Summary
Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.
Abstract
Comprensione della biologia delle cellule staminali e progenitrici ematopoietica ha implicazioni importanti per la medicina rigenerativa e il trattamento delle patologie ematologiche. Nonostante i dati più rilevanti che possono essere acquistati utilizzando modelli in vivo o colture primarie, la scarsa abbondanza di cellule staminali e progenitori emopoietici limita considerevolmente la piscina delle tecniche idonee per le loro indagini. Pertanto, l'uso di linee cellulari permette una produzione sufficiente di materiale biologico per l'esecuzione di proiezioni o saggi che richiedono numeri di grandi cellule. Qui presentiamo una descrizione dettagliata, lettura e interpretazione delle analisi di proliferazione e differenziazione che vengono utilizzati per l'indagine dei processi coinvolti nella mielopoiesi e differenziazione neutrophilic. Questi esperimenti utilizzano la linea cellulare mieloide murino dipendente 32D/G-CSF-R citochina, che possiede la capacità di proliferare in presenza di IL-3 e si differenziano in G-CSF. Forniamo ottimizzato protocolli per la gestione delle cellule 32D/G-CSF-R e discutere problemi e inconvenienti che potrebbero compromettere l'analisi descritte e risultati attesi. Questo articolo contiene inoltre protocolli per produzione retrovirale e lentivirale, titolazione e trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R. Dimostriamo che la manipolazione genetica di queste cellule può essere impiegato per eseguire con successo gli studi molecolari e funzionali, che possono integrare i risultati ottenuti con le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche primarie o modelli in vivo .
Introduction
La popolazione di staminali e progenitrici ematopoietica fornisce l'organismo con una vasta gamma di cellule mature, tra cui cellule della linea mieloide (neutrofili, eosinofili, basofili e monociti). Il processo che spinge la produzione di cellule mieloidi da cellule staminali ematopoietiche è noto come mielopoiesi, e un'adeguata produzione di cellule mieloidi mature in risposta alle mutevoli esigenze è un prerequisito per il corretto superamento dell'organismo allo stress condizioni, come le infezioni e la perdita di sangue. Insufficiente produzione di cellule mieloidi mature può portare all'incapacità di eliminare gli agenti patogeni, la coagulazione del sangue ridotto e altre pericolose condizioni1,2. Inoltre, alterazioni nello sviluppo della linea mieloide possono anche essere associate con le malignità ematologiche, quali la leucemia mieloide acuta (AML)3. Alterazioni nella mielopoiesi possono verificarsi a causa di vari motivi, come difetti di cellule recettori di superficie4, alterate espressione di fattori di trascrizione5, alterata segnalazione percorsi6, mutazioni conseguente formazione / attivazione di oncogeni7o inattivazione di geni di tumore soppressore8.
Vari metodi sono stati sviluppati per studiare sviluppo mieloide e valutare l'effetto di specifiche alterazioni genetiche in questo processo. Approcci comuni usati per studiare la mielopoiesi coinvolgono cellule primarie e topi transgenici. Se questi modelli consentono l'acquisizione di dati biologicamente rilevanti, essi hanno alcune limitazioni. L'utilizzo di cellule primarie incontra un numero limitato di cellule e un limitato periodo di cultura, restringere le possibilità per alterare l'espressione genica e la successiva analisi biologica o biochimica. Topi transgenici sono costosi e richiedono un grado ragionevole di giustificazione biologica. Inoltre, l'utilizzo di modelli in vivo aggiunge un grado di complessità nella comprensione del ruolo di un gene di interesse in un determinato processo. Pertanto, sono necessari approcci alternativi per aggirare queste limitazioni. Linee cellulari hanno indiscutibili vantaggi: (1) possiedono capacità di proliferazione illimitata che permette di generare abbastanza materiale per studi biochimici e biologici, (2) essi sono suscettibili di manipolazioni genetiche (atterramento, ad eliminazione diretta, sovraespressione), (3) il costo è relativamente basso, e (4) consentono un certo grado di semplificazione biologica necessaria in alcuni approcci sperimentali.
Parentale IL-3 (interleuchina-3) dipendente 32D linea cellulare è stata fondata nel 1983 da Greenberger e colleghi tramite l'infezione di cellule del midollo osseo da topi C3H/HeJ con amico leucemia murina virus9. 32D diversi cloni sono stati descritti in letteratura: cl-239, cl-310e cl-1011. Le cellule di cl-3 32D sono state indicate per proliferare in IL-3 e subire la differenziazione neutrophilic previo trattamento con granulocyte-colonia stimolazione fattore (G-CSF)10. Al contrario, 32D cl-10 cellule, pur essendo dipendente di IL-3, non sono stati originariamente distinguendo in risposta al trattamento di G-CSF. Nel 1995 il gruppo del Dr. Ivo Touw retrovirally trasdotte 32D cl-10 cellule con wild type e forme mutanti del recettore del G-CSF (G-CSF-R), al fine di identificare le aree funzionalmente importanti di questo recettore11. Questo studio ha provocato la generazione delle cellule 32D/G-CSF-R, che sono allo stesso modo dipendenti IL-3, ma entro 6-10 giorni dopo il rimontaggio di IL-3 con G-CSF, le cellule smettono di proliferare e differenziarsi irreversibilmente in neutrofili maturi. Queste proprietà rendono 32D cl-3 e cellule 32D/G-CSF-R modelli semplificati di differenziazione neutrophilic murina che può essere modulata da due ben definito fattori di crescita e differenziazione - IL-3 e G-CSF. Durante gli ultimi decenni più gruppi hanno utilizzato cellule 32D/G-CSF-R per studiare il ruolo dei geni particolari nella proliferazione e differenziazione delle cellule mieloidi in cultura12,13,14,15 , 16e per lo studio di G-CSF, segnalazione17,18. D'importanza, i risultati ottenuti con questa linea cellulare correlate con i dati ottenuti con le cellule primarie e topi transgenici16,19,20,21. Di conseguenza, crediamo che cellule 32D/G-CSF-R, essendo un modello ampiamente usato e ben consolidato, rappresentano un sistema prezioso per lo studio del differenziamento mieloide che può essere utilizzato in parallelo con altri approcci questa domanda.
