiş nesneleri görsel denetim tarafından kesim yöntemi seçin. Höchst lekeli nesneleri Kanal 1 (Ch1) hücreleri belirlemek için kullanılır. YFP SOD1-A4V Kanal 2 (Ch2) toplam miktarını belirlemek için kullanılan mutant boyama.
- Kullanarak hücreleri hesaplama ' çekirdeği bulmak ' algoritması bölgeleri Höchst boyama olarak > 20 µm 2, 7.0, bireysel bir eşik değeri 0.40 ve bir kontrast split faktörle > 0.10.
- Veri tablosu oluşturma ve EC 50 her kullanarak bileşikler için belirlemek ' Non-linear regresyon ' grafik yazılım denklemde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lentivirus kullanarak oluşturma kararlı hücre kültürünü: SOD1 protein toplamları izleme için genel strateji şekil 1' de gösterilmiştir. Bir ilk adım olarak, biz bir lentiviral ifade vektör SOD1 istikrarlı gen teslim içine hücre hatları (Adım 1) için oluşturulan. İki lentiviral vektörler kodlama YFP öğesini SOD1 WT ve SOD1 A4V (SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP, sırasıyla) ambalaj ve zarf ile plazmid (şekil 2A) hazırlanmıştır. Lentiviral iletim (Adım 2) hücre çizgiler test (HEK-293, U2OS ve SH-SY5Y) sağlıklı, gösterdi yüksek ifade düzeyleri (2B rakam) ve uzun vadeli YFP SOD1 formu ne olursa olsun etiketleme kaldı. İlginçtir, ne WT ne de mutant SOD1 görünür toplama, geçici ifade hücresel modelinin aksine gösterdi üç hücre satırlar olarak ifade daha önce11test.
Validating istikrarlı hücre hatları SOD1 toplama ve onun dinamik eğitim için: SOD1 misfolded SOD1 mutant hücresel birikimi üzerine toplama oluşumu tetiklemek için biz proteasome inhibitörü ALLN kullanılan (da denir calpain ı ve II inhibitörü; Ki sırasıyla 190 ve 220 nM =), önceden doğrulanmış geçici bir SOD1 ifade hücresel modeli11kullanarak. SOD1 toplama SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP ile transduced HEK-293, U2OS ve SH-SY5Y hücre hatları ile incelenmiştir. Proteasome inhibitörü ALLN ile tedavi (10 µM) 24 saat şiddetle HEK-293 hücreleri (şekil 2C) SOD1A4V-YFP toplamları birikimi terfi için. Ancak, hiçbir toplama hücre satırları ve çok az düzeyde toplama U2OS içinde bulundu ve SH-SY5Y hücre hatları SOD1A4V-YFP SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP (şekil 2C) transduced YFP-SOD1WT transduced bulundu. Bu gözlem dayalı, biz hızlandırılmış mikroskobu (Adım 3, şekil 3) tarafından proteasome inhibisyonu indüklenen SOD1A4V-YFP toplama oluşumu dinamik araştırmak için SOD1A4V-YFP toplama bir tek YFP floresan kullanarak ölçmek için kullanılan ve Kanal ifade hücreleri ve toplamları canlı hücreler (Adım 4, şekil 4) tespit etmek için. Hücreleri ALLN de tohumlari ve 50 saat (şekil 5A) bir süre için takip. Bizim deneysel koşullar altında bulduk toplama oluşumu 24 saat bir plato ulaşmış ALLN tarafından indüklenen ve önümüzdeki 12 saat boyunca sabit kalmıştır. Biz cep numarası DMSO tedavi negatif denemeye artarken hücre yoğunluğu önemli ölçüde ALLN, sitotoksik etkisini bir sonucu olarak 28 saat sonra azalma olduğunu gösterir.
