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Biology

Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus

Published: April 16, 2018 doi: 10.3791/57604
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 3, 1, 2
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano común, que causa infecciones piógenas y sistémicas. S. aureus las infecciones son difíciles de erradicar no sólo debido a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos pero también su capacidad de forma biofilms. Recientemente, la terapia fotodinámica (TFD) ha indicado como uno de los posibles tratamientos para el control de las infecciones de biofilm. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para mejorar nuestro conocimiento de su efecto sobre biofilms bacterianos, así como los mecanismos subyacentes. Este manuscrito describe un modelo in vitro de la TFD con ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), un precursor de la actual fotosensibilizador, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduro S. aureus biopelículas fueron incubados con ALA y entonces expuestos a la luz. Posteriormente, el efecto antibacteriano de ALA-PDT en el biofilm de S. aureus fue cuantificado calculando las colonias formando unidades (UFC) y visualizado por tinción mediante láser confocal de barrido (CLSM) la microscopia fluorescente de viabilidad. Resultados representativos demostraron un fuerte efecto antibacteriano de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . Este protocolo es simple y puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms de S. aureus con ALA-PDT. En el futuro, también podría hacer referencia en los estudios de PDT utilizando otros photosensitizers por diferentes cepas bacterianas con ajustes mínimos.

Introduction

S. aureus es un importante patógeno gram-positivo que coloniza la piel y mucosa de los ejércitos humanos. Su capacidad de forma biofilms se considera un aspecto importante de su patogenesia1. Biofilms bacterianos son una comunidad de bacterias embebidas en una matriz de producción propia, que se compone de sustancias poliméricas extracelulares, incluyendo polisacárido, ADN y proteínas. Esta matriz juega un papel importante en la persistencia de las infecciones bacterianas, que contribuyen a un alto grado de resistencia al sistema inmunológico humano y terapias antimicrobianas actuales2. Antibióticos siguen siendo el tratamiento principal para las infecciones de biofilm, aunque los efectos de los antibióticos en los biofilms son limitados. Previamente se ha demostrado que las células en los biofilms son 10 a 1.000 veces más resistentes a los antibióticos en comparación con sus contrapartes planctónicas3. Así, se necesitan estrategias alternativas para vencer este problema.

PDT, un tratamiento alternativo para las infecciones bacterianas, utiliza la luz de una longitud de onda adecuada para activar photosensitizers. Esto conduce a la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), que son letales a las células diana por alterar la pared celular, inactivar enzimas y dañando DNA4. Esta característica de destino múltiples hace difícil para las bacterias desarrollar resistencia al tratamiento de PDT.

El efecto antimicrobiano de la TFD en biofilms de bacterianos y hongos, con photosensitizers múltiples, tales como azul de toluidina, verde malaquita, azul de metileno, cloro e6 y las porfirinas, se ha estudiado en anteriores informes5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profármaco de la real fotosensibilizador, PpIX, se caracteriza por su pequeño peso molecular y separación rápida12,14. Estas ventajas dan gran potencial ALA-PDT como un uso terapéutico. Aunque el efecto de ALA-PDT en bacterias planctónicas ha sido estudiado por muchos grupos12, el efecto antimicrobiano de ALA-PDT en biopelículas bacterianas ha todavía no se ha aclarado. Mientras tanto, es difícil comparar los resultados entre los estudios previos. Una de las razones es que los diferentes protocolos son utilizados por diversos grupos. Así, este protocolo describe un modelo en vitro de un sistema de ALA-PDT basado en nuestro anterior trabajo15. El efecto de este modelo fue confirmado por cálculo de UFC y viabilidad de tinción con CLSM.