Qui, protocolli dettagliati che descrivono la gestione della linea cellulare 32D/G-CSF-R, quale espansione di copertura, la differenziazione e valutazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule è presentato. Vengono fornite informazioni dettagliate per la modificazione genetica di cellule 32D/G-CSF-R, mediante trasduzione retrovirale o lentivirali, così come protocolli per titolazione del virus. Inoltre, vengono forniti diversi risultati rappresentativi che illustrano le potenziali applicazioni delle cellule 32D/G-CSF-R.
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Protocol
Nota: Passaggi che descrivono espansione, differenziazione e trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R sono presentati qui di seguito.
1. preparazione
- Preparazione dei terreni
- Preparare 250 mL di terreno di coltura: medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 supplementato con 10% calore inattivato FBS (siero fetale bovino) e murini IL-3 (10 ng/mL).
- In alternativa, utilizzare IL-3 fatta in casa. Per produrre IL-3 casalingo, trasduce cellule HEK293 con il vettore di espressione di IL-3 e raccogliere IL-3 contenente surnatante22.
Nota: Gli antibiotici, quali penicillina G (100 UI/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e gentamicina (40 µ g/mL), può essere utilizzati per la coltura di cellule in qualsiasi fase del protocollo se non diversamente specificato.
- In alternativa, utilizzare IL-3 fatta in casa. Per produrre IL-3 casalingo, trasduce cellule HEK293 con il vettore di espressione di IL-3 e raccogliere IL-3 contenente surnatante22.
- Preparare 50 mL di mezzo di differenziazione: medium RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e G-CSF umano (100 ng/mL).
Nota: (Importante) non tutti i batch di siero supportano la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R. Prima dell'inizio di esperimento testare diversi lotti di siero. Si consiglia di testare almeno 4 diversi lotti e selezionare l'ottimale basato sulla capacità delle cellule 32D/G-CSF-R per differenziare. Vedi protocollo di differenziazione 32D/G-CSF-R qui sotto. - Preparare 10 mL di medium di congelamento: medium RPMI 1640 supplementato con 40% FBS e 10% DMSO (dimetilsolfossido).
- Preparare 250 mL di terreno di coltura: medium RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 supplementato con 10% calore inattivato FBS (siero fetale bovino) e murini IL-3 (10 ng/mL).
- Produzione del retrovirus
- Piastra di una sospensione unicellulare di cellule Bosc23 (6 × 10-6) in una capsula Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM (di per volta Eagle di Dulbecco Medium) contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h).
Nota: Le cellule devono crescere in un monostrato e non forma grumi nella cultura. Conta cellulare può essere eseguita utilizzando diversi metodi (validi per il resto dei protocolli presentato qui). In caso di basso numero di campioni, conteggio manuale sotto il microscopio con camera di Bürker è raccomandato. In questo caso, utilizzare Trypan blu per l'esclusione delle cellule morte. Mescolare cellule 1:1 con 0,4% Trypan Blue in PBS. Per eseguire il conteggio del numero elevato di campioni, un contatore di cellule automatico può essere impiegato. - Unire 40 µ g di retroviral costrutto (ad esempio MSCV), 20 µ g di pCL-Eco (packaging vettoriale)23, 80 µ l di PEI (polyethylenimine) e 2 mL di siero ridotto medio (ad es. Opti-MEM) medio (senza antibiotici). Incubare la miscela per 20 min a temperatura ambiente (TA).
- Sostituire con attenzione medie cellule Bosc23 con 16 mL DMEM completate con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso.
Nota: Non utilizzare antibiotici durante la transfezione, poiché può ridurre l'efficienza di trasfezione. - Aggiungere la miscela preparata in 1.2.2. goccia a goccia e attentamente la Bosc23 cultura e incubare per 4 h a 37 ° C. Incubazione di limite a meno di 6 h a causa di tossicità di PEI.
- Dopo l'incubazione, cambiare la sostanza Bosc23 a 18 mL pre-riscaldati DMEM contenente 10% FBS e coltivare le cellule per 48 h a 37 ° C. Posizionare i piatti in un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, tenere qui a partire da questo punto e seguire le procedure standard di sicurezza.
- Bosc23 medio (contenente ecotropic di particelle retrovirali) usando una pipetta sierologica di 25 mL in una provetta conica da 50 mL di raccogliere e conservare a 4 ° C.
Nota: L'efficienza di trasfezione (importante) dovrebbe raggiungere il 90% per produrre un virus di alto titolo. - Aggiungere mL 18 pre-riscaldati DMEM 10% FBS per Bosc23 cellule e coltivare per 24 h.
- Ripetere il punto 1.2.6.
Nota: I surnatanti retrovirali da 1.2.6 e 1.2.8 possono essere pool quando raggiungono la stessa temperatura (4 ° C) per mantenere l'integrità virale. - Per evitare la contaminazione di Bosc23 in surnatanti virali, spin virus raccolti a 1500 × g per 10 min a 4 ° C. Aliquotare virus, snap congelamento con azoto liquido o ghiaccio secco e conservare a-80 ° C. Si noti tuttavia che il virus preparato al momento è di qualità superiore in termini di efficienza di infezione rispetto gli stock congelati.
Nota: (Importante) evitare ripetuti di congelamento/scongelamento del virus, poiché conduce alla degradazione virale.
- Piastra di una sospensione unicellulare di cellule Bosc23 (6 × 10-6) in una capsula Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM (di per volta Eagle di Dulbecco Medium) contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h).
