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Biology

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.

Abstract

Respirometry ad alta risoluzione consente la misurazione del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, cellule e tessuti. Beta cellule svolgono un ruolo critico nell'organismo di controllo livelli di glucosio nel sangue attraverso la secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio elevato. La secrezione dell'insulina è controllata dal metabolismo del glucosio e la respirazione mitocondriale. Pertanto, respirazione cellulare beta intatto di misurazione è essenziale essere in grado di migliorare la funzione delle cellule beta come un trattamento per il diabete. Utilizzando intatto 832/13 INS-1 derivato beta cellule possiamo misurare l'effetto di aumentare la concentrazione di glucosio sulla respirazione cellulare. Questo protocollo permette di misurare la respirazione cellulare beta in presenza o assenza di vari composti, che permette di determinare l'effetto di composti del giorno respirazione cellulare intatta. Qui dimostriamo l'effetto di due composti naturali, epicatechina monomerica e curcumina, sulla respirazione delle cellule beta in presenza delle condizioni di alto glucosio (16,7 mM) o bassa (2,5 mM). Questa tecnica può essere utilizzata per determinare l'effetto di vari composti sulla respirazione intatto beta cellulare in presenza di diverse concentrazioni di glucosio.

Introduction

Lo scopo primario della cellula beta pancreatica è di mantenere il sistema normoglycemia attraverso secrezione insulinica glucosio-mediata. Le cellule beta senso cambiamenti fisiologici circolanti di glucosio in gran parte dovuto la bassa affinità, trasportatore di capacità elevata del glucosio GLUT2 (glucosio Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Come aumento del livello di glucosio circolatorio, questo trasportatore di bassa affinità ad alta capacità facilita un aumento proporzionale intracellulare del glucosio all'interno della cellula beta. Glucosio è metabolizzato attraverso la glicolisi, il ciclo del TCA (ciclo dell'acido tricarbossilico) e la respirazione mitocondriale conseguente elevati livelli cellulari di ATP (adenosina trifosfato). L'elevata concentrazione di ATP blocca i canali ATP sensibili di K+ , conseguente depolarizzazione della membrana. La depolarizzazione della membrana provoca l'apertura dei canali del Ca2 + gated tensione e successiva liberazione della vescichetta associato insulina granuli2. Disfunzione delle cellule beta è un marchio di garanzia del diabete di tipo 2 (T2D) e provoca la secrezione dell'insulina in diminuzione e scarsamente controllato e in definitiva di morte delle cellule beta3. Meccanismi che mantengono o migliorano la funzione delle cellule beta potrebbero essere usati come trattamento per T2D.

Gli studi hanno dimostrato gli effetti benefici di biofiltri composti basati a pianta sulla beta cellula pancreatica4. Questi composti possono avere il loro effetto attraverso la crescente proliferazione delle cellule beta, sopravvivenza o secrezione insulinica glucosio-mediata. Ad esempio, studi recenti hanno dimostrato che l'epicatechina monomerica migliora la secrezione insulinica glucosio-mediata attraverso l'aumento di respirazione mitocondriale e aumento di ATP cellulare livelli5. Di conseguenza, di comprendere come questi composti possono aumentare funzionale delle cellule beta massa è importante sfruttare questi composti come terapeutica potenziale.

Respirazione cellulare può essere misurata attraverso una serie di strumenti. Utilizzo di un respirometro ad alta risoluzione permette per la titolazione dei modulatori chimici per una popolazione di cellule permeabilized o intatto6. Questo strumento consente l'aggiunta di vari composti, alle concentrazioni differenti, dando così una vasta gamma di informazioni.

Data la stretta connessione tra il metabolismo del glucosio e la funzione delle cellule beta, misure della respirazione cellulare sono critiche. Misure della respirazione cellulare possono essere fatto utilizzando cellule beta o permeabilized che intatte, con ciascuno che ha una propria serie di vantaggi e svantaggi7,8. Mentre permeabilizzazione delle cellule beta permette di misurare diversi aspetti della catena di trasporto degli elettroni, lo fa senza per quanto riguarda il meccanismo per l'induzione della respirazione nel beta cellulare, l'assorbimento del glucosio e del metabolismo. Pertanto, l'uso della respirazione unpermeabilized beta cellulare è una tecnica molto utile per determinare la risposta di beta cellule a vari livelli di glucosio, utilizzando il consumo di ossigeno come la lettura.