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Protocol

1. Biofilm formación

  1. Formación de biopelículas en microplacas de 96 pocillos
    1. Recuperar la S. aureus cepa USA300 y 3 formación de biofilm clínicas cepas (C1 - C3) almacenadas a-80 ° C.
      Nota: La capacidad de las cepas clínicas para formar biofilms se determinó por el ensayo de placa de microtitulación descrito previamente15.
    2. Inocular la bacteria en medio de 5 mL triptona soja caldo (TSB) y cultivan en una incubadora con agitación a 37 ° C durante la noche a la fase estacionaria.
    3. Centrifugar el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 x g por 10 min a 25 ° C y luego descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración final de 2.0 x 109 UFC/mL.
      Nota: La concentración de las bacterias fue estimada midiendo la densidad óptica y más determinada por la placa de la cuenta16, revelando que OD 1600 de suspensión contenida 1.5 x 108 UFC/mL.
    4. Diluir la suspensión bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) en medio TSB conteniendo 0.5% de glucosa. Inocular 200 μL de suspensión bacteriana en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos poliestireno tratada con cultura de célula.
    5. Incube las microplacas estáticamente a 37 ° C durante 24 h. bajo un ambiente bien oxigenado.
      Nota: El tiempo de incubación para la formación de biopelículas maduras puede variar por diferentes cepas bacterianas; Esto debe determinarse antes de que el PDT experimento15.
    6. Desechar los medios de comunicación en los pozos y lavar los pocillos de la microplaca suavemente con PBS tres veces y luego desechar el sobrenadante.
      Nota: El paso debe ser realizado muy suavemente para evitar molestar a la biopelícula formada.
  2. Formación de biopelículas en platos
    1. Inocular la cepa de S. aureus USA300 en 5 mL de medio TSB y cultivan en una incubadora con agitación a 37 ° C durante la noche a la fase estacionaria.
    2. Centrifugar el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 x g por 10 min a 25 ° C y luego descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en PBS a una concentración final de 2.0 x 109 UFC/mL. Luego, diluir la suspensión bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) en medio TSB conteniendo 0.5% de glucosa. Inocular 2 mL de la suspensión bacteriana en una placa de cultivo celular calidad óptica 35 mm cristal inferior e incubar estáticamente a 37 ° C durante 24 h.
      Nota: La concentración de las bacterias se estimó midiendo la densidad óptica.
    3. Aspire los medios con una pipeta y luego enjuague los biofilms en el plato suavemente con PBS 3 veces y luego, descartar el sobrenadante cuidadosamente.
      Nota: Evite tocar la punta de la pipeta hasta el fondo del plato. El paso 2.2 debe realizarse inmediatamente después de este paso para prevenir la resequedad de la biopelícula formada.

2. fotopolimerización

  1. Almacenar 5-ALA en el refrigerador de 4 ° C. Antes del experimento, diluir 5-ALA con PBS a 10 mM.
    Nota: 5-ALA solución debe estar recién preparada antes del experimento.
  2. En el grupo experimental, añadir 200 μL de 10 mM de ALA en cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 1 h. Entonces, irradiar el plato/plato con un diodo emisor de luz (LED) con una intensidad de luz de 100 mW/cm2 durante 1 hora lograr una ligera dosis de 360 J/cm2 en una gran longitud de onda de 633 ± 10 nm17.
    Nota: Para permitir que la energía de la luz efectivamente e igualmente entregar a la biopelícula en todos los pozos/platos, arreglar la distancia desde el pico de la fuente de luz para el bien/plato a 6,0 cm y limitar la región experimental en el área central de la irradiación (10 cm x 8 cm). para asegurar que los resultados son reproducibles, los experimentos deben realizarse a la misma temperatura de la habitación.
    En el paso de radiación de LED, para evitar la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como luz solar, iluminación de la sala o luz artificial, el LED se enciende antes de mover el plato de placa a la zona de irradiación, y la luz era lo suficientemente brillante para terminar la operación.
  3. Configurar los grupos de control (grupos de control tres se establecieron en nuestro experimento).
    1. Para el control del primer grupo (ALA - LED-), añadir 200 μL de PBS a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 2 h.
    2. Para el segundo grupo de control (ALA + LED-), añadir 200 μL de 10 mM de ALA a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 2 h.
    3. En el tercer grupo de control (ALA-LED +), añadir 200 μL de PBS a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 1 h. Luego exponer la placa para el LED con 360 J/cm2 irradiación de la luz en una longitud de onda mayor de 633 ± 10 nm17.
      Nota: En el paso de radiación de LED, evite la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como luz solar, iluminación de la sala o luz artificial.

3. determinación de la efectividad del tratamiento de PDT

Nota: Para confirmar el efecto de ALA-PDT en las biopelículas de S. aureus , la viabilidad de las células con o sin ALA-PDT se evaluó por conteo de UFC, así como por la coloración de la viabilidad.