Characterizing küçük molekül EC 50 SOD1 kullanarak toplama oluşumu için model cep: SOD1A4V-YFP ifade hücreleri bir doz bağımlı şekilde küçük molekül proteasome inhibitörleri ile tedavi edildi. Nükleer bir işaretleyici sitozol bölme içinde toplama algılama için avantajlıdır SOD1A4V YFP hücre kültürünü etiketlemek için kullanılır. Gerçekten de, her hücre çekirdekleri segmentlere ve onları dönüm noktası segmentasyon hücre çekirdeği olarak kullanarak bir çekirdek içerdiğinden, sitoplazma segmentasyon Basitleştirilmiş21' dir. Höchst boyama, hangi bilinen bir kısa vadeli dönem için ve düşük konsantrasyonlarda22, önceki zaman atlamalı deneme Imaging kullanılmadı koşulları kullanıldığında zehirlenmesi sevişirdik. Hücre kültürü çalışmalarının proteasome inhibitörleri huzurunda 24 saat sonra SOD1A4V-YFP hücreleri için 10 dk Höchst çözüm (10 µg/mL) ile lekeli. Sonraki Floresans görüntüleri Höchst ve bir 20 X 0,4 NA hedefi (Adım 5, şekil 6) kullanarak YFP için elde. Hücre çekirdeği ve SOD1A4V-YFP dağıtım dikkate alır bir görüntü analiz algoritması kullanarak, görüntü analiz yazılımı (adım 6, Şekil 7) kullanarak hücreleri analiz edildi. Höchst lekeli nesneleri uygun floresan yoğunluğu yukarıda arka plan ve bir çekirdek (genişlik, uzunluk ve alan) morfolojik boyutu özelliklerini sergileyen tespit ve görüntü segmentasyonu tarafından gizli. Höchst boyama türetilmiş nükleer maskesi hücre sitozolik alanı içinde proksimal SOD1A4V-YFP spot dağıtım izlemek ve toplamları olup belirlemek için kullanıldı. Çekirdek ve noktalar algılamayı dayanarak, toplamları karşı hücreleri tespit oranı hesaplanır. Bizim tahlil duyarlılığını belirlemek için biz sonraki sayısal toplama SOD1A4V-YFP HEK-293 hücre quantified veri uydurma etkin bir doz konsantrasyon şekilde üç farklı proteasome inhibitörleri (ALLN, MG132 ve epoxomicin) tedavi ve EC50 değerleri 6,53 ± 1.17, 0,17 0,06 ve 0,03 ± ± 0,03 µM ALLN, MG132 ve epoxomicin, anılan sıraya göre hesaplanan (şekil 8B). Tüm üç proteasome inhibitörleri için göreli toksisite yapışık hücreleri Höchst boya ile etiketli iyi kalan ölçerek sayısal. Toplam telefon numarası yanıt olarak bileşik efektler, azaltmak olarak sırasıyla benzer EC50 değerleri 6.58 ± 1.06, ALLN, MG132 ve epoxomicin, 0,19 ± 0,03 ve 0,05 ± 0,01 µM kanıtladığı eğilimi bulduk.
Şekil 1. İş akışı ve zaman çizelgesi hücre kültürünü üretimi ve yüksek içerik analizi (HCA) protein toplayıcı için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. SOD1 WT ve A4V istikrarlı çizgi üretimi.
(A) lentiviral ve ambalaj vektörel çizimler (ambalaj ve zarfın plazmidleri) vahşi türü ve mutant SOD1 A4V lentivirus üretimi için şematik diyagramı. (B) seçilen üç hücre (HEK-293, U2OS ve SH-SY5Y) lentivirus vahşi türü SOD1 (WT) ve mutant SOD1 ile transduced confocal görüntüleri (A4V). (C) üç istikrarlı hücre temsilcisi görüntüleri 24 h proteasome inhibitörü, ALLN (10µM) ile tedavi. SOD1A4V-YFP toplamları bol olmak bulunmuştur (Kırmızı oklar) HEK-293'de mevcut, ancak seyrek U2OS veya SH-SY5Y hücrelerde mevcut. Görüntüleri bir 20 X hedefi kullanarak elde. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Hücreleri ve toplamları algılamak için YFP kanal kullanarak toplama görüntü analizi için gereken dört adım.
(1) görüntü veri depolama ve analiz sistemi ithalat görüntüleri. (2) "hücreleri bulma" hücre sayım için seçin. (3) seçin "bul noktalar" toplamları belirlemek için. (4) her algoritma dayalı sonuçlar tanımlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. SOD1A4V-YFP toplamları HEK-293 hücrelerdeki birikimi için önde gelen Proteasome inhibisyonu.
(A) seçilen ALLN 10 µM ile tedavi SOD1A4V-YFP HEK-293 hücrelerinin confocal resimleri. (B) kantitatif analiz toplama oluşumu ALLN (10µM) ile indüklenen ve hücre bir saat-bağımlı şekilde sayar. Görüntüleri elde LWD 20 X amaç her 60 dk. ölçek kullanarak çubuk 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Perde atış deneysel kümesinin kadar iki edinme (YFP ve Höchst) kanal için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7. Dört SOD1 toplamları ve hücreleri YFP ve Höchst etiketli görüntü analizi için gerekli adımlar.
(1) görüntü veri depolama ve analiz sistemi giriş görüntülerden. (2) "çekirdek bulabilirsiniz" hücre sayım için seçin. (3) seçin "bul noktalar" toplamları belirlemek için. (4) her algoritma dayalı sonuçlar tanımlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8. Kantitatif analiz SOD1 A4V toplama ve doz bağımlı proteasome inhibitör konsantrasyon.