Lo scopo di questa tecnica è di misurare il consumo di ossigeno in intatto INS-1 832/13 beta cellule derivate. Questa tecnica permette di determinare la risposta delle cellule beta al stati unstimulatory del glucosio (glucosio 2,5 mM) così come le condizioni di stimolatori del glucosio (16,7 millimetri di glucosio). Mentre le cellule unpermeabilized non ci permettono di testare individualmente complesso I, II o III dell'elettrone catena di trasporto, la tecnica consentono misurazioni trattare con respirazione di inibizione (Oligomycin A), disgiunto complesso IV (FCCP-Carbonil cianuro- 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone) e completamente inibita respirazione (Antimycin A). Questo studio dimostra l'efficacia di respirazione in beta cellule pancreatiche di unpermeabilized intatte, come pure l'effetto di due composti naturali, epicatechina monomerica e curcumina, sulla respirazione cellulare beta di misura.

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Protocol

1. coltura cellulare

  1. Cultura INS-1 derivato 832/13 beta cellule in RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina, 10 mM HEPES, 2mm glutammina, 1 mM sodio piruvato e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo9,10,11 ,12,13.
  2. Rimuovere le cellule 832/13 da una boccetta di T75 con 2 mL di soluzione 0,25% tripsina, incubazione a 37 ° C per 10 min. neutralizzare tripsina aggiungendo 8 mL di RPMI 1640 completa per i media.
  3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire 100 µ l del volume delle cellule da passo 1.2 a 900 µ l di PBS.
  4. Cellule di piastra 832/13 ad una densità di 2 x 106 cellule/mL in un 6 ben piatto.
  5. Cellule di coltura per 48 h in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO2 prima di iniziare gli esperimenti di respirazione.

2. preparazione delle cellule per Respirometry ad alta risoluzione

  1. Trattando le cellule 832/13 con cacao epicatechina derivate monomero.
    1. Della coltura di cellule di 832/13 per 24 h dopo il placcaggio in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Cambiare supporto 24h dopo il placcaggio e trattare 832/13 celle con controllo del veicolo (3 pozzi) o 100 monomero nM cacao (3 pozzi), seguita dalla cultura per altre 24 h (48 h totale) in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    3. Lavare le cellule 832/13 1 x basso glucosio secrezione Assay Buffer (SAB) per 5 min. aspirato buffer e incubare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 3 h, cambio 1 x glucosio basso SAB ogni ora.
      1. Fare 10 x SAB con 33,32 g di NaCl, 1,73 g di KCl, 0,82 g di KH2PO4, 0,7 g di MgSO4 e aggiungere H2O ad un volume finale di 500 mL. Filtro sterile la soluzione finale.
      2. Fare 1 x glucosio basso SAB con 10 mL di 10 x SAB, 100 µ l del glucosio di 45%, 2 mL di 1 M HEPES, 1 mL di 0,25 M CaCl2, 0,57 mL di soluzione al 35% BSA, 0,21 g di NaHCO3 e aggiungere H2O ad un volume finale di 100 mL. Filtro sterile la soluzione finale.
  2. Trattando le cellule 832/13 con curcumina.
    1. Della coltura di cellule di 832/13 per 48 h dopo il placcaggio in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Lavare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 5 min. aspirato buffer e incubare le cellule 832/13 1 x glucosio basso SAB per 3 h, cambio 1 x glucosio basso SAB ogni ora.
    3. Dopo 2,5 h di incubazione 3H 1 x glucosio basso SAB, aspirare buffer e incubare le cellule in 1 x SAB glucosio basso con controllo del veicolo o 40 µM curcumina per 30 min. A seguito di incubazione, aspirare il buffer.
  3. Raccolta delle cellule con tripsina per respirometry ad alta risoluzione
    1. Dopo l'incubazione di 3H 1 x glucosio basso SAB, rimuovere le celle dalla piastra con 250 µ l di 0,25% tripsina per pozzetto.
    2. Unire le celle in tripsina da 3 pozzi trattati con controllo del veicolo o composti di interesse con 4 mL di SAB in una provetta conica da 15 mL.
    3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire 100 µ l del volume delle cellule da passo 2.3.2 a 900 µ l di PBS.
    4. Diluire il numero appropriato di cellule in 1 x glucosio basso SAB per rendere 3 mL alla concentrazione per ogni camera. I dati dimostrano che una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL è il più efficace.
  4. Raccolta delle cellule con dissociazione meccanica per respirometry ad alta risoluzione
    1. Dopo l'incubazione di 3 h in 1 x glucosio basso SAB, aggiungere 1 mL di 1x basso glucosio SAB a ciascun bene e delicatamente soffiare cellule fuori la piastra con dissociazione meccanica di pipettaggio con un puntale di 1000 µ l.
    2. Combinare le celle da 3 pozzi trattati con controllo del veicolo o composti di interesse per un totale di 3 mL SAB in una provetta conica da 15 mL per la respirazione.