  1. Determinación de las restantes células bacterianas viables
    1. Después del tratamiento de ALA-PDT, desechar los medios de comunicación en los pocillos y lavar los pocillos con PBS tres veces para eliminar todas las células no adherentes para ambos experimental y grupos de control.
      Nota: Este paso debe realizarse muy suavemente.
    2. Raspar las células de bacterias adherentes fondo de los pozos con la punta de la pipeta y recoger las células en tubos cónicos.
    3. Centrifugar la suspensión bacteriana a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
    4. Resuspender las bacterias en 1 mL de enzima pancreatina de 0,25% en PBS e incubar a 37 ° C durante 1,5 horas.
    5. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min; desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de PBS.
    6. Hacer 1:10 diluciones seriadas de la solución de células con PBS; a continuación, añadir 5 μl de cada muestra de dilución seriada en la placa de agar (TSA) triptona soja. Incubar la placa TSA a 37 ° C por 16 h; entonces, la cuenta (por ojo) el número de colonias bacterianas (UFC/mL).
  2. Observación de biopelículas de S. aureus por CLSM
    1. Después de la irradiación de la luz, lavar las biopelículas en la placa de cultivo con PBS tres veces.
      Nota: Este paso debe realizarse muy suavemente.
    2. Añadir 1 mL de 1 μm fluorescente verde nuclear y mancha de cromosoma que es permeable a las membranas de células procariotas (por ejemplo, SYTO9) y 1 mL de yoduro de propidio 1 μm (PI) por 20 min a manchar el biofilm como células muertas.
    3. Observar células viables (verde fluorescencia, Ex / Em 485 nm/530 nm) y las células muertas (fluorescencia roja, Ex / Em 485 nm/630nm) bajo un CLSM con un objetivo de inmersión en aceite 63 X 1.4-NA.
    4. Generar imágenes utilizando el software de la microscopia.

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Representative Results

La viabilidad de las bacterias en los biofilms disminuyó después del tratamiento de ALA-PDT en comparación con los controles (ALA - LED-, ALA + LED - y ALA-LED +) USA300 y las tres cepas clínicas (figura 1).

Para confirmar los resultados de la UFC de ensayo y observan el anti-bacteriano efecto de ALA-PDT en el S. aureus biofilm en situ, el USA300 biofilms se visualizaron por CLSM con tinción de viabilidad. Las células viables y muertas se tiñeron con fluorescencia verde y roja, respectivamente. La imagen mostró que la mayoría de las bacterias en los biofilms mataron ALA-PDT, que era constante con los resultados de lo análisis de UFC (figura 2).

Figure 1
Figura 1: efecto de ALA-PDT en biofilms. UFC/mL fue transformado por el registro y se muestra como la media ± desviación estándar en USA300 y tres cepas clínicas (C1 - C3) tratadas con ALA-PDT (ALA + LED +) o bajo las condiciones de control (ALA - LED-, ALA + LED-, ALA-LED +). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: imágenes CLSM representante de biopelículas de S. aureus con LIVE/DEAD tinción. Biofilms formados por bacteria USA300 fueron tratados con o sin ALA-PDT (panel A: ALA - LED-, B: ALA + LED del panel, panel C: ALA-D: ALA + LED en el panel LED +, +) y luego teñidas con SYTO9 (fluorescencia verde) y PI (fluorescencia roja) para representar las bacterias vivas y muertas independientemente. Se utilizó un objetivo de inmersión de aceite 63 X 1.4-NA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

PDT ha sido una terapia muy estudiada para el tratamiento del cáncer desde que fue inventado hace más de 100 años18. En la última década, PDT ha sido aplicada como una estrategia antimicrobiana y ha mostrado eficacia contra algunas bacterias patógenas resistentes a los antibióticos12. En comparación con el estado planctónico, biopelículas bacterianas parecen ser más resistentes al tratamiento antibiótico3, mientras que el efecto de ALA-PDT en biofilms no ha sido completamente investigado aún.

En este artículo, se describe un sistema de ALA-PDT en vitro , y se demostró el efecto antibacteriano de este modelo en biopelículas de S. aureus . Dos métodos se utilizaron para probar el efecto de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus en el presente Protocolo. Mientras que la prueba de UFC demostró el efecto antimicrobiano mediante el cálculo de las células viables después del tratamiento, viabilidad fluorescente tinción con CLSM no sólo confirmó los resultados de la prueba de la UFC sino también detecta el carácter morfológico de los vivos y muertos bacterias en situ. Utilizando técnicas analíticas de ambos juntos es un método ideal para determinar el efecto de ALA-PDT en biofilms. Basado en los resultados CLSM, las células bacterianas muertas predominante fueron distribuidas en la capa superior, mientras que algunas de las bacterias en la capa inferior se mantuvo vivo15. Este último puede ser la fuente de colonias bacterianas en el ensayo de UFC. Un resultado similar se ha observado en un estudio realizado por O'Neill et al., que fue explicada por la baja acumulación de photosensitizers en la capa interna o la imposibilidad de la luz para penetrar en estas regiones19.