- Produzione di lentivirus
- Piastra di una sospensione unicellulare di HEK293T (rene embrionale umano 293T) cellule (6 × 10-6) in una capsula di Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h).
Nota: Le cellule devono crescere in un monostrato e non forma grumi nella cultura. - Combinare 15 µ g di costrutto lentivirale (ad esempio pGhU6), imballaggio pCMVdR8.74 di plasmidi (codifica per gag/pol, 12 µ g) e pMD2.VSVG (codifica per VSV-G, 1,4 µ g), PEI 85,2 µ l e 2 mL di siero ridotto medio (senza antibiotici). Incubare la miscela per 20 minuti a TA.
- Sostituire con attenzione HEK293T medio con 16 mL di DMEM completate con 2% FBS. Pre-riscaldare il mezzo a 37 ° C prima dell'uso. Non usare antibiotici durante la transfezione, poiché può ridurre l'efficienza di trasfezione.
- Attentamente la miscela preparata in 1.3.2 alla coltura delle cellule HEK293T di goccia e incubare per 4 h a 37 ° C. Limitare la durata di incubazione per entro 6 ore per impedire la tossicità di PEI.
- Medio di cambiamento-18 mL pre-riscaldati DMEM 10% FBS e coltivare le cellule per 48 h a 37 ° C. Posizionare i piatti in un laboratorio di livello 2 di biosicurezza, tenere qui a partire da questo punto e seguire le procedure standard di sicurezza.
- HEK293T medio (contenenti amphotropic particelle lentivirali) usando una pipetta sierologica di 25 mL in una provetta conica da 50 mL di raccogliere e conservare a 4 ° C.
Nota: L'efficienza di trasfezione (importante) dovrebbe raggiungere il 90% per produrre un virus di alto titolo. - Aggiungere con cautela 18 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS alle cellule HEK293T. Coltivare per 24 h a 37 ° C.
- Ripetere il punto 1.3.6.
Nota: Una volta che raggiungono la stessa temperatura (4 ° C) per mantenere l'integrità virale pool surnatanti lentivirali da 1.3.6 e 1.3.8. - Per evitare contaminazioni del surnatante virale con cellule di HEK293T, spin virus raccolti a 1500 × g per 10 min a 4 ° C. Aliquotare virus, snap congelamento con azoto liquido o ghiaccio secco e conservare a-80 ° C. Tuttavia, notare che preparata virus è di qualità superiore in termini di efficienza di infezione rispetto gli stock congelati.
Nota: (Importante) evitare ripetuti di congelamento/scongelamento del virus, poiché conduce alla degradazione virale.
- Piastra di una sospensione unicellulare di HEK293T (rene embrionale umano 293T) cellule (6 × 10-6) in una capsula di Petri 16cm e coltivare in 18 mL di DMEM contenente 10% FBS fino alla confluenza della cultura raggiunge l'80% (24 h).
- Titolazione del virus contenente un reporter GFP
- Semi di 1 × 10 cellule di NIH/3T35 a 300 µ l di DMEM 10% FBS per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. 7 pozzetti saranno impiegati per un virus titolo.
- Scongelare i virus a 37 ° C e aggiungere 1, 5, 10, 50, 100 e 500 µ l virus NIH/3T3 culture. Non aggiungere alcun virus nel controllo negativo bene. Coltivare le cellule in presenza di virus per 48 h a 37 ° C.
- Raccogliere le cellule NIH/3T3 utilizzando 30 µ l di tripsina/EDTA (acido etilendiamminotetracetico) (0,25% tripsina, EDTA 0,01% in PBS) e inserire le celle in 250 µ l PBS in un tubo di FACS (ordinamento delle cellule attivate la fluorescenza).
- Determinare la frequenza delle cellule GFP+ da citometria a flusso in ogni campione24. Escludere le cellule morte tramite l'aggiunta di una tintura di vitalità, come Hoechst 33258.
- Calcolare il numero totale di cellule GFP+ (basate sul numero delle cellule placcate e percentuale di cellule GFP+ ) e loro complotto contro il volume di virus usati per l'infezione.
Nota: (Importante) efficienza di infezione raggiunge un plateau, quando vengono applicate le grandi dosi virale. Pertanto, è importante stimare il titolo basato sulle concentrazioni virali in cui l'infezione efficienza si verifica in un intervallo lineare (esempio riportato nella tabella 1). Il numero di cellule GFP+ indica il numero di particelle virali funzionale (TU - unità di trasformazione) in un volume determinato virus. Ricalcolare il numero di TU / mL.
- Titolazione del virus contenente un reporter con puromicina.
- Semi di 5 × 104 cellule NIH/3T3 in 3 mL di DMEM 10% FBS per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti; impiegano 6 pozzi al virus di un titolo. Cultura durante la notte a 37 ° C.
- Giorno successivo diluire virus come indicato nella tabella 2. Per diluire il virus, utilizzare pre-riscaldato DMEM 10% FBS. Non centrifugare.
- Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule NIH/3T3 e aggiungere 1 mL di virus diluito.
- Incubare per una notte a 37 ° C.
- Delicatamente sostituire il mezzo contenente virus con 2 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS e incubare per una notte a 37 ° C.
- Sostituire delicatamente NIH/3T3 medio con 2 mL di pre-riscaldato DMEM 10% FBS contenente con puromicina (2 µ g/mL).
- Coltura a 37 ° C e con attenzione il refresh medio con con puromicina ogni 3 giorni o quando diventa giallo medio.
- A 10-12 giorni dopo l'infezione, aspirare medio da ciascun pozzetto e lavare delicatamente con PBS.
- Macchia con 1 mL di soluzione al cristalvioletto (cristalvioletto di 0,5% a 20% etanolo e dH2O), 2 min a RT e lavare accuratamente con PBS due volte.
- Contare le colonie blu presenti in ciascun pozzetto sotto un microscopio (ingrandimento X4). Nessun colonie dovrebbero essere osservati bene nel controllo negativo.
- Calcolare il numero totale di TU/mL considerando il fattore di diluizione.
2. espansione e manutenzione delle cellule 32D/G-CSF-R
- Se cellule 32D/G-CSF-R sono congelate, prendete un'aliquota e scongelare le cellule in bagnomaria a 37 ° C per 1 min e versare le cellule dal flaconcino direttamente in 10 mL di pre-riscaldato RPMI 1640 supplementato con 10% FBS in un tubo di 15mL. Inverti il tubo 3 volte e rallentare le cellule a 400 × g. rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura contenente IL-3 ad una concentrazione di 0,3 × 106 cellule/mL.
- Concentrazione di crescita cellulare ottimale è 0.25-0.5 × 106 cellule/mL. Dividere le celle ogni 2 giorni, portandoli ad una concentrazione di 0.1-0.2 × 106 cellule/mL.
Nota: Cellule 32D/G-CSF-R (importante) possono parzialmente perdono la loro capacità di differenziare se coltivate a concentrazioni superiori a 1 × 106 cellule/mL. Di conseguenza, è molto importante dividere le celle 32D/G-CSF-R in tempo. - Se necessario, congelare e conservare le aliquote di cella per lunghi periodi di tempo a-80 ° C o in azoto liquido. Rotazione verso il basso 3 × 106 cellule, rimuovere il surnatante e risospendere in 1 mL di medium di congelamento. Tubo posto in un contenitore di congelamento a-80 ° C. Per l'archiviazione a lungo termine, riposizionare le cellule in azoto liquido.
3. trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R
- Celle 32D/G-CSF-R Piastra in piastra a 6 pozzetti ad una concentrazione di 0,3 × 106 cellule/mL.
- Aggiungere la quantità appropriata di virus per raggiungere un MOI (molteplicità di infezione) tra 10 e 40.
Nota: Più alto MOI si tradurrà in una maggiore percentuale di cellule GFP+ così come i livelli elevati di espressione del gene di interesse. Esempio: Per infettare 0,3 × 106 celle con un MOI di 10; 3 × 106 TU dovrà essere aggiunto alle cellule 32D/G-CSF-R. - Aggiungere polybrene alla concentrazione finale 8 µ g/mL e incubare per 6 h a 37 ° C. In alternativa, eseguire la procedura di rotazione-inoculazione: Centrifugare a 1200 × g per 90 min a 30 ° C in una piastra di coltura utilizzando un rotore di swing-secchio e incubare per 3 ore a 37 ° C.
- Cellule di raccogliere, trasferire in una provetta da 15 mL e spin a 450 × g per 5 min (4 ° C).
- Eliminare il supernatante, risospendere le cellule pellettate in 6 mL di terreno di coltura, mettere in un matraccio di cultura cellulare T25 e la coltura a 37 ° C.
- 48 ore più tardi, raccogliere le cellule e li spin a 450 × g per 5 min (4 ° C). Scartare il surnatante.
- In caso di un reporter GFP: posizionare le cellule in 500 µ l di PBS e ordinamento cellule GFP+ utilizzando un sorter di citometria a flusso. In caso di un reporter con puromicina contenente vettoriale: posizionare le cellule nel mezzo di coltura contenente 2 µ g/mL di con puromicina.
- Espandere le celle come necessario per esperimenti e un'ulteriore analisi.
Nota: Le cellule Transduced (opzionale) possono essere congelate in media in un contenitore di congelamento a-80 ° C di congelamento e ulteriormente conservate nell'azoto liquido.
4. 32D/G-CSF-R cella analisi di proliferazione
- Per valutare la proliferazione tasso posto 0.2 × 106 cellule in 1 mL di terreno di coltura e incubare per una notte a 37 ° C.
- Giorno successivo conteggio delle cellule e diluirli torna a una concentrazione di 0,2 × 106 cellule/mL utilizzando il terreno di coltura. Incubare per una notte a 37 ° C. Tenere un registro delle concentrazioni di cella e diluizioni applicati alle culture quotidiane utilizzando la tabella 3.
- Ripetere il passaggio 4.2 per tanti giorni come proliferazione deve essere valutata.
Nota: La lunghezza dei saggi proliferazione dipenderà l'effetto del gene di interesse. In caso di un fenotipo forte, 8-9 giorni potrebbe essere sufficiente osservare un effetto significativo (Vedi Figura 3A). Tuttavia, in caso di un fenotipo più lieve, lunghi periodi di tempo potrebbero essere necessari. - Valutare la crescita delle cellule facendo una curva di proliferazione, come indicato nella tabella 3.
5. 32D/G-CSF-R cella analisi di differenziazione
- Lavare 0,2 × 106 cellule 32D/G-CSF-R due volte con medium RPMI senza citochine.
Nota: I passaggi di lavaggio prima dell'aggiunta di G-CSF nella cultura sono importanti, poiché la presenza di IL-3 residuo potrebbe inibire la differenziazione. - Posizionare le cellule nel mezzo di differenziazione 1 mL (contenente 100 ng/mL G-CSF), in un pozzo 24/piatto, con una concentrazione di cellule di 0,2 × 106 cellule/mL (giorno 0). Cultura durante la notte a 37 ° C.
- Contare il numero di cellule/mL come indicato sopra (punto 1.2.1).
- Cytospin 2-5 × 104 cellule su un vetrino (76 X 26 mm) utilizzando una centrifuga con adattatori necessari a 20 × g.
- Aggiornare le cellule di supporto e piastra di differenziazione ad una concentrazione di 0,2 × 105 cellule/mL su una piastra 24/pozzetti (1 giorno). Scartare la vecchia zolla e procedere il giorno successivo con passo 5.6 con la nuova piastra.
- Nei giorni 2-7, ripetere i passaggi da 5.3 a 5.5. Valutare la proliferazione delle cellule in presenza di G-CSF come descritto nel passaggio 4.