3. ad alta risoluzione Respirometry

  1. Preparazione del respirometro ad alta risoluzione.
    1. Accendere il respirometro ad alta risoluzione e connettersi al desktop lanciando il programma di analisi respirometro.
    2. Aspirare l'etanolo al 70% da entrambe le camere. Godetevi questi alloggiamenti in etanolo al 70% per un minimo di 45 min.
    3. Lavare le camere due volte con etanolo al 70%, ad aspirazione dopo ogni passaggio.
    4. Lavare le camere tre volte con ddH2O, aspirando dopo ogni passaggio.
    5. Sciacquare i tuffatori di camera in ddH2O. Questo pulisce fuori etanolo residuo i tuffatori e il porto di titanio.
  2. Calibrazione di sensori di ossigeno polarografico.
    1. Aggiungere 2,4 mL di tampone basso glucosio SAB 1x ogni camera di oxygraph, mescolando il buffer continuamente utilizzando barre magnetiche nella camera a 750 giri/min e 37 ° C con un intervallo di dati-registrazione presso 2.0 s premendo il tasto F7 e aprendo la scheda con l'etichetta "Sistemi". Stantuffi di spingere tutto in e poi ritrattare l'impostazione di aerazione di chiave. Almeno per un minimo di 1 ora fino a quando si ottiene il flusso di ossigeno stabile, portare la macchina.
    2. Impostare la macchina a 37 ° C per tutta la durata dell'esperimento. Impostare la tensione di polarizzazione a 800 mV, con un guadagno di 2 premendo il tasto F7 e aprendo la scheda denominata "Ossigeno, O2". Equilibrare la concentrazione di ossigeno del buffer SAB per almeno 30 min, mentre la variazione di concentrazione di ossigeno è stabile (meno di 2 pmol/(s*mL)).
    3. A seguito di stabilizzazione di concentrazione di ossigeno, è necessario selezionare una regione dove il cambiamento della concentrazione di ossigeno è stabile per stabilire la misura di sfondo del cambiamento nella concentrazione di ossigeno.
      1. Selezionare una regione spingendo il tasto MAIUSC, clic sinistro del mouse e trascinando il mouse in tutta la regione selezionata. Clicca sulla lettera associata alla regione selezionata e il cambiamento a "R1" per ogni traccia, corrispondente con ciascuna delle due camere.
      2. Fare doppio clic sulla casella "O2 calibrazione" in basso a sinistra e destra angoli dello schermo, fare clic sul pulsante "Seleziona contrassegno" per la "taratura aria" come R1 e quindi selezionare "calibrare e copia negli Appunti" per entrambi gli alloggiamenti.
  3. Valutazione della respirazione delle cellule beta 832/13 preparato nei passaggi 2.1.5 o 2.2.5.
    1. Caricare 2,4 mL di campione in ogni camera (una camera con le cellule di controllo veicolo trattato, una camera con cellule trattate composte) in 1x basso glucosio Sab Mantenere 0,5 mL di campione di cellule per la quantificazione della proteina dall'analisi di BCA (acido bicinconinico) se si utilizza l'approccio di dissociazione meccanica (congelare a-20 ° C per la misura più tardi).
      1. Spingere lo stantuffo completamente e aspirare il volume residuo. Mescolare le cellule continuamente durante l'esperimento a 750 giri/min e 37 ° C per tutti i passaggi successivi. Fare un segno facendo clic su F4 ed etichettare come "cellule", quando i campioni vengono caricati.
      2. Misurare i campioni per 30 min. Dopo il segnale di stabilizzazione, seleziona una regione del cambiamento nella concentrazione di ossigeno corrispondente alle condizioni di basso del glucosio (glucosio 2,5 mM), come descritto in 3.2.3.
    2. Una volta raggiunto il segnale di stabilizzazione, aggiungere 12,5 µ l di una soluzione di glucosio sterile 45% (concentrazione finale di 16,7 mM) in ogni camera attraverso il titanio carico porta utilizzando una siringa. Fare che un segno misurato "Glucosio" come descritto nella 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare questa regione del cambiamento nella concentrazione di ossigeno, come descritto in 3.2.3. Questa è la lettura di glucosio 16,7 mM e corrisponde con stimolatore condizioni7.
    3. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiungere 1 µ l di oligomycin 5mM (2,5 µM concentrazione finale) in ogni camera attraverso la porta di caricamento. Fare che un segno misurato "OligoA" come descritto nella 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3. Oligomycin A inibisce il trifosfato di adenosina synthase e così l'unico flusso ossigeno che accade avviene tramite perdita di elettroni e di fosforilazione ossidativa7non.
    4. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiunta 1 mM FCCP in incrementi di 1 µ l finché non viene stabilito un tasso respiratorio massimo. Questo rappresenta la massima respirazione disgiunto. Tra 3-4 µ l FCCP è sufficiente (1,5-2,0 µM concentrazione finale) per indurre la massima respirazione disgiunto di cellule INS-1 832/13. Fare un segno con l'etichetta "FCCP" come descritto in 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3. FCCP è un agente disgiungere. Questo permette di misurare respirazione disgiunto7.
    5. Una volta raggiunto segnale di stabilizzazione aggiungere 1 µ l di 5mm Antimycin A (concentrazione finale di 2,5 µM) in ogni camera attraverso la porta di caricamento. Fare un segno con l'etichetta "AntiA" come descritto in 3.3.1 quando viene aggiunto il trattamento. Segnale di lasciare stabilizzare e registrare la respirazione cellulare finché non si ottiene un flusso di ossigeno stabile. Selezionare quest'area della curva come descritto in 3.2.3.
      Nota: Antimycin A associa citocromo C reduttasi, inibisce l'ossidazione dell'ubiquinone e blocca tutte le respirazione. Questo permette di arrestare completamente la respirazione7.
  4. Cellule beta 832/13 per la normalizzazione di respirazione e concentrazione di proteina di misurazione.
    1. Utilizzando i 0,5 mL di campione conservato al caricamento, campione di misura della proteina usando il metodo BCA13.
    2. Eseguire ogni esempio in triplice copia, senza diluizione, seguendo le istruzioni del produttore.
  5. calcoli di respirazione delle cellule beta 832/13 dalle cellule tripsinizzate.
    1. Immettere il numero di cellule per mL uso nell'analisi premendo il tasto F3 del programma Analisi respirometro. Cambiare le unità di cellule/mL, la concentrazione cellulare di entrare e sostituire il terreno a Sab
    2. Selezionare letture di sfondo per normalizzare i dati selezionando e stipulare O2 modulo di calibrazione come descritto in 3.2.3.
    3. Effettuare le selezioni delle letture da 2,5 mM glucosio, 16,7 mM glucosio, Oligomycin A, FCCP e Antimycin A come descritto in 3.3.1.
    4. All'interno del programma di analisi del respirometro, esportare le letture per ogni camera dopo aver immesso la concentrazione nella proteina e selezionando i valori medio appropriati per ogni trattamento durante la misurazione della respirazione. Questo viene fatto facendo clic su F2 e poi spingendo la "copia per funzione Appunti". Consente di esportare i dati da utilizzare in altri programmi di analisi. Utilizzare i valori di "O2 pendio neg." per i calcoli.
    5. Compilare i dati per 3-5 sedute di veicolo trattati controlli e composti naturali cellule trattate per determinare l'effetto sulla respirazione cellulare intatta di beta cellule INS-1 832/13.
  6. calcoli di respirazione delle cellule beta 832/13 da dissociate meccanicamente le cellule.
    1. Immettere i calcoli di proteina del dosaggio di BCA premendo il tasto F3 del programma Analisi respirometro. Modificare le unità in mg, immettere la concentrazione di BCA e sostituire il terreno a Sab
    2. Selezionare letture di sfondo per normalizzare i dati selezionando e stipulare O2 modulo di calibrazione come descritto in 3.2.3.
    3. Effettuare le selezioni delle letture da 2,5 mM glucosio, 16,7 mM glucosio, Oligomycin A, FCCP e Antimycin A come descritto in 3.3.1.
    4. All'interno del programma di analisi del respirometro, esportare le letture per ogni camera dopo aver immesso la concentrazione nella proteina e selezionando i valori medio appropriati per ogni trattamento durante la misurazione della respirazione. Questo viene fatto facendo clic su F2 e poi spingendo la "copia per funzione Appunti". Consente di esportare i dati da utilizzare in altri programmi di analisi. Utilizzare i valori di "O2 pendio neg." per i calcoli.
    5. Compilare i dati per 3-5 sedute di veicolo trattati controlli e composti naturali cellule trattate per determinare l'effetto sulla respirazione cellulare intatta di beta cellule INS-1 832/13.

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Representative Results

INS-1 832/13 beta cellule che vengono preparate e raccolti, come descritto nel protocollo dimostrerà modulazione nel consumo di ossigeno basato su vari interventi chimici (Figura 1A). Si osserverà un aumento della respirazione quando la concentrazione di glucosio è aumentata a 16,7 mM glucosio (Figura 1B). Respirazione diminuisce quando le cellule intatte sono trattate con Oligomycin A. Questa respirazione è conosciuta come perdita, che è definito come lo stato respiratorio basale, nonphosphorylating. Massima respirazione si realizzerà quando le cellule beta sono trattate con l'agente disgiungente FCCP, che è definita come ETS respirazione, o respirazione del sistema di trasporto dell'elettrone. Infine, respirazione scenderà a zero quando trattati con Antimycin A, etichettato come ROX (consumo di ossigeno residuo) che si riferisce al consumo di ossigeno cellulare non respiratori.

Differenze nel numero delle cellule cambierà in modo significativo la qualità dei dati ottenuti da questa tecnica. Glucosio-indurre respirazione è stata misurata a 0,5, 1 e 2 x 106 cellule/mL (Figura 2A-2 C). Utilizzando i conteggi delle cellule e BCA protein assays, concentrazioni di proteina corrispondente alla cella testato tre concentrazioni sono state calcolate (Figura 2D). Le misurazioni con 0,5 x 106 cellule/mL non è riuscito a dimostrare la respirazione glucosio-stimolata (Figura 2A) e solo l'ETS associati respiratorio aumentato è stato indicato per essere significativo. Ciò suggerisce che il numero di cellulare basso provoca un segnale basso di rumore che confonde i risultati. Allo stesso modo, misure a 2 x 106 cellule/mL provocato anche significativa variabilità, come indicato dalla significatività statistica solo essere raggiunta per le misurazioni di ETS (Figura 2). Questo è presumibilmente dovuto alla necessità di ri-ossigenare gli alloggiamenti più volte durante l'analisi, che ha provocato una maggiore variabilità da campione a campione. Questi dati dimostrano che le concentrazioni di 1 x 106 cellule/mL provocare significativa respirazione glucosio-stimolata, perdita ed ETS misure, che sono necessari per le analisi di respirazione (Figura 2B e 2E).

In questo protocollo sono disponibili due metodi per rimuovere le cellule per la respirazione. Con tripsina per rimuovere cellule è efficace quando le misurazioni sono stati completati a 37 ° C. Misure di respirazione fatte nell'assenza o nella presenza di curcumina (Figura 3A) viene illustrato manutenzione della glucosio-stimolato respirazione, respirazione perdita ed ETS. Confronto delle cellule trattate curcumina alle cellule non trattate di seguito viene illustrato nessun cambiamento a qualsiasi di questi parametri respiratori (Figura 3B-C). Misure di respirazione fatte nell'assenza o nella presenza di cacao epicatechina monomero (Figura 3D) viene illustrato anche manutenzione della glucosio-stimolato respirazione, respirazione perdita ed ETS. Confronto di cacao epicatechina monomero trattato cellule alle cellule non trattate di seguito viene illustrato respiratorio aumentato a 2,5 mM e 16,7 mM glucosio, così come nella respirazione di perdita ed ETS (Figura 3E-F). Questi dati dimostrano che mentre la curcumina non migliorare la respirazione delle cellule beta 832/13, epicatechina cacao monomero non (Figura 3). La curcumina ha dimostrata di migliorare la secrezione di insulina attraverso inibizione della fosfodiesterasi attività14. I nostri dati suggeriscono che la curcumina non migliora la secrezione dell'insulina attraverso la modulazione della funzione mitocondriale. Abbiamo già dimostrato che coltura in presenza di monomeri di epicatechina cacao induce l'espressione delle varie componenti della catena di trasporto mitocondriale dell'elettrone5. Inoltre abbiamo osservato respiratorio aumentato nello stato perdita (indotto dal trattamento con oligomycin) e con ETS (sistema di trasporto dell'elettrone, indotta da FCCP). L'uso di questo strumento suggerisce una serie di potenziali bersagli per gli studi futuri.