En el presente Protocolo, el biofilm madurito se incubó con 10 mM de ALA para 1 h antes de la exposición al PDT. Estos parámetros fueron seleccionados en base a los resultados de dos experimentos previos. En primer lugar, el efecto antimicrobiano de ALA fue probado contra los biofilms sin irradiación de la luz utilizando diferentes concentraciones de ALA y diferentes cantidades de tiempo de incubación con biopelículas de S. aureus . Los grupos sin efecto bactericida fueron elegidos como los candidatos. En segundo lugar, el efecto del PDT se detectó en estos grupos de candidatos, y finalmente fue elegido el grupo, con el efecto bactericido más potente en este protocolo. Así, los parámetros utilizados en este protocolo aseguraron que no hubo ningún efecto bactericida del ALA solamente. Un tiempo de 1 h de incubación es significativamente menor que los utilizados en anteriores estudios17,20, haciéndolo conveniente para estudios en vitro y potencial aplicación en futuros tratamientos clínicos.

Hay varios puntos críticos para el uso acertado de este modelo. En primer lugar, todo el proceso que implica que la manipulación de ALA trata bacterias debe realizarse en la oscuridad. En segundo lugar, la manipulación de los biofilms maduros debe ser suave para evitar molestar a la biopelícula formada. En tercer lugar, en el ensayo de UFC, raspado de la bacteria de la parte inferior de las placas debe ser cuidadoso. Finalmente, el ALA recién preparada debe utilizarse; por lo tanto, es mejor preparar el derecho ALA antes del experimento.

Aunque este protocolo se puede utilizar para probar el efecto de ALA-PDT en S. aureus el biofilms en vitro, es todavía diferente de la situación clínica en vivo. Por ejemplo, biopelículas en el cuerpo humano generalmente están formados por múltiples cepas bacterianas21,22, y el medio ambiente en vivo es más complejo que eso en vitro, que pudiera influir en el efecto de la TFD. Por lo tanto, futura en vivo experimentos son necesarios para una evaluación completa de los efectos antibacterianos de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . Sin embargo, debido a sus ventajas de comodidad y los aspectos éticos de la realización de estudios en vivo , esta plataforma en vitro será útil y práctico para mejorar el estudio de los efectos de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . También hay que señalar que aunque el ALA, un precursor del fotosensibilizador PpIX, tiene características favorables, como separación rápida, menos y de más corta duración fotosensibilidad cutánea, limitada penetración restringida a lesiones superficiales de la luz y sobre todo su toxicidad no acumulativa14, dosis de luz y concentración de fotosensibilizador requerida para lograr bacterias que matan todavía pueden tener un efecto de espectador en la viabilidad de las células huésped. Así, estudiando la modificación del ALA23 de terapia dirigida de cepas seleccionadas de bacterias patógenas como S. aureus es valiosa para la futura terapia antimicrobiana.

Este protocolo no sólo se puede utilizar para el estudio del efecto de ALA-PDT en cepas de S. aureus en el futuro, pero también puede hacer referencia para estudiar su efecto sobre biopelículas formadas por otras bacterias. Los parámetros, como la concentración de ALA y la duración de la incubación de las bacterias con ALA, pueden variar entre diferentes cepas bacterianas, pero comúnmente se comparten los principios discutidos anteriormente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China para jóvenes académicos (Nº 81300810), programa de formación de médico joven de Shangai (Nº 20141057) y Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671982, 81271791 y 81571955). Nos gustaría dar las gracias a LetPub (www.letpub.com) para prestar asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone Soya Broth (TSB) OXOID CM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA) OXOID CM0131
SYTO9 Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI) Thermo Fisher Scientific L7012 The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Pancreatin Sigma-Aldrich P3292
5-aminolevulinic acid (ALA) Fudan Zhangjiang Bio-Pharm 3.1
Staphylococcus aureus strain USA300 / / The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”.
Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) / / All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-well microplate Corning Inc 3599 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
Fluorodish NEST Biotechnology 801001 Glass bottom, Non-pyrogenic
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417 Eppendorf Z365998 | SIGMA
Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE4000 MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers
Light emitting diode (LED) Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO LED-IB
Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope Leica Microsystems
Leica LAS AF software Leica Microsystems
IMARIS software Bitplane

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References

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

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Un modelo <em>In Vitro</em> para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de <em>Staphylococcus aureus</em>
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