Nota: (Importante) durante il differenziamento, proliferazione cellulare rallenta, quindi dopo 3-4 giorni in presenza di G-CSF è adeguata alle cellule di cultura alle più alte concentrazioni. - Valutare stato di differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R basata sulla morfologia delle cellule.
- Difficoltà cellule dal passaggio 5.4 in metanolo per 5 min a RT e lasciare diapositive asciugare all'aria.
Nota: Diapositive da 0 a 7 al giorno possono essere conservati a RT e fissa contemporaneamente. Allo stesso modo, essi possono anche essere tenuti a RT per periodi più lunghi dopo la fissazione. - Macchia di celle utilizzando May-Grünwald Giemsa che macchia protocollo seguente del produttore.
- Visualizzare cellule marcate utilizzando un microscopio e ingrandimento X40.
- Quantificare il numero di blasti, cellule mediamente differenziate e granulociti maturi utilizzando immagini illustrative sulla descrizione nella tabella 4e Figura 1 .
- Difficoltà cellule dal passaggio 5.4 in metanolo per 5 min a RT e lasciare diapositive asciugare all'aria.
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Representative Results
Proliferazione e la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R
Per valutare la proliferazione di cellule 32D/G-CSF-R condizioni pro-proliferativa e pro-differenziazione, 32D/G-CSF-R cellule sono state coltivate in media che contengono IL-3 e G-CSF, rispettivamente. È stato osservato che le cellule coltivate in medium contenente IL-3 (10 ng/mL) si dividono circa ogni 24 h (Figura 2A). Per la sostituzione di IL-3 con G-CSF (100 ng/mL) proliferazione gradualmente rallentato e fermato dopo 4 giorni (Figura 2A). Inoltre, è stato valutato lo stato di differenziazione delle cellule coltivate in presenza di G-CSF usando le cellule cytospun May-Grünwald Giemsa-macchiata. È stato dimostrato che il giorno 0 (prima dell'inizio del trattamento di G-CSF), le cellule presentano una morfologia myeloblast-come immatura, caratterizzata da un grande nucleo e un citoplasma scuro (Figura 2B). Nel corso del trattamento, viene ridotta la dimensione nucleare e la forma dei cambiamenti di nucleo per una a forma di luna o forma a ciambella. Ulteriormente, il citoplasma è allargato e perde il colore violetto scuro. Dopo 6 giorni di trattamento con G-CSF, cellule presenti segni di differenziazione completa neutrofila, caratterizzata da un nucleo lobulato e un citoplasma violetto chiaro (Figura 2B). La differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R è un processo graduale, dove non tutte le cellule si evolvono verso neutrofili maturi alla stessa velocità esatta. Quantificazione delle cellule in diverse fasi nel corso del differenziamento (vale a dire blast, mediamente differenziato delle cellule e dei neutrofili) è mostrato nella Figura 2B.
Murina Evi2b atterramento blocca neutrophilic differenziazione in cellule 32D/G-CSF-R
Per downregulation di EVI2B (sito di integrazione virale Ecotropic 2B) in cellule 32D/G-CSF-R, 3 Evi2b-targeting (Sh2, Sh3, Sh4) e 1 non-targeting non silenziamento shRNA controllo (NSC1) sono stati progettati; Questi sono stati clonati in un vettore lentivirale che trasportano un GFP reporter16. Cellule 32D/G-CSF-R sono state trasdotte con controllo ed Evi2b-silenziamento shRNA utilizzando un MOI di 10. Due giorni dopo la trasduzione, cellule GFP+ (trasformata) sono state ordinate e ampliate per ulteriori esperimenti. Nel caso di Sh3 e Sh4, EVI2B svuotamento ha raggiunto 80%, tuttavia Sh2 è riuscito a downregulate EVI2B efficientemente i livelli della proteina e quindi è stato usato come un controllo aggiuntivo di cui qui come non-silenziamento controllo 2 (NSC2). Quattro giorni dopo la trasduzione, proliferazione e differenziazione di analisi sono state eseguite in presenza di G-CSF, e sono stati valutati gli effetti della downregulation di Evi2b in questi processi. È stato osservato che Evi2b-cellule impoverite (Sh2, Sh3) hanno sostenuto la proliferazione delle cellule in presenza di GCSF, mentre le cellule di controllo (NSC1 e NSC2) ha ridotto la proliferazione nei dintorni di giorno 4 (Figura 3A). Inoltre, Evi2b-silenziate 32D/G-CSF-R cellule prodotte meno neutrofili intermedi e maturi rispetto alle cellule di controllo (Figura 3B). Notevolmente, cellule trasformate con NSC2, che ha dimostrato scarsa efficienza atterramento di Evi2b , inoltre ha mostrato lieve riduzione del numero di neutrofili maturi (Figura 3B). Questi dati sono stati recentemente pubblicati16.
Proteina di fusione BCR-ABL altera neutrophilic differenziazione in cellule 32D/G-CSF-R
È stato dimostrato che la proteina di fusione BCR-ABL altera la differenziazione mieloide, causando un'ampia espansione dei progenitori mieloidi che genera errore ematopoietiche durante la fase acuta di leucemia mieloide cronica25,26. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l'espressione forzata di BCR-ABL in cellule di cl-3 32D ha provocato un blocco di differenziazione del neutrofilo27,28. Di conseguenza, abbiamo studiato se risultati simili potrebbero essere ottenuti con la linea cellulare 32D/G-CSF-R. Cellule 32D/G-CSF-R sono state trasdotte con BCR-ABL o controllo MSCV vettore retrovirale che trasportano un reporter GFP (MOI = 20). 2 giorni dopo la trasduzione, cellule GFP+ sono state ordinate e ampliate per 2 settimane in contenente il mezzo di IL-3. Successivamente, analisi di differenziazione sono state eseguite in presenza di G-CSF. Abbiamo osservato che al giorno 0 (prima di trasferire le cellule contenente il mezzo di G-CSF), MSCV controllare e BCR-ABL che esprimono le cellule 32D/G-CSF-R presentato morfologia simile, principalmente che rappresentano cellule mieloidi acerbe di blast (Figura 4). Tuttavia, abbiamo dimostrato che mentre il vettore vuoto cellule trasdotte controllo ha subito neutrophilic differenziazione dopo 6 giorni di trattamento di G-CSF (produzione di 11,5% dei neutrofili maturi e 56,4% delle cellule mediamente differenziate), non maturo neutrofili sono stati generati da BCR-ABL-trasdotte 32D/G-CSF-R cellule (Figura 4). Coerentemente, la percentuale di immaturi blast in cellule esprimenti BCR-ABL in G-CSF è rimasta simile alla percentuale di scoppio in condizioni di IL-3.
Figura 1. Immagini rappresentative di distinte 32D/G-CSF-R cella morfologia. Cellule 32D/G-CSF-R possono essere classificati morfologicamente come saltare, mediamente differenziato cellule e neutrofili maturi. Per descrizione, vedere la tabella 4 .
Figura 2. Proliferazione e la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R. (A) proliferazione delle cellule 32D/GCSFR, a 10 ng/mL IL-3 (linea nera) o 100 ng/mL G-CSF (linea blu), che contiene il media. L'asse X rappresenta i giorni di trattamento. L'asse Y viene visualizzata in scala logaritmica (log2) e indica il numero di cellule × 105. Risultati rappresentano la media di 3 esperimenti indipendenti. Barre di errore indicano deviazione standard. (B) differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R a G-CSF-contenente medio (100 ng/mL). Nel pannello superiore, le pie-trame dimostrano la percentuale di blasti (neri), mediamente differenziato cellule (rosa) e neutrofili (rossi) nella cultura dopo 0, 2, 4 e 6 giorni di trattamento di G-CSF. Il pannello inferiore contiene immagini rappresentative delle cellule cytospun dal rispettivo tempo punti colorati con May-Grünwald Giemsa. Un minimo di 100 cellule sono stati valutati per ogni punto di tempo.
Nella figura 3. Evi2b silenziamento Blocca neutrophilic differenziazione in cellule 32D-G-CSF-R. (A) proliferazione di Evi2b-silenziate (linee arancioni) e cellule di controllo (linee nere) 32D/G-CSF-R in contenente il mezzo di 100 ng/mL G-CSF. L'asse X rappresenta i giorni di trattamento. L'asse Y viene visualizzata in scala logaritmica (log2) e indica il numero di cellule × 105. I risultati dimostrano un risultato rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti. (B) valutazione della differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R trasformata con Evi2b-silenziamento e controllo shRNA in mezzo contenente G-CSF (100 ng/mL) utilizzando May-Grünwald Giemsa colorazione delle cellule cytospun. Nel pannello superiore, le pie-trame dimostrare la percentuale di blasti (neri), mediamente differenziato cellule (rosa) e neutrofili (rosso) nella cultura. I pannelli inferiori contengono immagini rappresentative delle cellule cytospun. La differenziazione è stata valutata il giorno 7 di differenziazione. Almeno 100 cellule sono state valutate per ogni condizione.
Figura 4. Sovraespressione della proteina di fusione BCR-ABL altera la differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R. Valutazione di differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R trasdotte con controllo MSCV o gene di fusione BCR-ABL nel mezzo di G-CSF-contenenti (100 ng/mL). Torta-piazzole superiore dimostrare la percentuale di blasti (neri), mediamente differenziato cellule (rosa) e neutrofili (rosso) il giorno 6 di differenziazione. I pannelli inferiori mostrano immagini rappresentative di cytospun cellule colorate con May-Grünwald Giemsa. Almeno 100 cellule sono state valutate per ogni punto di tempo.
| Virus V [µ l] | Numero di celle placcate | GFP+ % | Conteggio delle cellule GFP+ | Lineare? | TU/mL | Media (TU/mL) |
| 1 | 100 000 | 1.83 | 1 830 | Sì | 1 830 000 | 2 350 000 |
| 5 | 100 000 | 12,9 | 12 900 | Sì | 2 580 000 | |
| 10 | 100 000 | 26,4 | 26 400 | Sì | 2 640 000 | |
| 50 | 100 000 | 71,4 | 71 400 | No | ||
| 100 | 100 000 | 85,1 | 85 100 | No | ||
| 500 | 100 000 | 85,6 | 85 600 | No |
Tabella 1. Determinazione del titolo virale per reporter GFP che contengono vettori. Esempio di dati ottenuti con la MSCV retrovirus e calcolo eseguito per stimare il titolo virale. Titolo virale è stato calcolato in base al numero di cellule GFP+ acquisito quando certa quantità di virus è stato applicato. La quantità di virus impiegati per l'infezione dovrebbe essere in una correlazione lineare con la percentuale di cellule GFP+ misurato. TU: trasformazione di unità.
| Tubo | Descrizione del tubo | DMEM + 10% FBS | Virus | Volume totale | Fattore di diluizione |
| (Μ L) | (Μ L) | (Μ L) | |||
| 1 | diluizione 1 | 1485 | Stock virali 15 µ l | 1500 | 1 x 102 |
| 2 | diluizione 2 | 1350 | Tubo 150 µ l 1 | 1500 | 1 x 103 |
| 3 | diluizione 3 | 1350 | Tubo di 150 µ l 2 | 1500 | 1 x 104 |
| 4 | diluizione 4 | 1350 | Tubo di 150 µ l 3 | 1500 | 1 x 105 |
| 5 | diluizione 5 | 1350 | Tubo 150 µ l 4 | 1500 | 1 x 106 |
Tabella 2. Determinazione del titolo virale per reporter con puromicina contenenti vettori. Strategia virale diluizione per determinarne il titolo virale in contenenti vettori con puromicina. Tabella indica come preparare 5 tubi (1-5) contenente una diluizione seriale dello stock virali. Tubo 1 contiene 1485 µ l DMEM + 10% FBS e 15 µ l del prodotto virus, fornendo un 1 × 102 diluito virus. Tubo 2 contiene 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l di 1 × 102 diluito virus (filmato 1), fornendo un virus diluito di3 × 10 1. Tubo 3 contiene 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l di 1 × 103 diluito virus (tubo 2), fornendo un virus di diluito4 × 10 1. Tubo 4 contiene 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l di 1 × 104 diluito virus (tubo 3), fornendo un virus diluito di5 × 10 1. Tubo 5 contiene 1350 µ l DMEM + 10% FBS e 150 µ l del 1 × 105 diluito virus (filmato 4), fornendo un virus diluito di 1 × 106 . 1 ml da tubi 1-5 è utilizzato per titolo il virus.
| I conteggi delle cellule (x = numero di cellule per ml) | |||||||
| giorno 0 | 1 ° giorno | 2 ° giorno | 3 ° giorno | giorno 4 | giorno 5 | 6 ° giorno | |
| Campione 1 | x0 | x1 | x2 | x3 | x4 | x5 | x6 |
| Diluizione (d) (y = volume di celle utilizzate per ricromatura [mL]; z = volume finale [mL]) | |||||||
| giorno 0 | 1 ° giorno | 2 ° giorno | 3 ° giorno | giorno 4 | giorno 5 | 6 ° giorno | |
| Campione 1 | d0= 1 | d1= y1/z1 | d2= y2/z2 | d3= y3/z3 | d4= y4/z4 | d5= y5/z5 | |
| Conteggio totale delle cellule | |||||||
| giorno 0 | 1 ° giorno | 2 ° giorno | 3 ° giorno | giorno 4 | giorno 5 | 6 ° giorno | |
| Campione 1 | x0 | x1 /d0 | x2/d1 | x3/d2/d1 | x4/d3/d2/d1 | x5/d4/d3/d2/d1 | x6/d5/d4/d3/d2/d1 |
Tabella 3. Generazione della curva di crescita. La tabella descrive equazioni necessarie per la valutazione del tasso di proliferazione di cellule 32D/G-CSF-R.
| Nucleo | Citoplasma | |
| Blasti | Scuro, arrotondati | Scuro, quasi indistinguibile dal nucleo |
| Mediamente differenziato cellule | Cambiamenti pronunciati nella forma nucleare, spesso ciambella-come o a forma di luna-come | Citoplasma più leggero, distinguibile |
| Neutrofili maturi | Lobulated nucleo; quasi nessun collegamento tra i lobuli | Citoplasma chiaro |
Tabella 4. morfologia delle cellule 32D/G-CSF-R durante il differenziamento neutrophilic. La tabella riassume le principali caratteristiche morfologiche che consente la distinzione di blasti immaturi, cellule mediamente differenziate e neutrofili maturi. Vengono descritte le caratteristiche nucleari e citoplasmatiche. Vedere la Figura 1 per immagini rappresentative.
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Discussion
La scelta di un modello sperimentale è uno dei principali problemi nella ricerca. Anche se le cellule animali e umane primarie sono credute per produrre i dati più biologicamente rilevanti, questi modelli possono comportare preoccupazioni etiche e sono spesso associati a procedure costose e/o sofisticato isolamento/coltura. Cellule primarie sono limitate in numero e si stenta a manipolarle geneticamente. Inoltre, le cellule primarie rappresentano una popolazione eterogenea composta da vari tipi di cellule che possono complicare l' interpretazione di dati29. Al contrario, linee cellulari forniscono una fonte praticamente illimitata di materiale biologico, sono efficaci e consentono di ignorare le questioni etiche. Tuttavia, è importante prendere in considerazione tale cella linee sono considerati un sistema sperimentale artificiale, che può geneticamente e fenotipicamente differiscono dal loro tessuto di origine. Tuttavia, le linee quando combinato con altri approcci sperimentali cellulari, forniscono un valido modello per la generazione di dati riproducibili e biologicamente rilevanti.
La linea cellulare 32D/G-CSF-R, nonché 32D cl-3 cellule, sono ben stabilite e ampiamente usato modelli di coltura cellulare di differenziazione neutrophilic murino14,15,24,30. Diversi gruppi di ricerca hanno utilizzato queste cellule per valutare il ruolo dei geni particolari nella mielopoiesi e ottenuto risultati correlati con i dati ottenuti in vivo modelli e celle primarie16,31. Qui forniamo un protocollo per la gestione della linea cellulare 32D/G-CSF-R, tuttavia, simili procedure possono essere applicate per la coltura e la manipolazione 32D cl-3 cellule. È importante sottolineare che diversi lotti delle cellule 32D cl-3 utilizzato in diversi laboratori presenti differenze nel karyotype, suggerendo che i diversi gruppi potrebbero essere lavorare con loro subcloni32. Basato su questa osservazione, supponiamo che la variabilità genetica analogamente potrebbero essere presenti in cellule 32D/G-CSF-R, e questo deve essere presa in considerazione quando confrontando i risultati ottenuti da diversi gruppi di ricerca. Modelli di coltura cellulare alternativo alle cellule 32D/G-CSF-R sono immortalate progenitrici ematopoietiche linee22,33,34,35,36. Questo approccio è utile quando espansione su larga scala progenitrici è necessaria, per esempio al fine di studiare le interazioni di proteine22. Un vantaggio per le cellule 32D/G-CSF-R è che immortalati progenitori possono essere generati da qualsiasi mouse geneticamente modificati, anche se il tempo per stabilire la linea è notevolmente lungo37. Inoltre, utilizzo e manipolazione dei progenitors del midollo osseo immortalato richiede più esperienza rispetto alle cellule 32D/G-CSF-R.
Per familiarizzare il lettore con il modello 32D/G-CSF-R, nella prima parte dei risultati rappresentativi abbiamo dimostrato cinetica di proliferazione e differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R in presenza di IL-3 e G-CSF. Sono state presentate immagini rappresentative, dimostrando la morfologia delle cellule in condizioni di proliferazione di IL-3, così come in diversi momenti di differenziazione indotta da GCSF. Abbiamo valutato la differenziazione neutrofila di analisi morfologica, tuttavia è stato segnalato che 32D differenziamento cl-3 può essere determinata dall'analisi cytometric di flusso utilizzando il CD11b cella marcatore di superficie27,31, 38,39. A nostra conoscenza e competenza, CD11b non è upregulated durante neutrophilic differenziazione di cellule 32D/G-CSF-R. Per la standardizzazione, nell'analisi di proliferazione 32D/G-CSF-R abbiamo impiegato commercialmente disponibile IL-3. Tuttavia, abbiamo osservato che le cellule proliferano bene in fatti in casa IL-3, prodotto come descritto da Drobek e colleghi22. Per ottenere un buon grado di differenziazione neutrofila indotta da G-CSF, è importante ricordare che la capacità di differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R può essere compromessa se le cellule sono coltivate sopra una concentrazione di 1 × 106 cellule/mL. Inoltre, il grado e la velocità di differenziazione può dipendere dalla composizione del siero. Pertanto, è consigliabile testare la capacità di differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R in diversi lotti FBS e selezionare quello che meglio supporta lo sviluppo di neutrofili maturi su 6 a 9 giorni di coltura in presenza di G-CSF.
Abbiamo fornito due esperimenti rappresentativi dimostrando possibili modi per studiare il ruolo delle proteine particolari nel differenziamento mieloide (Figura 3 e Figura 4). In primo luogo, abbiamo mostrato quella downregulation di EVI2B, una proteina transmembrana espressa in cellule ematopoietiche, conduce a un blocco di differenziazione in cellule 32D/G-CSF-R. Questi dati sono stati recentemente pubblicati dal nostro gruppo, in combinazione con dosaggi eseguiti utilizzando cellule primarie ed Evi2b KO topi16. In secondo luogo, abbiamo studiato l'effetto di BCR-ABL, una proteina di fusione derivanti dalla traslocazione genetica t(9,22) (q34; q11), su neutrophilic differenziazione di cellule 32D/G-CSF-R. Questo spostamento è stata originariamente identificato in pazienti affetti da leucemia mieloide cronica40,41. Precedentemente è stato indicato che l'espressione dell'oncoproteina di fusione BCR-ABL nel 32D cl-3 cellule porta a un arresto di differenziazione mieloide27,28. Qui abbiamo dimostrato che la sovraespressione di BCR-ABL ha simili effetti sulle cellule 32D/G-CSF-R. In entrambi i set di esperimenti presentati qui (che coinvolgono il downregulation di Evi2b e la sovraespressione di BCR-ABL), la modificazione genetica di cellule 32D/G-CSF-R è stata eseguita mediante trasduzione virale, che si traduce nell'espressione genica stabile. La scelta di retrovirali contro lentivirale consegna non influisce proliferazione e differenziazione delle cellule 32D/G-CSF-R. Tuttavia, l'infezione lentivirale è più efficiente di trasduzione retrovirale a causa della presenza di retrovirus endogeno in cellule 32D/G-CSF-R. Secondo la nostra esperienza, la transfezione di queste cellule utilizzando reagenti lipofilici standard non è efficiente. Tuttavia, se è necessaria l'espressione transitoria costrutto, trasfezione mediante elettroporazione è un approccio valido42,43,44. Qui, abbiamo presentato la manipolazione genetica delle cellule 32D/G-CSF-R seguita da GFP ordinamento e analisi delle cellule infette di massa. Tuttavia, se necessario, singola cella ordinamento potrebbe essere impiegato per generare cloni a cellula singola come precedentemente segnalati12,45.
Oltre a saggi di proliferazione e differenziazione, cellule 32D/G-CSF-R sono state impiegate per determinare correttamente il ruolo di alcune proteine nella cellula migrazione ed apoptosi13,46,47,48 . Inoltre, la linea 32D/G-CSF-R è stata utilizzata per determinare la crescita indipendente di citochina mediato da oncoproteins19,20. Un'altra linea frequentemente usata per studiare la citochina indipendenza è Ba/F3 celle21,49. Ba/F3 è una linea cellulare murina dipendente IL3 derivata dal ceppo di topo C3H, analogamente alle cellule 32D/G-CSF-R. Sebbene entrambi i sistemi possono essere impiegati per lo studio di proliferazione indipendente citochina, cellule Ba/F3 scarsamente differenziano in presenza di G-CSF.
Complessivamente, suggeriamo che le cellule 32D/G-CSF-R, pur essendo meno comodo rispetto alle cellule primarie, offrono diversi vantaggi tra cui proliferazione illimitata capacità e semplicità d'uso. Noi crediamo che per la generazione di dati affidabili, gli esperimenti condotti in cellule 32D/G-CSF-R devono essere completati con i dati acquisiti utilizzando approcci sperimentali alternativi quali modelli murini e colture primarie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Prof. ssa Ruud Delwel e Prof Ivo Touw per averci fornito la linea cellulare 32D/G-CSF-R e Prof. ssa Daniel G. Tenen per averci fornito la linea cellulare Bosc23. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dell'Agenzia Grant della Repubblica Ceca (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, l'Istituto di genetica molecolare dell'Accademia Ceca delle scienze (RVO 68378050) di supporto a MA-J, una borsa di studio UK GA (progetto n. 341015) da Charles University di Praga a MK e una borsa di studio UK GA (progetto n. 1278217) da Charles University di Praga al PD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
References
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