Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Spredning og differentiering af Murine myeloide prækursorer 32 d/G-CSF-R celler

Published: February 21, 2018 doi: 10.3791/57033
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Department of Hemato-Oncology, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Childhood Leukaemia Investigation Prague, Department of Paediatric Haematology and Oncology, 2nd Faculty of Medicine, Charles University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenteres detaljerede protokoller for dyrkning murine myeloide prækursorer 32 d/G-CSF-R cellelinie, udfører virusinfektioner og udføre spredning og differentiering assays. Denne cellelinje er egnet til at studere myeloide celle udvikling og rollen af gener af interesse i myeloide cellevækst og neutrophilic differentiering.

Abstract

Forståelse af den hæmatopoietisk stilk og stamfader cellebiologi har stor betydning for regenerativ medicin og behandling af hematological patologier. Trods de mest relevante data, der kan erhverves ved hjælp af i vivo modeller eller primære kulturer, begrænser den lave overflod af hæmatopoietisk stilk og stamfader celler betydeligt puljen af egnede teknikker til deres undersøgelse. Derfor giver brugen af cellelinjer tilstrækkelig produktion af biologisk materiale for udførelsen af screeninger eller assays, der kræver stor celle numre. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse, udlæsning og fortolkning af spredning og differentiering assays, der anvendes til undersøgelse af processerne i myelopoiesis og neutrophilic differentiering. Disse eksperimenter ansætte linjen 32 d/G-CSF-R cytokin afhængige murine myeloide celler, som besidder evnen til at formere sig i nærværelse af IL-3 og differentiere i G-CSF. Vi leverer optimerede protokoller til håndtering af 32 d/G-CSF-R celler og diskutere store faldgruber og ulemper, der kan kompromittere beskrevet assays og forventede resultater. Denne artikel indeholder desuden protokoller til lentiviral og retroviral produktion, titrering og transduktion af 32 d/G-CSF-R celler. Vi demonstrere, at genmanipulation af disse celler kan være ansat til held udføre funktionelle og molekylære undersøgelser, som kan supplere resultaterne med primære hæmatopoietisk stilk og stamfader celler eller i vivo modeller.

Introduction

Hæmatopoietisk stilk og stamfader befolkningen leverer organisme med et stort udvalg af modne celler, herunder celler fra myeloide slægt (neutrofiler, eosinofile, basofile og monocytter). Den proces, der drev produktion af myeloide celler fra hæmatopoietisk stamceller er kendt som myelopoiesis, og tilstrækkelig produktion af modne myeloide celler som reaktion på skiftende krav er en forudsætning for korrekt håndtering af organismen med stress betingelser, såsom infektioner og blodtab. Utilstrækkelig produktion af modne myeloide celler kan føre til manglende evne til at fjerne patogener, reduceret blood Koagulering og andre livstruende forhold1,2. Derudover kan forandringer i myeloide lineage udvikling også være forbundet med hematological maligniteter, såsom akut myeloid leukæmi (AML)3. Ændringer i myelopoiesis kan forekomme af forskellige årsager, såsom fejl i celle overfladen receptorer4, ændrede udtryk for transskription faktorer5, nedsat signaling veje6, mutationer resulterer i dannelse / aktivering af onkogener7eller inaktivering af tumor suppressor gener8.

Forskellige metoder er blevet udviklet for at studere myeloide udvikling, og vurdere effekten af specifikke genetiske ændringer i denne proces. Fælles tilgange bruges til at studere myelopoiesis involverer primærelementer og Transgene mus. Selv om disse modeller tillade erhvervelsen af biologisk relevante data, har de visse begrænsninger. Brugen af primærelementer støder på et begrænset antal celler og en begrænset periode af kultur, indsnævre mulighederne for at ændre genekspression og efterfølgende biologiske eller biokemiske analyser. Transgene mus er dyre og kræver en rimelig grad af biologisk begrundelse. Derudover tilføjer arbejder med i vivo modeller en grad af kompleksitet i oplysninger om betydningen af et gen af interesse i en given proces. Derfor er der behov for alternative metoder til at omgå disse begrænsninger. Cellelinjer har ubestridelige fordele: (1) de besidder ubegrænset spredning kapacitet, der tillader generere nok materiale til biokemiske og biologiske undersøgelser, (2) de er modtagelige for genetiske manipulationer (knockdown, knockout, overekspression), (3) omkostningerne er forholdsvis lave, og (4) de tillader en grad af biologisk forenkling kræves i visse eksperimenterende tilgange.

Af forældrenes IL-3 (Interleukin-3) afhængig af 32 d cellelinie blev etableret i 1983 af Greenberger og kolleger ved infektion af knoglemarv celler fra C3H/HeJ mus med ven murine leukæmi virus9. Flere 32D kloner var beskrevet i litteraturen: cl-239, cl-310og cl-1011. De 32D cl-3 celler viste sig at formere sig i IL-3 og gennemgå neutrophilic differentiering efter behandling med granulocyt koloni stimulation faktor (G-CSF)10. Tværtimod 32D cl-10 celler, mens at være IL-3 afhængige, oprindeligt ikke differentiere som svar på G-CSF behandling. I 1995 transduced gruppe af Dr. Ivo Touw Retroviralt 32D cl-10 celler med vildtype og mutante former for G-CSF receptor (G-CSF-R), for at identificere funktionelt vigtige områder af denne receptor11. Denne undersøgelse resulterede i generation af 32 d/G-CSF-R celler, som er ligeledes afhængige af IL-3, men inden for 6-10 dage efter udskiftning af IL-3 med G-CSF, stop celler for at formere sig og uigenkaldeligt differentiere i modne neutrofiler. Disse egenskaber gør 32D cl-3 og 32 d/G-CSF-R celler forenklede modeller af murine neutrophilic differentiering, der kan tilpasses af to veldefinerede vækst og differentiering faktorer - IL-3 og G-CSF. I løbet af de sidste årtier har flere grupper brugt 32 d/G-CSF-R celler til at studere rollen af bestemte gener i spredning og differentiering af myeloide celler i kultur12,13,14,15 , 16, og at studere G-CSF signaling17,18. Vigtigere, resultaterne ved hjælp af denne cellelinie korreleret med oplysninger indhentet med primærelementer og Transgene mus16,19,20,21. Vi mener derfor, at 32 d/G-CSF-R celler, er et almindeligt anvendte og veletableret model, udgør et værdifuldt system til at studere myeloide differentiering, som kan anvendes parallelt med andre tilgange tackle dette spørgsmål.