(A) burada görüntü mevcut ve Columbus görüntü analiz sistemi kullanılarak miktar analiz yöntemi noktalar ve hücre için sayar. Höchst (Ch1) belirli iki floresan kanallara karşılık gelen görüntüleri ve YFP (Ch2) ardışık olarak elde. Höchst lekeli nesneleri (solda) görüntü segmentasyonu tarafından tespit edilmiştir. "Çekirdek bulmak" algoritma elde edilen nükleer maskesi (Merkezi) hücreleri, toplamları algılamak için kullanılan spot maskesi (sağda) "noktalar bulmak" algoritması tarafından takip saymak için uygulandı. ((B)) doz yanıt çalışma mutant SOD1 A4V, toplama bir değişken EC50 sıralamasını 6,53 µM, ALLN, MG132 için 0.17 µM ve Expoxomicin için 0,03 µM gösteren proteasome inhibitörleri etkisi. Seçilen EC50 konsantrasyon, mutant SOD1 tedavi A4V proteasome confocal resimleri. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İstikrarlı hücre hatları oluşturmak için iki temel yaklaşım vardır. İlk birkaç hafta sürer ve genomik entegre plazmid DNA vektörel çizimler geçici transfection ve direnç işaretlenmesini gerektirir. İkinci birkaç saat kullanımı ile lentivirus, sınırlı bir çaba ile birden çok hücre hatlarında bu protokolü mükellef etkili ifade hedef protein yapma alır. GEZİ-CMV vektör19 , korunmuş iletim verimliliği ve istikrarlı transgene ifade ile kullanmak için sürekli bir vektör yapıldı. Bizim için sürpriz, oluşturulan üç hücre satırları geçici ifadeye dayalı deneysel protokol aksine SOD1, mutant görünür hiçbir toplama önceki11açıklanan gösterdi. Bu oldukça kısa bir süre içinde daha yüksek protein ifade oluşturur gibi geçici ifade protein toplama iyilik olasıdır. Geçici transfection bir çoğunluk proteinlerin düşürür, Ubikuitin-proteasome sistem toplamak eğilimli proteinler aşağılamak için kapasitesini tam olarak hangi yararlı bir doygunluk noktasına ulaşır. Ancak, biz kararlı hatları, proteinler ifade edileceği proteasome, via misfolded protein ortadan kaldırılması ile eşleşen bir nispeten sabit düzeyde fizyolojik durum yeniden olasılığı daha fazladır iddia autophagosome-lysosome, ve ekzositozu. ALS için önde gelen birincil olaylar hala bilinmeyen olmakla birlikte, Ubikuitin proteasome sistem, azalmış aktivite ile bağlantılı olarak yaşlanma önemli risk faktörü23' tür. Bizim hücresel tahlil tarafından gösterildiği, proteasome inhibisyon toplama misfolded protein (SOD1 A4V) teşvik etmektedir. Bu nedenle, bu tahlil yolu veya refakatçi ağ sinyal autophagy küçük molekül harekete geçirmek için ekran için yeni fırsatlar yaratır. Nitekim, bu cadde refakatçi indüksiyon için umut verici görünüyor, bu ortak bir uyarıcı ile tedavi ısı gösterilen Kieran ve ark. rapordan tarafından resimli olarak şok yanıt SODG93A ömrünü uzatarak terapötik yararları olduğu bulundu Fareler24.
Bu tahlil kullanmadan önce göz önünde bulundurulacak birkaç tuzaklar söz önemlidir. Tahlil optimizasyonu Protokolü gibi ya da % 1 üzerinde DMSO konsantrasyonları artar bizim tahlil ölçülen YFP ortalama yoğunluğu buldum. Bu nedenle DMSO konsantrasyonu %0.5 herhangi bir tür yapay doku önlemek için azaltmak önemlidir. Ayrıca, lens büyütme ve tahlil plaka dansitesi hücre seçimi önemli tahlil sağlamlık optimize etmek için dikkate vardır.
Bizim çalışmada, biz lentiviral sistemiyle, SOD1A4V-YFP HEK-293 hücre kültürünü de mutant SOD1 A4V toplama oluşumu üzerine indüksiyon proteasome inhibitörleri tarafından izlenmesi için uygun olduğunu göstermiştir. Misfolded protein ve toplama proteinopathies mekanizmaları anlamak için gerekli çalışmadır. Her ne kadar protein toplama analiz etmek için araştırma araçları son on yıl içinde genişletilmiştir, algılamak ve toplama ölçmek için verimli yaklaşımları toplama oluşumu engelleyen ekran molekülleri gereklidir. Bu eser tahlil geliştirme ve protein toplama çalışmaları için detaylı bir protokol sağlar. Umut verici bir biçimde, HCS, HCA ve kimyasal veya CRISPR/siRNA kitaplıkları desteği ile bu iş therapeutics ya da roman hedef bulma için yeni yollar açmak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Kore hükümeti (MSIP) (NMK-2014K1A4A7A01074642) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (NMG) bireysel bilim adamı destek programı (NMK-2013M3A9B5076486/NMG-2015R1D1A1A09057239) tarafından finanse edilen bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