Come alternativa alla rimozione di tripsina delle cellule, dissociazione meccanica può essere effettuata anche utilizzando la tecnica di lavaggio presentato al termine a 37 ° C. Misure di respirazione sono state fatte in assenza o in presenza di curcumina o cacao epicatechina monomero (fig. 4A-C). Questi dati dimostrano che le tendenze osservate con preparazione di tripsina delle cellule sono mantenuti, tuttavia la sensibilità sembra essere diminuita. Mentre controllo e cacao epicatechina monomero trattamento cellule mantenute il glucosio-stimolata, perdita ed ETS respirazione, cellule trattate con curcumina solo mantenuto la respirazione glucosio-stimolato a causa della maggiore variabilità di campione a campione. Mentre le tendenze osservate con preparazioni di cellule tripsina sono state mantenute (Figura 4-F), il significato è diminuita in tutti i parametri, presumibilmente per la maggiore variabilità di campione a campione introdotto dalla dissociazione meccanica e la normalizzazione a numero di concentrazione piuttosto che delle cellule della proteina.

Questi dati dimostrano che questo protocollo può essere usato per misurare la respirazione delle cellule beta di INS-1 832/13 intatte. Inoltre, il nostro protocollo suggerisce un numero di cellulare ottimale per misure accurate e un comodo metodo per preparare le celle per massimizzare il rapporto segnale-rumore.

Figure 1
Figura 1 : Curva rappresentante respirazione delle cellule beta intatto 832/13. Cellule beta intatto 832/13 sono misurate per la respirazione in Oligomycin (Figura 1A), 2,5 mM glucosio, 16,7 millimetri di glucosio, 2,5 µM, 2 µM FCCP (Carbonil cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) e 2,5 µM Antimycin A. Un'espansione del 16,7 mM sezione glucosio (Figura 1B) è presentata per dimostrare l'aumento della respirazione glucosio-stimolata. Le cellule sono state misurate ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL. PERDITA si riferisce allo stato respiratorio basale, nonphosphorylating, ETS si riferisce alla capacità respiratoria disgiunta del sistema di trasporto dell'elettrone e ROX indica il consumo di ossigeno residuo dopo la respirazione mitocondriale è inibita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Determinazione del numero di 832/13 beta cellule necessarie per misure di respirazione indotta da glucosio. Cellule beta intatto 832/13 sono misurate per respirazione alle concentrazioni di (A) 0,5 x 106 cellule/mL (B) 1 x 106 cellule/mL, o (C) 2 x 106 cellule/mL. (D) le concentrazioni di proteina che corrispondono con 0,5 x 106 cellule/mL, 1 x 106 cellule/mL e 2 x 106 cellule/mL. (E) confronto della respirazione a 0,5 x 106 cellule/mL, 1 x 106 cellule/mL e 2 x 106 cellule/mL. Respirazione è stata misurata sotto 2,5 mM glucosio, 16,7 millimetri di glucosio, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP e 2,5 µM Antimycin A condizioni. Respirazione con 2,5 e 16,7 millimetri di glucosio dimostrare la risposta di respirazione glucosio-stimolata delle cellule beta. Respirazione dopo oligomycin dimostra la respirazione di perdita (basale, nonphosphorylating stato respiratorio). Respirazione dopo FCCP (Carbonil cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) trattamento dimostra (disgiunto capacità respiratoria del sistema di trasporto dell'elettrone, ETS). n = 6 corse indipendente. Dati sono presentati come media ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001, * * * p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Misure di respirazione delle cellule beta 832/13 dopo sblocco con tripsina. 832/13 beta cellule sono state coltivate in presenza o assenza di epicatechina monomerica di cacao o la curcumina e la respirazione è stata misurata dopo il rilascio di cellule con tripsina. Respirazione è stata misurata sotto 2,5 mM glucosio, 16,7 millimetri di glucosio, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP e 2,5 µM Antimycin A condizioni. Respirazione con 2,5 e 16,7 millimetri di glucosio dimostrare respirazione glucosio-stimolata. Respirazione dopo oligomycin dimostra la respirazione di perdita (basale, nonphosphorylating stato respiratorio). Respirazione dopo FCCP (Carbonil cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) trattamento dimostra (disgiunto capacità respiratoria del sistema di trasporto dell'elettrone, ETS). Respirazione dopo antimycin un trattamento dimostra il consumo di ossigeno residuo (ROX). (A) il trattamento delle cellule di 832/13 con curcumina mantiene le modifiche appropriate nella respirazione a causa dei trattamenti. Rappresentante traccia (B) e (C) media dei dati per le cellule trattate con curcumina non dimostrano nessun cambiamento alla respirazione delle cellule beta di 832/13. (D) il trattamento delle cellule di 832/13 con cacao epicatechina monomero mantiene le modifiche appropriate nella respirazione a causa dei trattamenti. Rappresentante traccia (E) e (F) media dei dati per cacao epicatechina monomero trattato cellule dimostra respiratorio aumentato in tutti i parametri dopo il trattamento di monomero di cacao epicatechina. (G) tutti i tre parametri sono presentati insieme per confronto. n = 6 corse indipendente. Dati sono presentati come media ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001, * * * p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Misure di respirazione delle cellule beta 832/13 dopo rilascio mediante dissociazione meccanica. 832/13 beta cellule sono state coltivate in presenza o assenza di epicatechina monomerica di cacao o la curcumina e la respirazione è stata misurata dopo il rilascio di cellule usando dissociazione meccanica. Respirazione è stata misurata sotto 2,5 mM glucosio, 16,7 millimetri di glucosio, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP e 2,5 µM Antimycin A condizioni. Respirazione con 2,5 e 16,7 millimetri di glucosio dimostrare la risposta del glucosio delle cellule beta. Respirazione dopo oligomycin dimostra la respirazione di perdita (basale, nonphosphorylating stato respiratorio). Respirazione dopo FCCP (Carbonil cianuro -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) trattamento dimostra (disgiunto capacità respiratoria del sistema di trasporto dell'elettrone, ETS). Media dei dati per le cellule (A) non trattato le cellule o le cellule trattate con curcumina (B) o (C) cacao epicatechina monomero dimostrano che dissociazione meccanica mantiene respirazione glucosio-stimolata in tutti i trattamenti, mentre la perdita e Significato ETS sono perso solo nelle cellule trattate curcumina. Confronto delle cellule non trattate di curcumina (D) o (E) cacao epicatechina monomero viene illustrato respiratorio aumentato in tutti i parametri con cacao epicatechina monomero con nessun cambiamento significativo alla respirazione con curcumina. (F) tutti i tre parametri sono presentati insieme per confronto. n = 6 corse indipendente. Dati sono presentati come media ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'obiettivo del presente protocollo è utilizzare manometrica ad alta risoluzione per misurare le frequenze respiratorie in cellule beta pancreatiche intatte. Questo metodo consente la misurazione della risposta delle cellule beta ai livelli aumentati del glucosio. Il protocollo consente anche il pretrattamento con vari composti, come dimostrato in questo protocollo con la naturale monomerico epicatechina o curcumina4,5. Trattamento con vari altri composti può essere usato in questo protocollo, con pretrattamento (come illustrato di seguito) o trattando all'interno delle camere respiratorie con minime modifiche al protocollo di base.

Ci sono vari modi con cui questo metodo può essere modificato. Altre linee cellulari beta potrebbero essere utilizzati; Tuttavia, il numero di cell e tempi di lavaggio SAB dovrà essere determinata sperimentalmente. Potrebbero essere utilizzati anche il roditore primario e isolotti umani; Tuttavia, il numero di celle o gli equivalenti dell'isolotto anche dovrà essere determinata sperimentalmente. Almeno uno studio ha misurato il consumo di ossigeno dell'isolotto utilizzando ad alta risoluzione respirometry15. Questo studio richiesto 400 isolotti per reazione, ma non ha misurato modificazioni della respirazione glicemia indotta. Dato che il primario del tessuto è usato frequentemente con respirometers ad alta risoluzione16,17, isolotti intatti potrebbero essere utilizzati dopo la risoluzione dei problemi sperimentali. Tuttavia, dato il gran numero di isolotti necessaria per questo test, altri metodi di misurazione del consumo di ossigeno possono essere più adatto per misurazioni della respirazione primaria dell'isolotto.

Ci sono pochi passaggi critici con il protocollo presentato. In primo luogo, avere un adeguato numero di cellule è critica. I nostri studi indicano che cellule beta 832/13 ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL è sufficiente per misure di respirazione glucosio-stimolata. Le misurazioni con 0,5 x 106 cellule/mL ha dimostrato respirazione glucosio-stimolato basso e un basso rapporto segnale-rumore. Inoltre, misurazioni utilizzando 2 x 106 cellule/mL ha provocato un'elevata variabilità di campione a campione e rapido utilizzo cellulare di ossigeno quale camera necessaria ri-ossigenare e frequentemente ha provocato la morte rapida delle cellule. Il numero appropriato di cellule dovrebbe essere determinato sperimentalmente per la linea cellulare determinato al fine di risolvere questo passaggio critico.

Un secondo passo critico sta preparando le cellule beta per rispondere agli elevati livelli di glucosio. Terreni di coltura RPMI 1640 ha livelli elevati del glucosio. Le cellule devono essere spostate dall'alto glucosio ad una cultura di glucosio basso. Un'incubazione di 3 h in 1 x basso glucosio SAB è sufficiente per le cellule beta avere una risposta significativa per l'aggiunta di glucosio di ~16.7 mM. Wash periodi di meno di 3 h per provocare risposte variabile per l'aggiunta di glucosio. Risoluzione dei problemi di risposta del glucosio possono essere affrontate con aumento della lunghezza del tempo di lavaggio SAB.

Un terzo punto critico è il metodo per la preparazione delle cellule per la misurazione. I nostri dati dimostrano che mentre tripsina e dissociazione meccanica possono essere utilizzati, tripsina rilasciato risultato cellule in letture più coerenti e meno variabilità di campione a campione. La tendenza osservata con entrambi i metodi è stata mantenuta, tuttavia la forza dei dati era maggiore con le cellule preparate con tripsina. Mentre possono essere utilizzati altri metodi, ad esempio cella raschiatura, i nostri dati suggeriscono che l'uso di tripsina si tradurrà in risultati più riproducibili con meno di18,di variabilità di campione a campione19.

Di seguito sono riportati i limiti di questo approccio. In primo luogo, con solo due camere di trattamento, questo non è un alto throughput metodo di screening. Ogni esecuzione di due campioni dura tra 3-4 h, compreso il tempo per preparare la macchina. In secondo luogo, una relativamente grande concentrazione delle cellule è richiesta per il dosaggio, dato il ~2.2 mL di campione (o ~2.2 x 106 celle) per ogni camera. A causa della quantità di campione richiesto per il dosaggio, l'uso di questo strumento e il protocollo per primari isolotti è limitata a meno che una grande quantità è disponibile. Gli studi precedenti che hanno utilizzato gli isolotti per respirazione in questa tecnica usato ~ 400 isolotti/camera15. Ciò richiederebbe, approssimativamente, isolotti da due topi per ogni alloggiamento della20. In terzo luogo perché non vengono utilizzate celle permeabilized, la capacità di determinare l'effetto del trattamento sui componenti della catena di singolo elettrone utilizzando composti non permeabili delle cellule non è disponibile.

Ci sono una serie di vantaggi significativi di questo protocollo per quanto riguarda i metodi esistenti. In primo luogo, questo protocollo consente la titolazione graduale di vari composti di membrana permeabile. Questo permetterà per la determinazione accurata delle concentrazioni necessarie. In secondo luogo, utilizzo di cellule intatte beta permette di eseguire una query l'effetto sul metabolismo di glucosio citosolico e mitocondriale7. Questo permette di osservare i fenotipi indicativo dei cambiamenti per via glicolitica, un'osservazione che viene persa quando si utilizza celle permeabilized. In terzo luogo, le cellule intatte ci permettono di utilizzare la risposta a glucosio elevato come una metrica della funzione delle cellule beta, che si perde in permeabilized varianti di questo test. Infine, questo protocollo consente l'aggiunta di composti di varie e multiple per interrogare l'effetto di composti sulla respirazione delle cellule beta, un lusso che non è presente con altri strumenti che misurano la respirazione.

Applicazioni future di questo metodo includono la possibilità di misurare parametri come ATP, calcio e H2O2 livelli simultanei con misure di respirazione. Questo metodo permette anche per la misurazione della respirazione in presenza di altre fonti di combustibile, quali gli acidi grassi o chetoni. Infine, con alcune modifiche, misura i livelli di insulina secreta concomitante con misure di respirazione possono essere anche possibili.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Tessem e Hancock per assistente e discussione scientifica. Gli autori ringraziano Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) per fornire la frazione di monomero di cacao epicatechina derivate. Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del diabete Action Research and Education Foundation a JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

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References

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Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali
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