Her, detaljerede protokoller der beskriver håndtering af 32 d/G-CSF-R cellelinie, som dækker ekspansion, differentiering og vurdering af spredning og differentiering af disse celler er præsenteret. Detaljerede oplysninger for gensplejsning af 32 d/G-CSF-R celler, enten ved retroviral eller lentiviral transduktion samt protokoller for virus titrering leveres. Derudover findes flere repræsentative resultater, der viser potentielle anvendelser af 32 d/G-CSF-R celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Trin beskriver ekspansion, differentiering og transduktion af 32 d/G-CSF-R celler er præsenteret nedenfor.

1. forberedelse

  1. Media forberedelse
    1. Forberede 250 mL af næringssubstratet: RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 medium suppleret med 10% varme inaktiveret FBS (føtal bovint serum) og murine IL-3 (10 ng/mL).
      1. Alternativt kan du bruge hjemmelavet IL-3. At producere hjemmelavet IL-3, transduce HEK293 celler med IL-3 udtrykke vektor og indsamle IL-3 indeholdende supernatanten22.
        Bemærk: Antibiotika såsom penicillin G (100 IE/mL), streptomycin (100 µg/mL) og gentamicin (40 µg/mL), kan bruges til celle dyrkning på ethvert trin i protokollen, medmindre andet er angivet.
    2. Forberede 50 mL af differentiering medium: RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og menneskelige G-CSF (100 ng/mL).
      Bemærk: (Vigtigt) ikke alle serum kladdenavne støtte differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. Inden forsøget start teste forskellige batches af serum. Det anbefales at teste mindst 4 forskellige partier og vælge den optimale baseret på 32 d/G-CSF-R cellerne evnen til at skelne. Se 32 d/G-CSF-R differentiering protokol nedenfor.
    3. Forberede 10 mL af indefrysning medium: RPMI 1640 medium suppleret med 40% FBS, og 10% DMSO (dimethylsulfoxid).
  2. Produktion af retrovirus
    1. Plade en enkelt cellesuspension af Bosc23 celler (6 × 106) i en 16 cm petriskål og dyrke i 18 mL af DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle Medium) som indeholder 10% FBS indtil confluency kultur når 80% (24 h).
      Bemærk: Celler skal vokse i en éncellelag og ikke form klumper i kultur. Celle optælling kan udføres ved hjælp af forskellige metoder (gælder for resten af de protokoller, der præsenteres her). I tilfælde af lavt antal prøver anbefales manuel optælling under mikroskop ved hjælp af Bürker afdeling. I dette tilfælde, brug Trypan blå for udelukkelse af døde celler. Bland celler 1:1 med 0,4% Trypan blå i PBS. For at foretage optælling af stort antal prøver, kan være ansat en automatisk celle counter.
    2. Kombinere 40 µg retroviral konstruktion (f.eks. MSCV), 20 µg pCL-øko (emballage vektor)23, 80 µl af PEI (polyethylenimine) og 2 mL af nedsat Serum medium (f.eks Opti-MEM) medium (uden antibiotika). Inkuber denne blanding i 20 min. ved stuetemperatur (RT).
    3. Omhyggeligt erstatte Bosc23 celler medium med 16 mL DMEM suppleret med 2% FBS. Pre varm medium til 37 ° C før brug.
      Bemærk: Brug ikke antibiotika under Transfektion, da det kan reducere Transfektion effektivitet.
    4. Tilføj blandingen forberedt i punkt 1.2.2. dråbevis og omhyggeligt at Bosc23 kultur, og der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C. Begrænse inkubation til mindre end 6 h på grund af PEI toksicitet.
    5. Efter inkubationen ændre Bosc23 medium til 18 mL pre varmede DMEM indeholdende 10% FBS, og dyrke celler i 48 timer ved 37 ° C. Placere retter i en biosikkerhed niveau 2 laboratorium, holde her fra dette trin på og følge standard procedurer.
    6. Indsamle Bosc23 medium (indeholdende ecotropic retroviral partikler) ved hjælp af en 25-mL serologisk afpipetteres i en 50 mL konisk slange, og opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: (Vigtigt) Transfektion effektivitet bør nå 90% for at producere en høj titer virus.
    7. Tilføj 18 mL pre varmede DMEM 10% FBS til Bosc23 celler og dyrke i 24 timer.
    8. Gentag trin 1.2.6.
      Bemærk: Retroviral analysere fra 1.2.6 og 1.2.8 kan samles, når de når den samme temperatur (4 ° C) for at bevare viral integritet.
    9. For at undgå Bosc23 kontaminering i viral analysere, spin indsamlede virus ved 1500 × g i 10 min. ved 4 ° C. Alikvot virus, snap fryse ved hjælp af tøris eller flydende kvælstof, og opbevares ved-80 ° C. Bemærk dog, at frisklavede virus er af højere kvalitet med hensyn til infektion effektivitet end frosne bestande.
      Bemærk: (Vigtigt) undgå gentagne frysning/optøning af virus, da det fører til viral nedbrydning.
  3. Produktion af lentivirus
    1. Plade en enkelt cellesuspension af HEK293T (menneskelige embryonale nyre 293T) celler (6 × 106) i en 16-cm petriskål og dyrke i 18 mL af DMEM indeholdende 10% FBS indtil confluency kultur når 80% (24 h).
