Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høy oppløsning Respirometry å måle mitokondrie funksjon av intakt Beta-cellene i nærvær av naturlige forbindelser

Published: January 23, 2018 doi: 10.3791/57053
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Nutrition, Dietetics and Food Science Department, Brigham Young University

Summary

Målet med denne protokollen er å måle effekten av glukose-mediert endringer i mitokondrie åndedrett i nærvær av naturlige forbindelser på intakt 832/13 beta celler med høy oppløsning respirometry.

Abstract

Høy oppløsning respirometry tillater for måling av oksygen inntak av isolerte mitokondrier, celler og vev. Beta-cellene spille en avgjørende rolle i kroppen ved å kontrollere blodsukkeret gjennom insulin sekret Grunna opphøyet glukose konsentrasjoner. Insulinsekresjon styres av glukose metabolisme og mitokondrie åndedrett. Derfor er måle intakt beta-celle åndedrett avgjørende for å kunne forbedre beta-celle funksjonen som behandling for diabetes. Bruke intakt 832/13 INS-1 avledet beta-cellene vi kan måle effekten av økende glukose konsentrasjon på cellular respirasjon. Denne protokollen tillater oss å måle beta-celle åndedrett i tilstedeværelse eller fravær av ulike forbindelser, tillater en å fastslå effekten av gitt forbindelser på intakt celle åndedrett. Her viser vi effekten av to naturlig forekommende forbindelser, monomerisk epicatechin og curcumin, på beta-celle åndedrett under tilstedeværelsen av lav (2,5) eller høy glukose (16,7 mM) forhold. Denne teknikken kan brukes til å fastslå effekten av ulike forbindelser på intakt beta-celle åndedrett i nærvær av ulike glukose konsentrasjoner.

Introduction

Hovedformålet med bukspyttkjertelen beta cellen er å opprettholde systemet normoglycemia gjennom glukose-stimulert insulinsekresjon. Beta-cellene forstand fysiologiske endringene i sirkulerende glukose skyldes lav affinitet, høykapasitets glukose transporter GLUT2 (glukose Transporter 2 Km 16,7 mM)1. Som sirkulasjons blodsukkeret stiger, forenkler denne høy kapasitet lav-affinitet transporter en proporsjonal økning i intracellulær glukose i beta-celle. Glukose metaboliseres gjennom Glykolysen, TCA syklus (tricarboxylic acid syklus) og mitokondrie åndedrett resulterer i forhøyde mobilnettet ATP (adenosin trifosfat). Forhøyet ATP konsentrasjonen blokkerer ATP følsom K+ kanalene, noe som resulterer i membran depolarization. Membran depolarization fører til åpningen av spenning gated Ca2 + kanaler og senere utgave av vesicle bundet insulin granulater2. Beta-celle dysfunksjon er et kjennetegn på Type 2 Diabetes (T2D), og resulterer i redusert og dårlig kontrollert insulinsekresjon og beta-celle død3. Mekanismer som opprettholde eller forbedre beta-celle funksjonen kan brukes som behandling for T2D.

Studier har vist de gunstige effektene av naturlig forekommende plante-baserte forbindelser på bukspyttkjertelen beta-celle4. Forbindelsene kan ha deres effekt gjennom økende beta-celle spredning, overlevelse eller glukose-stimulert insulinsekresjon. Som et eksempel, har studier vist at monomerisk epicatechin forbedrer glukose-stimulert insulinsekresjon gjennom å øke mitokondrie åndedrett og øke cellulære ATP nivå5. Derfor, å forstå hvordan disse forbindelsene kan øke funksjonell beta-celle er viktig å utnytte disse forbindelser som potensielle therapeutics.

Cellular respirasjon kan måles gjennom en rekke verktøy. Bruk av en høy oppløsning respirometer tillater titrering av kjemiske modulatorer til en permeabilized eller intakt befolkningen6. Dette verktøyet gjør tillegg av ulike forbindelser, i ulike konsentrasjoner, dermed gir en rekke opplysninger.

Gitt den intime forbindelsen mellom glukose metabolisme og beta-celle funksjonen, er målinger av cellular respirasjon kritiske. Målinger av cellular respirasjon kan gjøres ved hjelp av enten permeabilized eller intakt beta celler, med hver har sitt eget sett med fordeler og ulemper7,8. Mens permeabilization beta celler gjør det mulig å måle ulike aspekter av elektronet transportkjeden, gjør det det uten gjelder mekanismen for induksjon åndedrett i beta-celle, glukose opptak og metabolisme. Bruk av unpermeabilized beta-celle åndedrett er derfor en svært nyttig teknikk for å finne beta-cellene respons på ulike glukoseverdier, bruker oksygenforbruk som er avlesning.

Formålet med denne teknikken er å måle oksygenforbruk intakt INS-1 avledet 832/13 beta-cellene. Denne teknikken tillater oss å bestemme responsen av beta-cellene til unstimulatory glukose forhold (2,5 glukose) samt stimulerende glukose forhold (16,7 mM glukose). Mens unpermeabilized cellene ikke tillater oss å individuelt teste kompleks I, II eller III av elektronet transport kjeden, teknikken tillater målinger håndtere komplekse IV hemming (Oligomycin A), uncoupled åndedrett (FCCP-karbonyl cyanid- 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone), og helt hemmet åndedrett (Antimycin A). Denne studien viser effekten av måle åndedrett i intakt unpermeabilized bukspyttkjertelen beta-cellene, samt effekten av to naturlig forekommende forbindelser, monomerisk epicatechin og curcumin, på beta-celle åndedrett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur

  1. Kultur INS-1 avledet 832/13 cellene i RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, 10 mM HEPES, 2 mM glutamin, 1 mM natrium Pyruvate og 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.
  2. Fjerne 832/13 celler fra en MT75 kolbe med 2 mL 0,25% trypsin, rugende ved 37 ° C i 10 min. nøytralisere trypsin ved å legge til 8 mL komplett RPMI 1640 medier.
  3. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynne 100 µL av cellen fra trinn 1.2 i 900 µL av PBS.
  4. Plate 832/13 cellene på en tetthet av 2 x 106 celler/mL i en 6 rett vel.
  5. Kultur celler for 48 timer i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2 før du begynner åndedrett eksperimenter.

2. utarbeidelse av celler for høy oppløsning Respirometry

  1. Behandle 832/13 celler med kakao avledede epicatechin monomer.
    1. Kultur 832/13 celler for 24 timer etter overflate i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
    2. Endre media 24 timer etter plating og behandle 832/13 celler med kjøretøy (3 wells) eller 100 nM kakao monomer (3 wells), etterfulgt av kultur for en ekstra 24 h (48 h totalt) i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
    3. Vask 832/13 celler i 1 x lav glukose sekresjon analysebuffer (SAB) 5 min. leveringstanken bufferen, og ruge 832/13 celler i 1 x lav glukose SAB for 3 h, endre 1 x lav glukose SAB hver time.
      1. Gjør 10 x SAB med 33.32 g av NaCl, 1,73 g KCl, 0,82 g KH2PO4, 0,7 g MgSO4 og legge H2O til en endelig mengde 500 mL. Sterilt filter den endelige løsningen.
      2. Lag 1 x lav glukose SAB med 10 mL 10 x SAB, 100 µL av 45% glukose, 2 mL 1 M HEPES, 1 mL av 0,25 M CaCl2, 0.57 mL av 35% BSA løsning, 0.21 g NaHCO3 og legge H2O til en endelig volum 100 mL. Sterilt filter den endelige løsningen.
  2. Behandle 832/13 celler med curcumin.
    1. Kultur 832/13 celler for 48 timer etter overflate i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
    2. Vask 832/13 celler i 1 x lav glukose SAB 5 min. leveringstanken bufferen, og ruge 832/13 celler i 1 x lav glukose SAB for 3 h, endre 1 x lav glukose SAB hver time.
    3. Etter 2,5 timer med 3t inkubasjon i 1 x lav glukose SAB, Sug opp buffer og ruge celler i 1 x lav glukose SAB kjøretøy kontroll eller 40 µM curcumin i 30 min. Sug opp bufferen etter inkubasjon.
  3. Høste celler med trypsin for høy oppløsning respirometry
    1. Etter den 3t inkubering i 1 x lav glukose SAB, fjerne celler fra platen med 250 µL av 0,25% trypsin per brønn.
    2. Kombinere cellene i trypsin fra 3 brønner behandlet med kjøretøy kontroll eller sammensatte interesse med 4 mL SAB i et 15 mL konisk rør.
    3. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og fortynne 100 µL av cellen fra trinn 2.3.2 i 900 µL av PBS.
    4. Fortynne riktig antall celler i 1 x lav glukose SAB å gjøre 3 mL på riktig konsentrasjonen for hvert kammer. Dataene viser at en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL er den mest effektive.
  4. Høste celler med mekanisk avstandtagen for høy oppløsning respirometry
    1. Etter den 3t inkubering 1 x lav glukose SAB, legger 1 mL 1 x lav glukose SAB hver godt og forsiktig blåse celler av platen med mekanisk dissosiasjon av pipettering med 1000 µL pipette tips.
    2. Kombinere cellene fra 3 brønner behandlet med kjøretøy kontroll eller sammensatte interesse for totalt 3 mL SAB i et 15 mL konisk rør for åndedrett.

3. høy oppløsning Respirometry

  1. Utarbeidelse av høy oppløsning respirometer.
    1. Slå på høy oppløsning respirometer og koble til skrivebordet ved å lansere programmet respirometer analyse.
    2. Sug opp 70% etanol fra begge kamre. Nyt disse rommene i 70% etanol i minst 45 min.
    3. Vask kamrene to ganger med 70% etanol, aspirating etter hvert trinn.
    4. Vask kamrene tre ganger med ddH2O, aspirating etter hvert trinn.
    5. Skyll kammer stempler i ddH2O. Denne renser av gjenværende etanol fra stemplene og fra Titan.
  2. Kalibrering av polarographic oksygen sensorer.
    1. Legge til 2,4 mL 1 x lav glukose SAB buffer i hver oxygraph kammer, røring bufferen kontinuerlig med magnetic røre barer i kammeret ved 750 rpm og 37 ° C med en data-innspillingen intervallet på 2,0 s ved å trykke F7-knappen og åpne kategorien merket "Systemer". Presse stempler helt inn, og deretter trekke til innstillingen fastnøkkel lufting. La maskinen equilibrate i minst 1 time til stabile oksygen fluks er oppnådd.
    2. Angi maskinen på 37 ° C for varigheten av eksperimentet. Angitt polarisering spenning til 800 mV, med en gevinst på 2 ved å trykke F7-knappen og åpne kategorien merket "Oksygen, O2". Equilibrate oksygen konsentrasjonen av SAB bufferen for minst 30 min, mens endringen i oksygen konsentrasjon er stabil (mindre enn 2 pmol/(s*mL)).
    3. Etter oksygen konsentrasjon stabilisering, velger du et område hvor oksygen konsentrasjon er stabil å etablere bakgrunn måling av endring i oksygen konsentrasjon.
      1. Velg et område ved å presse Skift, venstre-klikke på musen og dra musen over den valgte regionen. Klikk på bokstaven for den valgte regionen og endre til "R1" for hvert spor, samsvarer med hver kinesere.
      2. Dobbeltklikk på boksen "O2 kalibrering" i nedre venstre og høyre hjørnene på skjermen, velger du knappen "Velg merket" for "air kalibrering" som R1 og velg "kalibrere og kopier til utklippstavlen" for begge kamre.
  3. Vurdering av respirasjon 832/13 beta celler i trinnene 2.1.5 eller 2.2.5.
    1. Laster inn 2,4 mL utvalg i hvert kammer (et kammer med kontroll kjøretøy behandlet celler, et kammer med sammensatte behandlet celler) 1 x lav glukose SAB. Beholde 0,5 mL celle utvalg for protein kvantifisering av BCA (Bicinchoninic acid) analysen hvis ved hjelp av mekanisk dissosiasjon tilnærming (Frys på 20 ° C for måling senere).
      1. Skyv stempelet helt og Sug opp residualvolum. Rør celler kontinuerlig i hele eksperimentet på 750 rpm og 37 ° C for alle etterfølgende trinnene. Lage et merke ved å klikke F4 og merking som "celler" når prøver er lastet.
      2. Mål prøver for 30 min. Når signalet stabilisering, merker du et område av endringen i oksygen konsentrasjon tilsvarer lav glukose betingelsene (2,5 glukose) som beskrevet i 3.2.3.
    2. Når signalet stabilisering er nådd, legger du til 12,5 µL av en 45% sterilt glukose løsning (16,7 mM endelige konsentrasjon) i hvert kammer gjennom Titan lasting port bruker en sprøyte. Lag et merke målt "Glukose" som beskrevet i 3.3.1 når behandling. La signal stabilisere og registrere cellular respirasjon til en stabil oksygen fluks er oppnådd. Velg denne regionen av endringen i oksygen konsentrasjon, som beskrevet i 3.2.3. Dette er 16,7 mM glukose lesing, og tilsvarer stimulerende forhold7.
    3. Når signalet stabilisering er nådd legge 1 µL av 5mM oligomycin en (2,5 µM siste konsentrasjon) i hvert kammer gjennom lasting port. Lag et merke målt "OligoA" som beskrevet i 3.3.1 når behandling. La signal stabilisere og registrere cellular respirasjon til en stabil oksygen fluks er oppnådd. Velg denne delen av kurven som beskrevet i 3.2.3. Oligomycin A hemmer ATP syntase og dermed den eneste oksygen flux forekommende er via lekkasje av elektroner og ikke oxidative fosforylering7.
    4. Når signalet stabilisering er nådd legge 1 mM FCCP i 1 µL trinn til en maksimal pustefrekvens er opprettet. Dette representerer maksimal montert åndedrett. Mellom 3-4 µL er FCCP tilstrekkelig (1.5-2.0 µM siste konsentrasjon) å indusere maksimal montert åndedrett INS-1 832/13 celler. Lage et merke merket "FCCP" som beskrevet i 3.3.1 når behandling. La signal stabilisere og registrere cellular respirasjon til en stabil oksygen fluks er oppnådd. Velg denne delen av kurven som beskrevet i 3.2.3. FCCP er en uncoupling agent. Dette tillater oss å måle montert åndedrett7.
    5. Når signalet stabilisering er nådd legge 1 µL av 5 mM Antimycin A (2,5 µM siste konsentrasjon) i hvert kammer gjennom lasting port. Lage et merke merket "AntiA" som beskrevet i 3.3.1 når behandling. La signal stabilisere og registrere cellular respirasjon til en stabil oksygen fluks er oppnådd. Velg denne delen av kurven som beskrevet i 3.2.3.
      Merk: Antimycin A binder cytochrome C reduktase, hemmer ubiquinone oksidering og blokkerer alle åndedrett. Dette tillater oss å absolutt opphøre åndedrett7.
  4. Måle 832/13 beta celler for protein konsentrasjon og respirasjon normalisering.
    1. Bruker den 0,5 mL av prøve beholdt på lasting, måle protein utvalget med BCA metoden13.
    2. Kjøre hvert utvalg i tre eksemplarer, uten fortynning, følg produsentens instruksjoner.
  5. 832/13 beta-celle åndedrett beregninger fra trypsinized celler.
    1. Angi antall celler per mL bruk i analysen ved å trykke på F3-knappen av respirometer analyseprogram. Endre enhetene til celler/mL, angi mobilnettet konsentrasjonen og endre medium til SAB.
    2. Velg bakgrunn opplesninger å normalisere data ved å velge og inngå O2 kalibrering skjemaet som beskrevet i 3.2.3.
    3. Foreta valg av målinger fra 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, Oligomycin A, FCCP og Antimycin A som beskrevet i 3.3.1.
    4. I respirometer analyseprogrammet, eksportere målinger for hvert kammer etter inn protein konsentrasjon og velge riktig gjennomsnittsverdiene for hver behandling under åndedrett målingen. Dette gjøres ved å klikke F2 og deretter trykke på "Kopier til utklippstavlen-funksjonen". Eksporteres dataene for bruk i andre analyse programmer. Bruke "O2 skråningen uaktso" verdiene for beregninger.
    5. Samle data for 3-5 uavhengige kjører kjøretøy behandlet kontroller og naturlige forbindelser behandlet celler for å fastslå effekten på intakt cellular respirasjon INS-1 832/13 beta celler.
  6. 832/13 beta-celle åndedrett beregninger fra mekanisk dissosiert celler.
    1. Angi protein beregningene fra BCA analysen ved å trykke på F3-knappen av respirometer analyseprogram. Endre enhetene til mg, angi BCA konsentrasjonen og endre medium til SAB.
    2. Velg bakgrunn opplesninger å normalisere data ved å velge og inngå O2 kalibrering skjemaet som beskrevet i 3.2.3.
    3. Foreta valg av målinger fra 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, Oligomycin A, FCCP og Antimycin A som beskrevet i 3.3.1.
    4. I respirometer analyseprogrammet, eksportere målinger for hvert kammer etter inn protein konsentrasjon og velge riktig gjennomsnittsverdiene for hver behandling under åndedrett målingen. Dette gjøres ved å klikke F2 og deretter trykke på "Kopier til utklippstavlen-funksjonen". Eksporteres dataene for bruk i andre analyse programmer. Bruke "O2 skråningen uaktso" verdiene for beregninger.
    5. Samle data for 3-5 uavhengige kjører kjøretøy behandlet kontroller og naturlige forbindelser behandlet celler for å fastslå effekten på intakt cellular respirasjon INS-1 832/13 beta celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

INS-1 832/13 beta celler som er forberedt og høstet som beskrevet i protokollen vil demonstrere moduleringshjul i oksygenforbruk basert på de ulike kjemiske tiltakene (figur 1A). Bli vil observert en økning i åndedrett når glukose konsentrasjonen er økt til 16,7 mM glukose (figur 1B). Respirasjon reduseres når intakt cellene behandles med Oligomycin A. Denne åndedrett kalles lekkasje, som er definert som den basale, nonphosphorylating åndedretts tilstanden. Maksimal åndedrett vil oppnås når beta-cellene behandles med uncoupling agent FCCP, som er definert som ETS åndedrett eller elektronet transport system åndedrett. Til slutt, åndedrett slippe til null når behandlet med Antimycin A, merket som ROX (gjenværende oksygenforbruk) som refererer til den ikke-luftveier mobilnettet oksygenforbruk.

Forskjeller i celle nummer vil vesentlig endre kvaliteten på dataene innhentet fra denne teknikken. Glukose-indusere åndedrett ble målt på 0,5 og 1 2 x 106 celler/mL (figur 2A2 C). Bruke celletall og BCA søk protein, protein konsentrasjoner tilsvarer tre testet cellen konsentrasjoner ble beregnet (figur 2D). Mål med 0.5 x 10 viste6 celler/mL kunne demonstrere glukose-stimulert åndedrett (figur 2A) og bare ETS tilknyttede økt åndedrett seg å være betydelig. Dette tyder på at lav celle nummer resulterer i et svakt signal til støyforhold som forundrer resultatene. Tilsvarende resultert målinger på 2 x 106 celler/mL også i betydelige variasjon, som indikert av statistiske betydning bare blir nådd for ETS målinger (figur 2C). Dette skyldes antagelig måtte re oxygenate kamrene flere ganger under analysen, som resulterte i større variasjon fra prøve å prøve. Disse dataene viser at konsentrasjoner av 1 x 106 celler/mL resultere i betydelige glukose-stimulert åndedrett, lekkasje og ETS målinger, som er nødvendige for åndedrett analyser (figur 2B og 2E).

To metoder for å fjerne celler for åndedrett presenteres i denne protokollen. Bruke trypsin for å fjerne celler er effektiv når målingene er fullført på 37 ° C. Respirasjon målinger gjort i fravær eller tilstedeværelse av curcumin (figur 3A) viser vedlikehold av glukose-stimulert åndedrett, lekkasje og ETS åndedrett. Sammenligning av curcumin behandlet celler til ubehandlet celler viser ikke endre noen av parameterne åndedretts (figur 3BC). Respirasjon målinger gjort i fravær eller tilstedeværelse av kakao epicatechin monomer (figur 3D) demonstrerer også vedlikehold av glukose-stimulert åndedrett, lekkasje og ETS åndedrett. Sammenligning av kakao epicatechin monomer behandlet celler til ubehandlet celler viser økt åndedrett på 2,5 og 16,7 mM glukose og lekkasje og ETS åndedrett (figur 3E-F). Disse dataene viser at mens curcumin ikke styrkes 832/13 beta-celle åndedrett, kakao epicatechin monomer gjør (Figur 3 g). Curcumin har vist seg å forbedre insulinsekresjon gjennom hemme fosfodiesterase aktivitet14. Våre data tyder på at curcumin ikke styrkes insulinsekresjon gjennom modulerende mitokondrie funksjon. Vi har allerede vist at kultur i nærvær av kakao epicatechin monomerer induserer uttrykk for ulike komponenter i mitokondrie elektronet transport kjeden5. Vi også observert økt åndedrett i lekkasje tilstand (indusert av behandling med oligomycin) og med ETS (elektronet transportsystem, av FCCP). Bruk av dette verktøyet foreslår en rekke potensielle mål for framtidige studier.

Som et alternativ til trypsin fjerningen av celler, kan mekanisk dissosiasjon gjøres ved hjelp av presentert vask teknikk når fullført på 37 ° C. Respirasjon målinger ble gjort i fravær eller curcumin eller kakao epicatechin monomer (figur 4A-C). Disse dataene viser at trendene observert med trypsin utarbeidelse av cellene er opprettholdt, men følsomheten synes å bli redusert. Mens kontroll og kakao epicatechin monomer behandlet celler vedlikeholdt glukose-stimulert, beholdt lekkasje og ETS åndedrett, cellene behandlet med curcumin bare glukose-stimulert åndedrett på grunn av økt prøve å sample variasjon. Mens trender observert med trypsin celle forberedelsene ble opprettholdt (Figur 4 d-F), betydningen reduseres i alle parametere, antagelig større prøve å sample variasjon introdusert av mekanisk dissosiasjon og normalisering protein konsentrasjon i stedet for celle tall.

Disse dataene viser at denne protokollen kan brukes til å måle åndedrett av intakt INS-1 832/13 beta-cellene. Videre antyder våre protokollen en optimal celle nummer for nøyaktige målinger og foretrukne metode for å forberede cellene for å maksimere signal til støyforhold.

Figure 1
Figur 1 : Representant åndedrett kurve intakt 832/13 beta celler. Intakt 832/13 beta-cellene måles for respirasjon i (figur 1A) 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP (karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) og 2,5 µM Antimycin A. En utvidelse av 16,7 mM glukose delen (figur 1B) presenteres for å demonstrere økningen i glukose-stimulert åndedrett. Cellene ble målt på en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL. LEKKASJEN refererer til den basale nonphosphorylating åndedretts tilstanden ETS refererer montert åndedretts kapasitet av elektronet transport og ROX refererer til den gjenværende oksygenforbruk etter at mitokondrie åndedrett er hemmet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Bestemmelse av antall 832/13 beta celler nødvendig for glukose-indusert åndedrett målinger. Intakt 832/13 beta-cellene måles for respirasjon i konsentrasjoner av (A) 0.5 x 106 celler/mL (B) 1 x 106 celler/mL, eller (C) 2 x 106 celler/mL. (D) Protein konsentrasjoner som samsvarer med 0.5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL og 2 x 106 celler/mL. (E) sammenligning av åndedrett på 0,5 x 106 celler/mL, 1 x 106 celler/mL og 2 x 106 celler/mL. Respirasjon ble målt under 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A forhold. Respirasjon med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glukose-stimulert åndedrett responsen av beta-cellene. Respirasjon etter oligomycin viser lekkasje åndedrett (basale, nonphosphorylating åndedretts tilstand). Respirasjon etter FCCP (karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (montert åndedretts kapasitet av elektronet transportsystem, ETS). n = 6 uavhengige kjører. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Åndedrett målinger av 832/13 beta-cellene etter bruker trypsin. 832/13 beta celler ble kultivert i tilstedeværelse eller fravær av monomerisk kakao epicatechin eller curcumin og respirasjon ble målt etter frigir celler ved hjelp av trypsin. Respirasjon ble målt under 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A forhold. Respirasjon med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glukose-stimulert åndedrett. Respirasjon etter oligomycin viser lekkasje åndedrett (basale, nonphosphorylating åndedretts tilstand). Respirasjon etter FCCP (karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (montert åndedretts kapasitet av elektronet transportsystem, ETS). Respirasjon etter antimycin en behandling viser gjenværende oksygenforbruk (ROX). (A) behandling av 832/13 celler med curcumin opprettholder de nødvendige endringene i åndedrett på grunn av behandlingene. (B) representant spor og (C) gjennomsnittlig av data for cellene behandlet med curcumin viser ingen endring 832/13 beta-celle åndedrett. (D) behandling av 832/13 celler med kakao epicatechin monomer opprettholder de nødvendige endringene i åndedrett på grunn av behandlingene. (E) representant spor og (F) gjennomsnittlig data for kakao epicatechin monomer behandlet celler demonstrerer økt åndedrett i alle parametere etter kakao epicatechin monomer behandling. (G) alle tre parametere presenteres sammen for sammenligning. n = 6 uavhengige kjører. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, *** p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Åndedrett målinger av 832/13 beta-cellene etter utgivelse ved hjelp av mekanisk dissosiasjon. 832/13 beta celler ble kultivert i tilstedeværelse eller fravær av monomerisk kakao epicatechin eller curcumin og respirasjon ble målt etter frigir celler ved hjelp av mekanisk dissosiasjon. Respirasjon ble målt under 2,5 glukose, 16,7 mM glukose, 2,5 µM Oligomycin, 2 µM FCCP og 2,5 µM Antimycin A forhold. Respirasjon med 2,5 og 16,7 mM glukose demonstrere glukose responsen av beta-cellene. Respirasjon etter oligomycin viser lekkasje åndedrett (basale, nonphosphorylating åndedretts tilstand). Respirasjon etter FCCP (karbonyl cyanid -4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) behandling viser (montert åndedretts kapasitet av elektronet transportsystem, ETS). Gjennomsnittet av dataene for celler (A) ubehandlet celler eller celler som behandles med (B) curcumin eller (C) kakao epicatechin monomer demonstrere at mekanisk dissosiasjon opprettholder glukose-stimulert åndedrett i alle behandlinger, mens lekkasje og ETS betydning er tapt i curcumin behandlet celler. Sammenligning av ubehandlet celler (D) curcumin eller (E) kakao epicatechin monomer viser økt åndedrett i alle parametere med kakao epicatechin monomer med ingen vesentlige endringer åndedrett med curcumin. (F) alle tre parametere presenteres sammen for sammenligning. n = 6 uavhengige kjører. Data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne protokollen er å bruke høy oppløsning respirometry for å måle åndedretts priser i intakt bukspyttkjertelen beta-cellene. Denne metoden tillater måling av beta-celle respons på økt blodsukkeret. Protokollen kan også forbehandling med ulike forbindelser, som vist i denne protokollen med naturlig forekommende monomerisk epicatechin eller curcumin4,5. Behandling med ulike andre forbindelser kan brukes i denne protokollen, med forbehandling (som vist her), eller ved å behandle i luftveiene kamrene med minimal modifikasjoner til base-protokollen.

Det finnes ulike måter som denne metoden kan endres. Andre beta linjer kan brukes; imidlertid må celle nummer og SAB vask ganger bestemmes eksperimentelt. Primære gnagere og menneskelige holmer kan også brukes; antall celler eller Holme ekvivalenter må imidlertid også bestemmes eksperimentelt. Minst én studie har målt Holme oksygenforbruk med høy oppløsning respirometry15. Denne studien kreves 400 holmer per reaksjon, men hadde ikke måle glukose indusert åndedrett endringer. Gitt at primære vev brukes ofte med høy oppløsning respirometers16,17, kan intakt holmer brukes etter eksperimentelle feilsøking. Men kan gitt det store antallet holmer kreves for denne analysen, andre metoder for måling oksygenforbruk være bedre egnet for målinger av primære Holme åndedrett.

Det er noen viktige skritt med presentert protokollen. Først er har et tilstrekkelig antall celler kritiske. Våre studier viser at 832/13 beta-cellene i en konsentrasjon av 1 x 106 celler/mL er tilstrekkelig for glukose-stimulert åndedrett målinger. Mål med 0.5 x 10 vist6 celler/mL lav glukose-stimulert åndedrett og et svakt signal til støyforhold. Videre resulterte mål med 2 x 106 celler/mL i høye prøve å prøve variasjon og rask mobilnettet bruken av oksygen som kreves re oxygenate og ofte ført til rask celledød. Riktig antall celler bør fastsettes eksperimentelt for gitt celle linjen for å feilsøke denne viktige skritt.

Andre kritiske trinnet forbereder beta-cellene til å svare på forhøyet blodsukker nivåer. RPMI 1640 kultur mediene har høyt blodsukker nivåer. Cellene må flyttes fra den høye glukose til en lav glukose kultur. En 3t inkubasjon i 1 x lav glukose SAB er tilstrekkelig for beta-cellene har en betydelig respons på tillegg av ~16.7 mM glukose. Vask perioder med mindre enn 3 h føre variabel Svar å tillegg av glukose. Glukose svar feilsøking kan rettes ved å øke SAB vask tiden.

En tredje kritiske trinnet er metoden for å forberede cellene for målinger. Våre data viser at mens trypsin og mekanisk dissosiasjon kan begge brukes, trypsin utgitt celler resultat mer konsekvent opplesninger og mindre prøve å sample variasjon. Trenden med begge metodene ble opprettholdt, men styrken på dataene var større med celler tilberedt med trypsin. Mens andre metoder, som cellen skraping, kan brukes tyder våre data på at bruken av trypsin vil resultere i mest reproduserbar resultatene med mindre prøve å sample variasjon18,19.

Begrensninger av denne tilnærmingen omfatter følgende: Først med bare to behandling chambers er dette ikke en høy gjennomstrømning screening metode. Hver kjøring av to prøvene tar mellom 3-4 h, inkludert tid til å forberede maskinen. Andre kreves en relativt stor konsentrasjon av celler for analysen, gitt det ~2.2 mL av prøven (eller ~2.2 x 106 celler) nødvendig per kammer. På grunn av prøven kreves for analysen, begrenses bruken av dette verktøyet og protokollen for primære holmer med mindre en stor forsyning er tilgjengelig. De tidligere studiene som har brukt holmer i åndedrett i denne teknikken brukes ~ 400 holmer/kammer15. Dette vil kreve omtrent, holmer fra to mus for hvert kammer20. Tredje fordi permeabilized celler ikke blir brukt, er muligheten til å fastslå effekten av behandlingen på individuelle elektron kjeden komponenter ved hjelp av forbindelser som ikke er cellen permeable ikke tilgjengelig.

Det finnes en rekke betydelige fordeler av denne protokollen med hensyn til eksisterende metoder. Først tillater denne protokollen gradvis Serine ulike membran permeable forbindelser. Dette gir nøyaktig bestemmelse av nødvendig konsentrasjoner. Andre tillater bruk av intakt beta-cellene oss å spørre effekten på cytosolic og mitokondrie glukose metabolisme7. Dette tillater oss å observere fenotyper om endringer i glycolytic veien, en observasjon når benytter permeabilized celler. Tredje tillater intakt cellene oss å bruke svaret opphøyet glukose som en beregning av beta-celle funksjonen, som er tapt i permeabilized varianter av denne analysen. Til slutt gir denne protokollen tillegg av ulike og flere forbindelser spørre effekten av forbindelser på beta-celle åndedrett, en luksus som ikke finnes andre verktøy som måler åndedrett.

Fremtidige anvendelser av denne metoden inkluderer muligheten til å måle parametere som ATP, kalsium og H2O2 nivåer samtidig med åndedrett målinger. Denne metoden tillater også for måling av åndedrett i nærvær av andre drivstoff kilder, for eksempel fettsyrer eller ketoner. Til slutt, med noen endringer kan måle utskilles insulin nivåer samtidig med åndedrett mål også være mulig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Tessem og Hancock labs assistent og vitenskapelig diskusjon. Forfatterne takke Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) for å gi kakao avledede epicatechin monomer brøken. Denne studien ble støttet av et stipend fra Diabetes Action Research og Education Foundation til JST.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O2k Core: Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10000-02 Instrument for high-resolution respirometry
DatLab 6 Program Oroboros Instruments 27141-01 Computer program for analysing high-reolution respirometry
INS-1 832/13 cell line Duke University Medical Center NONE Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard
Curcumin Sigma C7727 Pre-treatment of beta cells
Cocoa epicatechin monomer Virginia Polytechnic Institute and State University NONE Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson
Trypsin Sigma T4049 For cell culture
RPMI-1640 Sigma R8758 832/13 beta cell media
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 832/13 beta cell media component
Penicillin-streptomycin Sigma P4458 832/13 beta cell media component
HEPES Sigma H3662 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer
Glutamine Caisson GLL01 832/13 beta cell media component
Sodium Pyruvate Sigma S8636 832/13 beta cell media component
2-Mercaptoethanol Sigma M3148 832/13 beta cell media component
NaCl Fisher S271 Component of 10x SAB buffer
KCl Sigma P9541 Component of 10x SAB buffer
KH2PO4 Sigma P5655 Component of 10x SAB buffer
MgSO4 Sigma M2643 Component of 10x SAB buffer
D-(+)-Glucose Solution Sigma G8769 Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay
CaCl2 Sigma C5670 Component of 1x SAB buffer
35% BSA Solution Sigma A7979 Component of 1x SAB buffer
NaHCO3 Sigma S5761 Component of 1x SAB buffer
200 proof ethanol Sigma 459844 Washing Oxygraph O2k Chambers
Oligomycin A Sigma O4876 Chemicals for respiration assay
FCCP Sigma C2920 Chemicals for respiration assay
Anitmycin A Sigma A8674 Chemicals for respiration assay
BCA Protein Kit Thermo Fisher 23225 For determining protein concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueckler, M., Thorens, B. The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Weir, G. C., Bonner-Weir, S. Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes. Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).
  4. Strat, K. M., et al. Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders. J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).
  5. Rowley, T. J. T., et al. Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration. J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).
  6. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells. J Vis Exp. (120), (2017).
  7. Reynolds, M. S., et al. beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).
  8. Hals, I. K., et al. Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia. PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).
  9. Ray, J. D., et al. Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos. FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).
  10. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  11. Tessem, J. S., et al. Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).
  12. Hobson, A., et al. Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway. Islets. 7 (1), e1027854 (2015).
  13. Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation. J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).
  14. Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity. J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).
  15. Ma, Z., et al. Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction. Islets. 4 (3), 233-242 (2012).
  16. Chavanelle, V., et al. Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice. Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).
  17. Jelenik, T., et al. Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver. Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).
  18. Spacek, T., et al. Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential. Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).
  19. Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).
  20. Johnson, J. D., et al. Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets. Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).

Tags

Mobilnettet biologi problemet 131 Beta-celle mitokondrier åndedrett glukose høy oppløsning respirometry kakao epicatechin monomer curcumin
Høy oppløsning Respirometry å måle mitokondrie funksjon av intakt Beta-cellene i nærvær av naturlige forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock,… More

Kener, K. B., Munk, D. J., Hancock, C. R., Tessem, J. S. High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds. J. Vis. Exp. (131), e57053, doi:10.3791/57053 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter