Summary
本稿では、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの 5-アミノレブリン酸による光線力学療法 (アラ-PDT) の抗菌効果を研究するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、PDT を細菌バイオ フィルムの処理は、将来的に研究する生体外モデルを開発する使用ことができます。
Abstract
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、化膿性および全身感染症を引き起こす一般的なひと病原体です。黄色ブドウ球菌感染症は、抗生物質耐性菌の出現だけでなく、バイオ フィルム フォームする能力だけではなくを根絶することは困難。最近では、光線力学療法 (PDT) は、バイオ フィルム感染症を制御するための潜在的な治療の一つとされています。しかし、さらに研究は根本的なメカニズムと同様、細菌バイオ フィルムへの影響に関する我々 の知識を向上させる必要があります。本稿では、実際の光線、プロトポルフィリン IX (PpIX) の前駆体 5-アミノレブリン酸 (ALA) と PDT のin vitroモデルについて説明します。簡単に言えば、成熟した黄色ブドウ球菌バイオ フィルムは ALA に培養され、光にさらされます。その後、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに対する翼-PDT の抗菌効果はコロニー形成単位 (CFUs) を計算することによって定量化され生存率共焦点レーザーのスキャン顕微鏡検査 (CLSM) を介して染色蛍光で可視化しました。代表の結果は、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに対する翼-PDT の強力な抗菌効果を示した。このプロトコルは簡単、ALA PDT と黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの治療を研究する生体外モデルを開発に使用できます。将来は、最小限の調整で異なる菌株の他の光増感剤を用いた PDT 研究でまた参照することができます。
Introduction
黄色ブドウ球菌は、皮膚と粘膜の人間のホストの定着グラム陽性の病原体が重要です。バイオ フィルム フォームする能力は、その病因1の重要な側面と見なされます。細菌バイオ フィルムは、細菌の細胞外高分子物質、多糖類、DNA、タンパク質などから構成される自主制作のマトリックスに埋め込まれたコミュニティです。この行列は、細菌感染症、人間の免疫システムと現在の抗菌療法2への抵抗の高度に貢献する永続化に重要な役割を果たしています。抗生物質が、バイオ フィルム感染症の主な治療バイオ フィルムに対する抗生物質の効果は限られているが。それは、バイオ細胞は 10-1,000 倍以上の浮遊性対応3に比べて抗生物質に耐性を以前示されています。したがって、この問題を征服するための代替戦略が必要です。
細菌感染症のための代替治療、PDT は、光増感剤を有効にするのに適切な波長の光を使用します。これは、細胞壁を破壊し酵素を不活性化、損傷 DNA4標的細胞致死活性酸素種 (ROS) の生産に します。このマルチ ターゲット特性 PDT 治療への抵抗を開発する細菌の困難になります。
トルイジン ブルーなど、複数の光増感剤で、細菌や真菌性バイオ フィルム、マラカイト グリーン、メチレン ブルー、塩素 e6、ポルフィリンの PDT の抗菌効果は、以前レポート5,6、検討されています 7,8,9,10、11,12,13。5-ALA の実際の光増感剤 PpIX、プロドラッグは、その分子量が小さいと迅速なクリアランス12,14が特徴です。これらの利点は、治療への応用としてアラ-PDT の主要な潜在性を与えます。浮遊性細菌に及ぼす翼-PDT は、多くのグループ12によって研究されているがその細菌バイオ フィルムの翼-PDT の抗菌効果はまだ解明されていません。一方、先行研究の結果を比較することは困難です。理由の 1 つは、多様なグループが使用する別のプロトコルです。したがって、このプロトコルは、私たち以前の作業15に基づく翼-PDT システムの生体外モデルをについて説明します。CFU 計算と CLSM で染色性がこのモデルの効果を確認しました。
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Protocol
1. バイオ フィルム形成
-
96 ウェル マイクロ プレートでのバイオ フィルムの形成
- 黄色ブドウ球菌株 usa 300 および 3 バイオ フィルム形成の臨床株 (C1 - C3)-80 ° C で保存を取得します。
注: バイオ フィルムは、マイクロタイター プレート アッセイによって決定されたフォームに臨床系統の能力15前述。 - 5 mL トリプトン大豆スープ (TSB) 培地で菌を接種して固定相に一晩 37 ° C で揺れでインキュベーターで育成します。
- 25 ° C で 10 分間 4,000 x g で一晩かけて細菌培養を遠心し、上澄みを廃棄します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2.0 x 10 の最終的な集中でペレットを再懸濁します9 CFU/mL。
注: 細菌の濃度は光学濃度を測定することにより推定し、プレートによって決定されます16、明らかに含まれている懸濁液の 1 外径600 1.5 x 10 を数えて8 CFU/mL。 - 1: 200 の細菌懸濁液を希釈 (1.0 x 107 CFU/mL) の TSB 培 0.5% ブドウ糖。細胞文化扱われるポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートの各ウェルに細菌懸濁液 200 μ L を接種します。
- よく酸素環境下での 24 h の 37 ° C で静的にマイクロ プレートを孵化させなさい。
注: 成熟バイオ フィルムの形成のための培養時間異なる場合があります別の細菌の緊張。これは、PDT 実験15前に決定する必要があります。 - 井戸にメディアを破棄し、3 回 PBS で軽くマイクロ プレートのウェルを洗浄し上澄みを廃棄します。
注: ステップ実施されなければならない非常に穏やかに形成されたバイオ フィルムを妨害を避けるために。
- 黄色ブドウ球菌株 usa 300 および 3 バイオ フィルム形成の臨床株 (C1 - C3)-80 ° C で保存を取得します。
-
料理のバイオ フィルム形成
- 黄色ブドウ球菌株 usa 300 を TSB 培地 5 mL に接種して固定相に一晩 37 ° C で揺れでインキュベーターで育成します。
- 25 ° C で 10 分間 4,000 x g で一晩かけて細菌培養を遠心し、上澄みを廃棄します。2.0 × 10 の最終的な集中に PBS でペレットを再懸濁します9 CFU/mL。1: 200 の細菌懸濁液を希釈して、(1.0 x 107 CFU/mL) の TSB 培 0.5% ブドウ糖。35 mm の光学的品質ガラス底細胞培養ディッシュに細菌懸濁液 2 mL を接種して、24 h の 37 ° C で静的に孵化させなさい。
注: 光学濃度を測定することによって、細菌の濃度が推定されました。 - 、ピペットでメディアを吸引し、すすいで、バイオ フィルム PBS で軽く皿に 3 回、上澄みを慎重に廃棄します。
注: は、皿の底にピペット チップを触れないでください。ステップ 2.2 は、形成されたバイオ フィルムの乾燥を防ぐためにこのステップの直後に行わなければなりません。
2. 光照射
- 4 ° C の冷蔵庫 5 ALA を格納します。実験前に、5-アラは PBS で 10 mM を希釈します。
注: 5 ALA ソリューションは、たて実験前に準備する必要があります。 - 実験群は培養皿に 2 mL のマイクロ プレートの各ウェルに 10 mM 翼の 200 μ L を追加します。カバー、アルミ箔をプレート/皿と 1 時間孵化させなさい。その後、100 mW/cm2 360 J/cm2 633 ± 10 nm17の主要な波長の光量を達成するために 1 時間の光強度と光発光ダイオード (LED) が付いているプレート/皿を照射します。
注: 光エネルギー井戸/料理のすべてでバイオ フィルムを効果的かつ均等に配信されるために、光源のピークから 6.0 cm でよく/皿までの距離を修正し、中央照射面積 (10 cm x 8 実験領域を制限cm). 結果の再現性のある、同じ室温で実験する必要がありますように。
LED 照射ステップ プレートのひ、部屋の照明や日光など他の光源への直接露出を避けるために LED が照射面積プレート/皿を移動する前にオンし、ライトは操作を完了する十分な明るさだった。 - (当社実験で設定された 3 つの制御グループ)、コントロール グループを設定します。
- 最初のコントロールのグループ (ALA - LED-) は 200 μ L の PBS を各ウェル マイクロ プレートの培養皿に 2 mL に追加します。カバー、アルミ箔をプレート/皿と 2 時間インキュベートします。
- 2 つ目の管理グループのため (翼 + LED-)、各ウェルのマイクロ プレートまたは培養皿に 2 mL に 10 mM 翼の 200 μ L を追加。カバー、アルミ箔をプレート/皿と 2 時間インキュベートします。
- 3 番目のコントロール グループの (翼-LED +)、各ウェルのマイクロ プレートまたは培養皿に 2 mL を 200 μ L の PBS を追加。カバー、アルミ箔をプレート/皿と 1 時間インキュベートします。360 J/cm の2の光 633 ± 10 nm17の主要な波長で照射を LED にプレートを公開します。
注: LED 照射手順でプレートの日光、部屋の照明やひなど他の光源への直接露出を避けてください。
3 PDT 治療の有効性の測定法
注意: ALA PDT の黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす影響を確認するには、ALA PDT の有無と細胞の生存率は CFU を数えることによってだけでなく、生存率の汚損によってに評価されます。
-
残りの実行可能な細菌細胞の決定
- アラ-PDT 治療後井戸にメディアを破棄し、両方の実験のすべての非付着性のセルを削除し、グループを制御する PBS の井戸を 3 回洗浄します。
注: この手順実施されなければならない非常に穏やか。 - ピペット チップと井戸から徹底的に細菌付着細胞をこすり、円錐管の細胞を収集します。
- 4 ° C で 10 分間 4,000 x g で細菌懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- PBS で 0.25% パンクレアチン酵素の 1 mL 中の細菌を再懸濁します、1.5 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 10 分間; 4,000 x g で遠心します。、上澄みを廃棄し、200 μ L の PBS でペレットを再懸濁します。
- 1:10; PBS のセル溶液のシリアル希薄を作るトリプトン宗谷 (TSA) 寒天培地プレート上に各シリアル希釈サンプルの 5 μ L を追加します。16 h; 37 ° C で TSA プレートを孵化させなさいその後、(裸眼) で細菌のコロニー (CFU/mL) の数をカウントします。
- アラ-PDT 治療後井戸にメディアを破棄し、両方の実験のすべての非付着性のセルを削除し、グループを制御する PBS の井戸を 3 回洗浄します。
-
CLSM による黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの観察
- 光照射後、PBS で培養皿でバイオ フィルムを 3 回洗浄します。
注: この手順実施されなければならない非常に穏やか。 - 1 μ M の緑色蛍光核の透過性は、原核生物の細胞膜 (例えばSYTO9)、1 μ M propidium ヨウ化 (PI) バイオ フィルムとして死んだ細胞を染色する 20 分の 1 mL 染色体染色 1 mL を追加します。
- 実行可能な細胞観察 (緑の蛍光、Ex/Em 485 nm/530 nm) と死んだ細胞 (赤い蛍光 Ex/Em 485 nm/630 nm) 63 × 1.4 NA 油浸対物レンズと CLSM の下。
- 顕微鏡のソフトウェアを使用して画像を生成します。
- 光照射後、PBS で培養皿でバイオ フィルムを 3 回洗浄します。
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Representative Results
バイオ フィルム中の細菌の生存率がコントロールと比較した場合の翼-PDT 治療後減少した (- LED-翼 + LED は、- では、翼と翼-LED +) usa 300 の 3 つの臨床株 (図 1)。
CFU から結果分析しを抗菌を観察確認するには、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムは、その場で、usa 300 バイオ フィルムに及ぼす翼-PDT は生存率染色で CLSM で視覚化しました。実行可能な死んだ細胞は、それぞれ緑と赤の蛍光染色された.画像は、バイオ フィルム中の細菌のほとんどは CFU の試金 (図 2) の結果と一致したアラ-PDT によって殺されたことを示した。
図 1: バイオ フィルムに及ぼす翼-PDT 。CFU/mL は対数変換と usa 300 と ALA PDT を臨床 3 系統 (C1 - C3) の平均 ± 標準偏差で表示されます (翼 + LED +) または制御条件の下で (アラ - LED-、ALA + LED、ALA-LED +)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ライブ/デッド染色と黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの代表 CLSM イメージ。アラ-PDT の有無にかかわらず、usa 300 細菌によって形成されるバイオ フィルムが扱われた (a: 翼 - LED-、パネル b: 翼 + LED をパネル、c: 翼のパネル-パネル LED + d: 翼 + LED +)、SYTO9 で染色し、(蛍光グリーン) とライブとデッド細菌を表すため PI (赤色蛍光)独立。63 X 1.4 NA 油浸対物レンズが使用されていました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
PDT 以来よく研究療法がんの治療のためには 100 年以上も前に発明されました18。最後のディケイドでは、PDT は抗菌戦略として適用されているし、12いくつかの抗生物質耐性細菌に対して効果を示しています。浮遊性の状態と比較して、細菌バイオ フィルムはバイオ フィルムに及ぼす翼-PDT がされて完全にまだ調査されていない中3抗生物質治療に抵抗力があるように見えます。
この記事での in vitro ALA PDT システムは記述されていたと黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムのこのモデルの抗菌効果を示した。このプロトコルでは黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす翼-PDT をテストする 2 つの方法が使用されました。CFU テスト治療後実行可能なセルを計算することによって抗菌効果を実証、蛍光活性 CLSM で染色 CFU テストの結果を確認しただけでなくもライブとデッドの形態的特徴を検出細菌原。一緒に両方の分析技術を用いたバイオ フィルムの翼-PDT の効果を決定するための理想的なアプローチです。CLSM の結果に基づき、死んだ細菌細胞主に配られた上位層の底層の細菌のいくつかは生きている15のまま。後者 CFU のアッセイで細菌のコロニーのソースがあります。同様の結果は、オニールら、内側の層に光増感剤の低蓄積またはこれらの地域の19を浸透する光の無力によって説明された調査で観察されています。
このプロトコルでは成熟したバイオ フィルムは PDT への暴露の前に 1 時間の翼の 10 mM で孵化します。これらのパラメーターは、2 つの事前実験の結果に基づいて選ばれました。まず、ALA の抗菌効果は黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムと孵化の翼と時間の異なる量の異なる濃度を使用して光照射することがなくバイオ フィルムに対してテストされました。殺菌効果なしグループは、候補者として選ばれました。第二に、PDT 効果はこれらの候補者のグループで検出された、最も強力な殺菌効果を持つグループはこのプロトコルで最終的に選ばれました。したがって、このプロトコルで使用されるパラメーターは、単独で翼の殺菌効果はないことを確認しました。1 h インキュベーション時間は以前研究17,20、未来の臨床処置が生体外で研究、潜在的なアプリケーションのために便利なで使用されるそれらより有意に短かった。
このモデルの使用の成功のためのいくつかの重要なポイントがあります。最初に、翼の操作処理細菌を含む全体のプロセスは、暗闇の中で行わなければなりません。第二に、成熟したバイオ フィルムの操作は形成されたバイオ フィルムを脅かさないよう穏やかなする必要があります。第三に、CFU テスト プレートの底から細菌をこする必要があります徹底的。最後に、作りたてのアラを使用する必要があります;したがって、実験直前に翼を準備することをお勧めします。
このプロトコルは、 S の黄色ブドウ球菌バイオ フィルム培養に及ぼす翼-PDT をテストするために使用することができますとは臨床状況で体内から違う。たとえば、人間の体内でバイオ フィルムは通常複数菌株21,22, により形成され、環境の生体内体外PDT の効果に影響を及ぼす可能性がありますより複雑です。したがって、将来生体内で実験で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの翼-PDT の抗菌効果の完全な評価が必要です。ただし、利便性の利点と生体内研究の倫理的な問題のためこの体外プラットフォームになります有用かつ実用的な ALA PDT 効果の黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの研究を改善します。ALA、PpIX、光増感剤の前駆体には迅速な通関を含め、良好な特性が少ないと短い持続皮膚過敏症、制限を指摘する必要があります光の浸透表面的な病変に制限特にその非累積的な毒性14、光量、光増感剤濃度が細菌を殺すを達成するために必要なホスト細胞生存率に傍観者効果があります。したがって、ALA23に対する黄色ブドウ球菌のような病原性細菌菌株の標的治療の変更を勉強して将来の抗菌療法の貴重なです。
このプロトコルは、だけが使えないことが黄色ブドウ球菌菌株の ALA pdt 効果の研究のため、将来的には他の細菌によって形成されるバイオ フィルムへの影響の研究を参照することも。Ala 濃度とアラ、細菌培養の時間など、パラメーターは異なる菌株間で異なる場合がありますが、上記で説明した原則は共通します。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
この作品は、若手研究者 (第 81300810)、上海の若い医師研修 (第 20141057)、国家自然科学基金、中国の (81671982、81271791、81571955) に中国の国家自然科学基金によって賄われていた。我々 はこの原稿の準備の間に言語の援助を提供するため LetPub (www.letpub.com) に感謝を思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
References
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