      Bemærk: Celler skal vokse i en éncellelag og ikke form klumper i kultur.
    2. Kombinere 15 µg af lentiviral konstruktion (f.eks. pGhU6), emballager plasmider pCMVdR8.74 (kodning for gag/pol, 12 µg) og pMD2.VSVG (kodning for VSV-G, 1.4 µg), 85.2 µL PEI, og 2 mL af nedsat serum medium (uden antibiotika). Inkuber denne blanding i 20 min. på RT.
    3. Omhyggeligt erstatte HEK293T medium med 16 mL af DMEM suppleret med 2% FBS. Pre varm medium til 37 ° C før brug. Må ikke bruge antibiotika under Transfektion, da det kan reducere Transfektion effektivitet.
    4. Omhyggeligt slip blandingen forberedt i 1.3.2 til HEK293T cellekultur og Inkuber i 4 timer ved 37 ° C. Begrænse inkubation varighed til inden for 6 h at forhindre PEI toksicitet.
    5. Ændring af medium til 18 mL pre varmede DMEM 10% FBS og dyrke celler i 48 timer ved 37 ° C. Placere retter i en biosikkerhed niveau 2 laboratorium, holde her fra dette trin på og følge standard procedurer.
    6. Indsamle HEK293T medium (indeholdende amphotropic lentiviral partikler) ved hjælp af en 25-mL serologisk afpipetteres i en 50 mL konisk slange og opbevare det ved 4 ° C.
      Bemærk: (Vigtigt) Transfektion effektivitet bør nå 90% for at producere en høj titer virus.
    7. Forsigtigt tilføje 18 mL af pre varmede DMEM 10% FBS i HEK293T celler. Dyrke i 24 timer ved 37 ° C.
    8. Gentag trin 1.3.6.
      Bemærk: Lentiviral supernatanter fra 1.3.6 og 1.3.8 kan samles, når de når den samme temperatur (4 ° C) for at bevare viral integritet.
    9. For at undgå kontaminering af viral supernatanten med HEK293T celler, spin indsamlede virus ved 1500 × g i 10 min. ved 4 ° C. Alikvot virus, snap fryse ved hjælp af tøris eller flydende kvælstof, og opbevar den ved-80 ° C. Bemærk dog frisklavet virus er af højere kvalitet med hensyn til infektion effektivitet end frosne bestande.
      Bemærk: (Vigtigt) undgå gentagne frysning/optøning af virus, da det fører til viral nedbrydning.
  4. Titrering af virus indeholdende en normal god landbrugspraksis reporter
    1. Frø 1 × 105 NIH/3T3 celler i 300 µL af DMEM 10% FBS pr. brønd i en 24-godt plade. 7 brøndene vil blive ansat til titer en virus.
    2. Opd virus ved 37 ° C og tilsættes 1, 5, 10, 50, 100 og 500 µL virus til NIH/3T3 kulturer. Tilføj ikke nogen virus i negativ kontrol godt. Dyrke celler under tilstedeværelse af virus i 48 timer ved 37 ° C.
    3. Høste NIH/3T3 celler ved hjælp af 30 µL af trypsin/EDTA (ethylendiamintetra syre) (0,25% Trypsin, 0,01% EDTA i PBS) og placere celler i 250 µL PBS i FACS (Fluorescens aktiveret celle sortering) rør.
    4. Bestemme hyppigheden af normal god landbrugspraksis+ celler ved flowcytometri i hver prøve24. Udelukke døde celler ved tilsætning af en levedygtighed farvestof, som Hoechst 33258.
    5. Beregn det samlede antal NGL+ celler (baseret på antallet af forgyldt celler og procentdel af normal god landbrugspraksis+ celler), og plot dem mod mængden af virus, som benyttes til infektion.
      Bemærk: (Vigtigt) effektivitet af infektion når et plateau, når store viral doser anvendes. Det er derfor vigtigt at vurdere titer baseret på viral koncentrationer på hvilke infektion opstår effektivitet i en lineær serie (eksempel vist i tabel 1). Antallet af normal god landbrugspraksis+ celler angiver antallet af funktionelle viruspartikler (TU - omdanne enheder) i en given virus volumen. Genberegne antallet TU pr. mL.
  5. Titrering af virus indeholdende en puromycin journalist
    1. Frø 5 × 104 NIH/3T3 celler i 3 mL af DMEM 10% FBS pr. brønd i en 6-godt plade; ansætte 6 wells titer en virus. Kultur natten over ved 37 ° C.
    2. Næste dag fortyndes virus som angivet i tabel 2. For at fortynde virus, bruge pre varmede DMEM 10% FBS. Gør ikke vortex.
    3. Fjern næringssubstratet fra NIH/3T3 celler og tilsættes 1 mL fortyndet virus.
    4. Der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    5. Forsigtigt erstatte den virus-holdige medium med 2 mL af pre varmede DMEM 10% FBS, og der inkuberes natten over ved 37 ° C.
    6. Forsigtigt erstatte NIH/3T3 medium med 2 mL af pre varmede DMEM 10% FBS indeholdende puromycin (2 µg/mL).
    7. Kultur på 37 ° C og forsigtigt refresh medium med puromycin hver 3 dage eller Hvornår medium bliver gul.
    8. 10-12 dage efter infektion, Aspirér medium fra hver brønd og vask forsigtigt med PBS.
    9. Pletten med 1 mL krystalviolet-opløsning (0,5% krystal violet i 20% ethanol og dH2O), 2 min på RT, og vask forsigtigt med PBS to gange.
    10. Antal blå kolonier i hver brønd under et mikroskop (forstørrelse X4). Ingen kolonier bør overholdes i den negative kontrol godt.
    11. Beregn det samlede antal TU/mL overvejer fortyndingsfaktoren.

2. udbygning og vedligeholdelse af 32 d/G-CSF-R celler

  1. Hvis 32 d/G-CSF-R celler er frosset, tage en alikvot og tø celler i et 37 ° C vandbad i 1 min. og hæld celler fra hætteglasset direkte til 10 mL af pre varmede RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS i en 15mL tube. Inverter rør 3 gange og spin cellerne ned på 400 × g. Fjern supernatanten og resuspend celler IL-3 indeholdende dyrkningsmedium med en koncentration på 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Optimal celle vækst koncentration er 0,25-0,5 × 106 celler/mL. Opdel celler hver 2 dage at bringe dem til en koncentration på 0,1-0,2 × 106 celler/mL.
    Bemærk: (Vigtigt) 32 d/G-CSF-R celler kan delvist mister deres evne til at skelne hvis vokset til koncentrationer højere end 1 × 106 celler/mL. Det er derfor meget vigtigt at opdele 32 d/G-CSF-R celler på tid.
  3. Efter behov, fryse og gemme celle delprøver i lange perioder ved-80 ° C eller i flydende nitrogen. Spin ned 3 × 106 celler og Fjern supernatanten resuspend i 1 mL af indefrysning medium. Sted rør i en indefrysning beholder ved-80 ° C. Lang sigt opbevaring, flytte celler til flydende kvælstof.

3. transduktion af 32 d/G-CSF-R celler

  1. Plade 32 d/G-CSF-R celler i 6-godt plade i en koncentration på 0,3 × 106 celler/mL.
  2. Tilføje passende mængde virus at nå et MOI (mangfoldighed af infektion) mellem 10 og 40.
    Bemærk: Højere MOI vil resultere i øget procentdel af normal god landbrugspraksis+ celler samt højere niveauer af udtryk af genet af interesse. Eksempel: At inficere 0,3 × 106 celler med en MOI 10; 3 × 106 TU skal føjes til 32 d/G-CSF-R celler.
  3. Tilføj polybrene til slutkoncentration 8 µg/mL, og der inkuberes i 6 timer ved 37 ° C. Alternativt kan du udføre en spin-podning procedure: centrifugeres ved 1200 × g i 90 min ved 30 ° C i en dyrkningsbaserede plade ved hjælp af en swing-spand rotoren, og Inkuber i 3 timer ved 37 ° C.
  4. Indsamle celler, overføre til en 15 mL tube, og spin på 450 × g for 5 min (4 ° C).
  5. Supernatanten, resuspend pelleted celler i 6 mL af næringssubstratet, sted i en T25 celle kultur kolbe og kultur ved 37 ° C.
  6. 48 timer senere, høste celler og spin dem på 450 × g for 5 min (4 ° C). Supernatanten.
  7. I tilfælde af en normal god landbrugspraksis reporter: placere celler i 500 µL af PBS og sortere normal god landbrugspraksis+ celler ved hjælp af en flow flowcytometri sorteringsanlæg. I tilfælde af en puromycin journalist indeholdende vektor: placere celler i dyrkningsmediet indeholdende 2 µg/mL af puromycin.
  8. Udvide celler efter behov for yderligere analyser og eksperimenter.
    Bemærk: (Valgfrit) Transduced celler kan være frosset i frysning medier i en indefrysning beholder ved-80 ° C, og yderligere opbevares i flydende nitrogen.

4. 32 d/G-CSF-R celle spredning analyse

  1. At vurdere spredning sats sted 0,2 × 106 celler i 1 mL af næringssubstratet og inkuberes natten over ved 37 ° C.
  2. Næste dag tæller antallet af celler og udvande dem tilbage til en koncentration på 0,2 × 106 celler/mL ved hjælp af næringssubstratet. Der inkuberes natten over ved 37 ° C. Registrere celle koncentrationer og fortyndinger anvendes til de daglige kulturer ved hjælp af tabel 3.
  3. Gentag trin 4.2 for så mange dage som spredning skal vurderes.
    Bemærk: Længden af spredning assays vil afhænge af effekten af gen af interesse. I tilfælde af en stærk fænotype, kan 8-9 dage være tilstrækkeligt at bemærke en betydelig effekt (Se figur 3A). Men i tilfælde af en mild fænotype, længere tid kan være påkrævet.
  4. Vurdere cellevækst ved at gøre en spredning kurve som angivet i tabel 3.

5. 32 d/G-CSF-R celle differentiering assay

  1. Vask 0,2 × 106 32 d/G-CSF-R celler to gange med RPMI medium uden cytokiner.
    Bemærk: Vask trin før tilsætning af G-CSF i kultur er vigtig, fordi tilstedeværelsen af resterende IL-3 kan hæmme differentiering.
  2. Placere celler i 1 mL differentiering medium (indeholdende 100 ng/mL G-CSF) i en 24 godt/plade, hvilket resulterede i en celle koncentration af 0,2 × 106 celler/mL (dag 0). Kultur natten over ved 37 ° C.
  3. Tæller antallet af celler/mL som anført ovenfor (trin 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 celler på et glas dias (76 mm X 26 mm) ved hjælp af en centrifuge med nødvendige adaptere på 20 × g.
  5. Opdater differentiering medium og plade celler i en koncentration på mellem 0,2 × 105 celler/mL på en 24 godt/plade (dag 1). Kassér den gamle plade, og gå videre næste dag med trin 5.6 med den nye plade.
  6. På dag 2 til 7, skal du gentage trin 5.3 til 5.5. Vurdere celledelingen i G-CSF, som beskrevet i trin 4.
    Bemærk: (Vigtigt) under differentiering, sinker celleproliferation, efter 3-4 dage i nærværelse af G-CSF er det derfor passende at kultur celler ved højere koncentrationer.
  7. Vurdere differentiering tilstand, 32 d/G-CSF-R cellerne baseret på celle morfologi.
    1. Fix celler fra trin 5.4 i methanol i 5 min på RT og forlade dias til at lufttørre.
      Bemærk: Dias fra dag 0 til 7 kan være gemt på RT og fast samtidigt. På samme måde, de kan også holdes på RT for længere perioder efter fiksering.
    2. Pletten celler ved hjælp af maj-Grünwald Giemsa farvning følgende producentens protokol.
    3. Visualisere farvede celler ved hjælp af et mikroskop og forstørrelse X40.
    4. Kvantificere antallet af eksplosionerne, intermediately differentierede celler og modne granulocytter med illustrative billeder på figur 1 og beskrivelsen i tabel 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spredning og differentiering af celler, 32 d/G-CSF-R

For at vurdere udbredelsen af 32 d/G-CSF-R celler under pro-proliferativ og Pro differentiering, var 32 d/G-CSF-R celler dyrkes i medier indeholdende IL-3 og G-CSF, henholdsvis. Det blev observeret, at celler dyrkes i IL-3 indeholdende medium (10 ng/mL) deler ca hver 24 timer (figur 2A). Ved udskiftning af IL-3 med G-CSF (100 ng/mL) spredning gradvist langsommere og stoppede efter 4 dage (figur 2A). Yderligere, tilstanden differentiering af celler kulturperler i G-CSF ved hjælp af maj-Grünwald Giemsa-farvede cytospun celler blev vurderet. Det var vist, at celler på dag 0 (før start af G-CSF behandling), præsentere en umoden myeloblast-lignende morfologi, karakteriseret ved en stor kerne og en mørk cytoplasma (figur 2B). I løbet af behandling reduceres den nukleare størrelse og form af kerne ændringer til en moon-formede eller doughnut-form. Yderligere, cytoplasma er forstørret og mister den mørk violet farve. Efter 6 dage efter behandling med G-CSF præsentere celler tegn på fuld neutrophilic differentiering, karakteriseret ved en lobulated kerne og en lys violet cytoplasma (figur 2B). Differentiering af 32 d/G-CSF-R celler er en gradvis proces, hvor ikke alle cellerne udvikle sig hen imod modne neutrofile med præcis samme hastighed. Kvantificering af celler på forskellige stadier i løbet af differentiering (nemlig blast, intermediately differentieret celle, og neutrofile) er vist i figur 2B.

Murine Evi2b knockdown blokerer neutrophilic differentiering i 32 d/G-CSF-R celler

For downregulation af EVI2B (Ecotropic Viral Integration Site 2B) i 32 d/G-CSF-R celler, 3 Evi2b-målretning (Sh2, Sh3, Sh4) og 1 ikke-rettet mod ikke-silencing kontrol (NSC1) shRNAs blev designet; disse blev klonet i en lentiviral vektor transporterer en normal god landbrugspraksis reporter16. 32 d/G-CSF-R celler blev transduced med kontrol- og Evi2b-hæmning shRNAs ved hjælp af et MOI af 10. To dage efter transduktion, blev normal god landbrugspraksis+ (transduced) celler sorteret og udvidet til yderligere forsøg. I tilfælde af Sh3 og Sh4, nåede EVI2B udtynding 80%, men Sh2 kunne ikke effektivt nedregulere EVI2B protein niveauer, og derfor blev brugt som en ekstra kontrol nævnt her som ikke silencing kontrol 2 (NSC2). Fire dage efter transduktion, differentiering og spredning assays blev udført i G-CSF, og virkningerne af Evi2b downregulation i disse processer blev evalueret. Det blev bemærket, at Evi2b-forarmet celler (Sh2, Sh3) vedvarende celledelingen i overværelse af GCSF, hvorimod kontrol celler (NSC1 og NSC2) reduceret spredning omkring dag 4 (figur 3A). Yderligere, Evi2b-lyddæmpet 32 d/G-CSF-R celler produceres færre mellemliggende og modne neutrofiler i forhold til kontrol celler (figur 3B). Bemærkelsesværdigt, celler transduced med NSC2, som påvist dårlig Evi2b knockdown effektivitet, viste også mindre reduktion i antallet af modne neutrofile (figur 3B). Disse data blev nyligt offentliggjorte16.

BCR-ABL fusion protein forringer neutrophilic differentiering i 32 d/G-CSF-R celler

Det har vist sig at BCR-ABL fusion protein forringer myeloide differentiering, forårsager en omfattende udvidelse af myeloide stamceller, som resulterer i hæmatopoietisk fiasko i den akutte fase af kronisk myeloid leukæmi25,26. Tidligere undersøgelser viste, at tvungen udtryk i BCR-ABL i 32D cl-3 celler resulterede i en blok af neutrofile differentiering27,28. Vi undersøgte derfor, om lignende resultater kan opnås med 32 d/G-CSF-R cellelinie. 32 d/G-CSF-R celler blev transduced med BCR-ABL eller kontrol MSCV retroviral vektor transporterer en normal god landbrugspraksis reporter (MOI = 20). 2 dage efter transduktion, blev normal god landbrugspraksis+ celler sorteret og udvidet i 2 uger i IL-3 indeholdende medium. Næste, differentiering assays blev udført i G-CSF. Vi observerede at på dag 0 (før du overfører cellerne til G-CSF indeholdende medium), MSCV kontrol og BCR-ABL udtrykker 32 d/G-CSF-R celler præsenteret lignende morfologi, som hovedsagelig repræsenterer umodne myeloide blast celler (figur 4). Men vi viste, at mens Tom vektor transduced kontrol celler ikke undergik neutrophilic differentiering efter 6 dage med G-CSF behandling (der producerer 11,5% af modne neutrofile og 56.4% af intermediately differentierede celler), modne neutrofile blev genereret fra BCR-ABL-transduced 32 d/G-CSF-R celler (figur 4). Konsekvent, forblev procentdelen af umodne blast i BCR-ABL udtrykker celler i G-CSF svarende til procentdelen af blast i IL-3 betingelser.

Figure 1
Figur 1. Repræsentative billeder af forskellige 32 d/G-CSF-R celle morfologi. 32 d/G-CSF-R celler morfologisk kan klassificeres som blast, intermediately differentierede celler og modne neutrofiler. Se tabel 4 beskrivelse.

Figure 2
Figur 2. Spredning og differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. (A) spredning af 32 d/GCSFR celler i 10 ng/mL IL-3 (sort streg) eller 100 ng/mL G-CSF (blå linje), der indeholder medium. X-aksen repræsenterer dages behandling. Y-aksen er vist i logaritmisk skala (log2) og angiver antallet af celler × 105. Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 3 uafhængige forsøg. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. (B) differentiering af 32 d/G-CSF-R celler i G-CSF-holdige medium (100 ng/mL). I det øverste panel, pie-plots vise procentdel af Blaster (sort), intermediately differentierede celler (pink), og neutrofile (rød) i kultur efter 0, 2, 4 og 6 dage af G-CSF behandling. Nederste panel indeholder repræsentative billeder af cytospun celler fra de respektive tid point farves med maj-Grünwald Giemsa. Mindst 100 celler blev evalueret for hvert tidspunkt.

Figure 3
Figur 3. Evi2b hæmning blokerer neutrophilic differentiering i 32 d-G-CSF-R celler. (A) spredning af Evi2b-lyddæmpet (orange linjer) og kontrol (sorte linjer) 32 d/G-CSF-R celler i 100 ng/mL G-CSF indeholdende medium. X-aksen repræsenterer dages behandling. Y-aksen er vist i logaritmisk skala (log2) og angiver antallet af celler × 105. Resultaterne viser et repræsentativt resultat af 3 uafhængige forsøg. (B) vurdering af differentiering af 32 d/G-CSF-R celler transduced med Evi2b-hæmning og kontrol shRNAs i G-CSF-holdige medium (100 ng/mL) ved hjælp af maj-Grünwald Giemsa farvning af cytospun celler. I øverste panel, pie-plots vise procentdel af Blaster (sort), intermediately differentierede celler (pink), og neutrofile (red) i kultur. Panelerne lavere indeholder repræsentative billeder af cytospun celler. Differentiering blev vurderet på dag 7 i differentiering. Mindst 100 celler blev evalueret for hver betingelse.

Figure 4
Figur 4. Overekspression af BCR-ABL fusion protein forringer differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. Vurdering af differentiering af 32 d/G-CSF-R celler transduced enten med MSCV eller BCR-ABL fusion gen i G-CSF-holdige medium (100 ng/mL). Øvre pie-plots viser andelen af Blaster (sort), intermediately differentierede celler (pink), og neutrofile (røde) på dag 6 i differentiering. Panelerne lavere Vis repræsentative billeder af cytospun celler farves med maj-Grünwald Giemsa. Mindst 100 celler blev evalueret for hvert tidspunkt.

Virus V [µL] Antallet af celler, forgyldt % Normal god landbrugspraksis+ Normal god landbrugspraksis+ celletal Lineær? TU/mL Gennemsnit (TU/mL)
1 100 000 1.83 1 830 Ja 1 830 000 2 350 000
5 100 000 12,9 12 900 Ja 2 580 000
10 100 000 26.4 26 400 Ja 2 640 000
50 100 000 71.4 71 400 Nej
100 100 000 85,1 85 100 Nej
500 100 000 85,6 85 600 Nej

Tabel 1. Viral titer bestemmelse for normal god landbrugspraksis reporter indeholdende vektorer. Eksempel på oplysninger indhentet med de MSCV retrovirus og beregningen udføres til at anslå den virale titer. Viral titer blev beregnet på baggrund af antallet af normal god landbrugspraksis+ celler erhvervet når visse beløb af virus blev anvendt. Mængden af virus ansat for infektion bør være i en lineær korrelation med procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler målt. TU: omdanne enheder.

Tube Tube beskrivelse DMEM + 10% FBS Virus Samlede volumen Fortyndingsfaktoren
(ΜL) (ΜL) (ΜL)
1 fortynding 1 1485 15 µL viral lager 1500 1 x 102
2 fortynding 2 1350 150 µL rør 1 1500 1 x 103
3 fortynding 3 1350 150 µL tube 2 1500 1 x 104
4 fortynding 4 1350 150 µL rør 3 1500 1 x 105
5 fortynding 5 1350 150 µL tube 4 1500 1 x 106

Tabel 2. Viral titer bestemmelse for puromycin reporter indeholdende vektorer. Viral fortynding strategi til at bestemme den virale titer i puromycin indeholdende vektorer. Tabel angiver, hvordan du forbereder 5 rør (1-5) indeholdende en seriel fortynding af viral bestanden. Rør 1 indeholder 1485 µL DMEM + 10% FBS og 15 µL af den producerede virus, giver et 1 × 10-2 fortyndet virus. Rør 2 indeholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL af 1 × 10-2 fortyndet virus (Tube 1), at give en 1 × 103 fortyndet virus. Rør 3 indeholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL af 1 × 103 fortyndet virus (Tube 2), at give en 1 × 104 fortyndet virus. Tube 4 indeholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL af 1 × 104 fortyndet virus (Tube 3), at give en 1 × 105 fortyndet virus. Rør 5 indeholder 1350 µL DMEM + 10% FBS og 150 µL af 1 × 10-5 fortyndet virus (Tube 4), at give en 1 × 10-6 fortyndet virus. 1 ml fra rør 1-5 anvendes til titer virus.

Celle tæller (x = antallet af celler pr. ml)
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prøve 1 x0 x1 x2 x3 x4 x5 x6
Fortynding (d) (y = rumfang af celler til replating [mL]; z = endelige mængden [mL])
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prøve 1 d0= 1 d1= y1/z1 d2= y2/z2 d3= y3/z3 d4= y4/z4 d5= y5/z5
Samlede celletal
dag 0 dag 1 dag 2 dag 3 dag 4 dag 5 dag 6
Prøve 1 x0 x1 d0 x2d1 x3d2d1 x4d3/d2d1 x5d4d3/d2d1 x6d5d4d3/d2d1

Tabel 3. Vækst kurve generation. Tabellen beskriver ligninger nødvendigt for vurdering af spredning sats på 32 d/G-CSF-R celler.

Nucleus Cytoplasmaet
Eksplosionerne Mørk, afrundede Mørke, næsten ikke skelnes fra nucleus
Intermediately opdelte celler Udtales ændringer i nukleare form, ofte doughnut-lignende eller Månen-lignende formet Lettere, skelne cytoplasma
Modne neutrofile Lobulated kernen; næsten ingen forbindelser mellem lobules Lys cytoplasma

Tabel 4. 32 d/G-CSF-R celle morfologi under neutrophilic differentiering. I tabel opsummerer store morfologiske funktioner, der aktiverer skelnen af umodne Blaster, intermediately differentierede celler og modne neutrofile. Nukleare og cytoplasmatisk karakteristika er beskrevet. Se figur 1 for repræsentative billeder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Valget af en eksperimentel model er en af de vigtigste spørgsmål i forskning. Selvom primære dyre- og humane celler menes at producere de mest biologisk relevante data, disse modeller kan inddrage etiske overvejelser og er ofte forbundet med dyre og/eller sofistikeret isolation/dyrkning procedurer. Primærelementer er begrænset i antal og det er svært at genmanipulere dem. Derudover repræsenterer primærelementer en heterogen population bestående af forskellige celletyper, som kan komplicere data fortolkning29. Derimod cellelinjer giver en næsten ubegrænset kilde til biologisk materiale, er omkostningseffektiv, og gør det muligt for at omgå de etiske spørgsmål. Det er dog vigtigt at tage hensyn til cellen linjer anses for at være en kunstig eksperimentel system, som kan genetisk og fænotype adskiller sig fra deres væv af oprindelse. Ikke desto mindre cellelinjer når de kombineres med andre eksperimentelle metoder, giver en værdifuld model for generation af reproducerbar og biologisk relevante data.

32 d/G-CSF-R cellelinie, samt 32D cl-3 celler, er veletableret og udbredt celle kultur modeller af murine neutrophilic differentiering14,15,24,30. Flere forskergrupper har anvendt disse celler til at vurdere bestemte gener i myelopoiesis rolle, og opnåede resultater, der korreleret med data indhentet ved hjælp af i vivo modeller og primærelementer16,31. Her vi leverer en protokol for håndtering af 32 d/G-CSF-R cellelinie, men lignende procedurer kan anvendes til dyrkning og manipulere 32D cl-3 celler. Det er vigtigt at påpege, at forskellige batches af 32D cl-3 celler anvendes i forskellige laboratorier nuværende forskelle i karyotype, tyder på, at forskellige grupper kunne arbejde med deres egen subclones32. Baseret på denne observation, hypotesen vi, at genetisk variation kan ligeledes være til stede i 32 d/G-CSF-R celler, og dette skal tages i betragtning, når man sammenligner resultaterne opnået ved forskellige forskergrupper. Alternative celle kultur modeller til 32 d/G-CSF-R celler er udødeliggjort hæmatopoietisk stamfader linjer22,33,34,35,36. Denne fremgangsmåde er nyttig, når store stamfader ekspansion er påkrævet, for eksempel for at studere protein interaktioner22. En fordel at 32 d/G-CSF-R celler er at udødeliggjort stamfaderen kan oprettes fra enhver genmodificerede mus, selv om tid til at etablere linjen er betydeligt lang37. Derudover kræver håndtering og manipulation af knoglemarven udødeliggjort stamfaderen mere ekspertise end 32 d/G-CSF-R celler.

For at orientere læseren med 32 d/G-CSF-R-model i den første del af de repræsentative resultater viste vi spredning og differentiering kinetik af 32 d/G-CSF-R celler IL-3 og G-CSF. Repræsentative billeder demonstrere morfologi af celler i IL-3 prolifererende betingelser og på forskellige tidspunkter af GCSF-induceret differentiering blev præsenteret. Vi vurderede neutrophilic differentiering af morfologisk analyse, men det er blevet rapporteret, at 32D cl-3 Celledifferentiering kan bestemmes ved flow cytometric analyse ved hjælp af den CD11b celle overflade markør27,31, 38,39. Vores viden og ekspertise er CD11b ikke upregulated under neutrophilic differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. For standardisering, i 32 d/G-CSF-R spredning assays ansat vi kommercielt tilgængelige IL-3. Imidlertid konstaterede vi, at celler formere sig godt i hjemmelavet IL-3, fremstillet som beskrevet af Drobek og kolleger22. For at opnå en god grad af G-CSF-induceret neutrophilic differentiering, er det vigtigt at huske, at muligheden for differentiering af 32 d/G-CSF-R celler kan være nedsat, hvis celler er kulturperler over en koncentration på 1 × 106 celler/mL. Derudover kan grad og hastighed af differentiering blive påvirket af serum sammensætning. Det anbefales derfor, at teste muligheden for differentiering af 32 d/G-CSF-R celler i flere FBS partier, og vælg den, der bedre understøtter udviklingen af modne neutrofile på 6-9 dage af kultur i G-CSF.

Vi leveret to repræsentative eksperimenter viser mulige måder at studere rollen af bestemte proteiner i myeloide differentiering (figur 3 og figur 4). Først, vi viste, at downregulation af EVI2B, en transmembrane protein udtrykt i hæmatopoietisk celler, fører til en blok af myeloide differentiering i 32 d/G-CSF-R celler. Disse data blev for nylig udgivet af vores gruppe, i kombination med assays udføres ved hjælp af primærelementer og Evi2b knockout mus16. Andet, vi undersøgte effekten af BCR-ABL, en fusion protein som følge af den genetiske translokation t(9,22) (q34; SP11), neutrophilic differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. Denne translokation blev oprindeligt identificeret i patienter lider af kronisk myeloid leukæmi40,41. Det var tidligere vist at udtryk for BCR-ABL fusion oncoprotein i 32D cl-3 celler fører til en myeloid differentiering anholdelse27,28. Her viste vi, at BCR-ABL overekspression har lignende virkninger på 32 d/G-CSF-R celler. I begge sæt af eksperimenter præsenteres her (med Evi2b downregulation og BCR-ABL overekspression), genetisk modifikation af 32 d/G-CSF-R celler blev udført gennem viral transduktion, hvilket resulterer i stabil genekspression. Valg af retroviral versus lentiviral levering påvirker ikke spredning eller differentiering af 32 d/G-CSF-R celler. Men lentiviral infektion er mere effektiv end retroviral transduktion på grund af tilstedeværelsen af endogene retrovirus i 32 d/G-CSF-R celler. Ifølge vores erfaring er Transfektion af disse celler ved hjælp af standard lipofile reagenser ikke effektive. Men hvis forbigående konstruere udtryk er nødvendig, Transfektion af elektroporation er en levedygtig fremgangsmåde42,43,44. Her, vi præsenterede genmanipulation af 32 d/G-CSF-R celler efterfulgt af normal god landbrugspraksis sortering og bulk analyse af de inficerede celler. Men hvis det er nødvendigt, enkelt celle sortering kunne anvendes til at generere enkelt celle kloner som tidligere rapporteret12,45.

Ud over spredning og differentiering assays, har 32 d/G-CSF-R celler været ansat til korrekt bestemme rollen, som visse proteiner i celle migration og apoptose13,46,47,48 . Yderligere, 32 d/G-CSF-R linje har været brugt til at bestemme cytokin uafhængige vækst medieret af oncoproteins19,20. En anden linje ofte brugt til at studere cytokin uafhængighed er Ba/F3 celler21,49. BA/F3 er en IL-3 afhængige murine cellelinje stammer fra C3H mus stamme, på samme måde-32 d/G-CSF-R celler. Selv om begge systemer kan anvendes til at studere cytokin uafhængige spredning, differentiere Ba/F3 celler dårligt i G-CSF.

Helt, foreslår vi, at 32 d/G-CSF-R celler, men bliver mindre foretrukne end primærelementer, tilbyder flere fordele, herunder ubegrænset spredning kapacitet og enkel håndtering. Vi mener, at for generation af pålidelige data, eksperimenter udført i 32 d/G-CSF-R celler bør suppleres med data anskaffes ved hjælp af alternative eksperimentelle metoder såsom murine modeller og primære kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Prof. Ruud Delwel og Prof. Ivo Touw for at give os med 32 d/G-CSF-R cellelinie og Prof. Daniel G. Tenen for at forsyne os med linjen Bosc23 celle. Dette arbejde blev støttet af tilskud af Grant agenturet af Den Tjekkiske Republik (GACR 15-03796S og GACR 17-02177S) til MA-Jørgensen, støtte fra Institut for molekylær genetik af det tjekkiske Videnskabsakademi (RVO 68378050) til MA-J, en GA UK fellowship (projekt nr. 341015) fra Charles Universitet i Prag til MK og en GA UK fellowship (projekt nr. 1278217) fra Charles Universitet i Prag til PD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 powder medium Merck, Kenilworth, NJ, USA T 121-10 without NaHCO3, with L-glutamine
DMEM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15028
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 31985-047 L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) MT35011CV For differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270 Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
Penicillin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) P3032
Streptomycin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) S9137 Streptomycin sulfate salt powder
Gentamicin Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) G1914
murine IL-3 PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 213-13
human G-CSF PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 300-23
Polyethylenimine Polyscience, Warrington, PA, USA 23966 Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
Polybrene Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) H9268
Trypsin VWR Chemicals, Radnor, PA, USA 0458
EDTA Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) E5134
Crystal violet Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) C0775
Trypan blue Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) D2650
May-Grünwald Giemsa DiaPath, Martinengo, BG, Italy 10802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 132 32 d/G-CSF-R celler murine myeloide prækursorer celler flydende kultur differentiering neutrofiler spredning cytokiner IL-3 G-CSF
Spredning og differentiering af Murine myeloide prækursorer 32 d/G-CSF-R celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zjablovskaja, P., Danek, P.,… More

Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (132), e57033, doi:10.3791/57033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter