Summary
Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.
Abstract
La barrière sang - encéphalique (BHE) est un tissu de barrière dynamique qui répond à divers stimuli physiopathologiques et pharmacologiques. Ces changements résultant de ces stimuli peuvent grandement modulent les medicaments au cerveau et, par extension, causer des problèmes considérables dans le traitement du système nerveux central (CNS) des maladies. Nombreux changements BBB qui affectent la pharmacothérapie, impliquent des protéines qui sont localisées et exprimés au niveau des cellules endothéliales. En effet, ces connaissances sur la physiologie BBB dans la santé et la maladie a suscité un intérêt considérable pour l’étude de ces protéines membranaires. Dans une perspective de recherche sciences fondamentales, cela implique une exigence pour une méthode simple mais robuste et reproductible pour isolation des microvaisseaux de tissu cérébral récolté sur des animaux de laboratoire. Afin de préparer les échantillons de la membrane des microvaisseaux fraîchement isolées, il est essentiel que les préparations être enrichies dans les cellules endothéliales mais limitées en présence d’autres types de cellules de l’unité neurovasculaire (p. ex., astrocytes, la microglie, neurones, péricytes). Un autre avantage est la possibilité de préparer les échantillons provenant d’animaux individuels afin de capturer la véritable variabilité d’expression de protéine dans une population expérimentale. Dans ce manuscrit, on trouvera des précisions concernant une méthode qui est utilisée pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et préparation des échantillons de la membrane. Enrichissement des microvaisseaux, provenant d’échantillons dérivés, est obtenue en utilisant les quatre étapes de centrifugation à où le dextran est inclus dans la solution tampon. Ce protocole peut être facilement adapté par d’autres laboratoires pour leurs propres applications spécifiques. Échantillons produits de ce protocole ont été démontrés pour produire des données expérimentales fiables des expériences d’analyse de protéines qui peuvent grandement aider à la compréhension des réponses BBB à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques.
Introduction
La barrière sang - encéphalique (BHE) existe à l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation systémique et joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du cerveau. Plus précisément, les fonctions BBB précisément contrôle soluté à une concentration d’extracellulaire de cerveau pour alimenter efficacement les éléments nutritifs qui sont requis par les tissus du cerveau pour répondre aux exigences métaboliques considérables du CNS1. Ces rôles impliquent que la BHE, qui existe principalement au niveau de la cellule endothéliale microvasculaire, doit posséder des mécanismes discrets qui permettent à certaines substances d’accéder le parenchyme du cerveau tout en s’assurant que des xénobiotiques potentiellement dangereux ne peut pas s’accumulent. En effet, les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales ne sont pas fenêtrées et pièce limitée pinocytose, qui assure une absence de perméabilité non sélectif2. En outre, les cellules endothéliales du cerveau microvaisseaux expriment les protéines serrés de jonction junction et adherens qui agissent pour former un physique « sceller » entre les cellules endothéliales adjacentes et considérablement restreindre la diffusion paracellulaire de substances véhiculées par le sang dans le cerveau parenchyme. En effet, la perméabilité sélective de substances endogènes et exogènes requiert une expression fonctionnelle de la captation et l’efflux de transporteurs3. Les jonctions dans l’ensemble, serrées, jonctions adherens et les transporteurs travaillent de concert pour maintenir les propriétés de barrière unique de la BHE.
Le BBB est une barrière dynamique qui répond à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques. Par exemple, les contraintes d’hypoxie/réoxygénation s’est avéré modulent l’expression des protéines de jonction serrée critique (c.-à-d., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), qui est associé de la perméabilité paracellulaire accrue à des marqueurs vasculaires telles comme le saccharose4,5,6. Des observations similaires ont été faites à la BHE dans le cadre du traumatisme cérébral lésion7 et douleur inflammatoire périphérique8,9. Ces mêmes maladies peuvent également moduler les mécanismes de transport à la BBB10,11,12,13,14. En effet, blessure d’hypoxie/réoxygénation améliore l’expression fonctionnelle des anions organiques transportant polypeptide 1 a 4 (Oatp1a4) à la BHE, qui peut conduire à une augmentation significative dans le transport de sang-de-cerveau des substrats spécifiques de transport Oatp tels que 13le taurocholate et l’atorvastatine. Propriétés BBB peuvent également être modifiées par pharmacothérapie lui-même, un mécanisme qui peut former une base pour les deux changements profonds dans l’efficacité du médicament dans le cerveau et interactions médicament-médicament. Par exemple, les mécanismes de signalisation acétaminophène cibles récepteur nucléaire dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, augmente l’expression fonctionnelle efflux critique du transporteur de la P-glycoprotéine (P-gp) et modifie l’analgésie dépendant du temps conféré par la morphine, un médicament analgésique opioïde et établi P-gp transportent substrat15. Une compréhension approfondie des changements BBB, qui peut être induite par des maladies ou par des drogues, exige également l’identification et caractérisation des mécanismes réglementaires spécifiques qui contrôlent ces modifications. En effet, les voies de signalisation discrets ont été identifiés dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau qui contrôlent l’expression moléculaire de jonction serrée protéines16,17 et transporteurs15, 18,,19. Pris ensemble, ces observations indiquent que les voies moléculaires complexes interviennent dans la régulation des jonctions serrées de BBB et transporteurs en santé et en maladie.
Un défi important dans l’étude de la BHE est l’absolue nécessité d’une méthode simple et efficace pour l’isolation des microvaisseaux de tissu cérébral provenant d’animaux de laboratoire et préparation ultérieure des échantillons de la membrane. Ces échantillons doivent être préparés, afin qu’ils sont enrichis en cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et limités en présence d’autres types de cellules. Au cours des dernières années, plusieurs méthodes pour l’isolement des capillaires du cerveau de rongeur ont été signalés dans la littérature scientifique13,20,21,22. Cet article décrit une simple, robuste et la méthode reproductible pour isolation des microvaisseaux du cerveau de rat et préparation des échantillons endothéliales de membrane enrichi qui peut être utilisé pour l’analyse de l’expression de la protéine. Un avantage de ce protocole d’isolement microvaisseaux est la possibilité d’obtenir des préparations de haute qualité et avec un rendement suffisant de protéines d’un animal expérimental. Cela permet l’examen des animale variabilité dans l’expression de la protéine. Cette avance dans le présent protocole a grandement amélioré la robustesse des études BBB car surestimation ou sous-estimation de l’ampleur réelle des changements de la protéine à la BHE peut désormais être évitée. En outre, l’inclusion de plusieurs étapes de centrifugation avec dextran permet enrichissement améliorée des microvaisseaux dans des échantillons de laboratoire tout en facilitant l’élimination des constituants cellulaires indésirables tels que les neurones.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier et sont conformes aux National Institutes of Health (NIH) et de la recherche de l’Animal : notification In Vivo des expériences (arrivée). Le flux procédural pour le protocole est représenté dans la Figure 1.
1. mise en place de la procédure
- Préparer le tampon microvaisseaux de cerveau (BMB). Commencez par peser 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA et base de 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (c.-à-d., Tris) dans un bécher propre. Ajouter 1,0 L d’eau déionisée. Mélanger les composants de la mémoire tampon BMB à l’aide d’un agitateur magnétique. Une fois que la solution a été bien mélangée, ajuster le pH à 7,4 avec 1,0 M HCl.
- Préparer la solution de dextran (MW 75 000) de 26 % (p/v) avant d’anesthésier les animaux. Préparer la solution de dextran tel que décrit dans les étapes suivantes.
Remarque : Il est essentiel pour préparer cette solution avance car dextran peut prendre environ 1,5 à 2 h à se dissoudre dans un tampon aqueux.- Peser le dextran en poudre (26 g / 100 mL de tampon) dans un bécher propre.
- Mesurer le volume approprié de BMB et verser dans un bécher distinct, propre.
- Versez lentement BMB dans le bécher contenant dextran en poudre. Mélanger manuellement le dextran en poudre pendant la coulée de BMB à l’aide d’une baguette de verre remuer.
- Ajuster le pH à 7,4 avec 1,0 M HCl immédiatement avant utilisation.
Remarque : Un isolement typique des microvaisseaux de 12 des rats Sprague-Dawley (mâle ou femelle ; âge de 3 mois ; 200-250 g chacun) nécessite 200 mL de solution de dextran (c.-à-d., le dextran 52 g dans 200 mL de BMB).
2. extraction des tissus du cerveau de Rats Sprague-Dawley
- Après le traitement expérimental désiré, anesthésier les rats Sprague-Dawley à l’aide de kétamine (50 mg/kg ; 2,5 mL/kg i.p.) et xylazine (10 mg/mL, 2,5 mL/kg I, p.). Diluer la kétamine et xylazine dans salin de 0,9 % à la concentration finale de 20 mg/mL et 4,0 mg/mL respectivement. Euthanasier les animaux par décapitation à l’aide d’une guillotine aiguisée conformément aux lignes directrices IACUC. Utilisez la même procédure pour les rats mâles et femelles Sprague-Dawley.
- Résection de la peau du crâne de rat en faisant une coupe transversale à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- À l’aide de pinces-gouges, soigneusement retirer la plaque de crâne et exposer le cerveau.
- Enlever le cerveau à l’aide d’une spatule. Détacher le cerveau et placez le tissu cérébral isolé dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de BMB. Ajouter 1,0 μL d’inhibiteur de la protéase cocktail / 1,0 mL de tampon de BMB immédiatement avant utilisation.
3. cerveau traitement
- Transférer le tissu cérébral du tube conique 50 mL pour une boîte de Petri propre.
- À l’aide de pinces, rouler doucement le cerveau sur 12,5 cm diamètre filtre papier pour enlever les méninges externes, qui sont respectées sans serrer le cortex cérébral. Appuyez le tissu cérébral contre le papier filtre doucement et rouler le tissu à nouveau. Tournez le papier filtre fréquemment au cours de cette étape.
- Séparer les plexus choroïdes des hémisphères cérébraux avec une pincette.
Remarque : Le plexus choroïde apparaît comme un tissu membraneux clairement localisé à la surface des ventricules cérébraux. - Délicatement, aplatir le tissu cérébral et retirer les restants des méninges et des bulbes olfactifs avec une pincette.
- Placez le tissu de cerveau cortical dans un mortier de verre. Ajouter 5,0 mL d’inhibiteur de protéase contenant BMB cocktail au mortier.
- À l’aide d’un homogénéisateur électriques aériennes, homogénéiser le tissu cérébral moyen 15 monter et descendre des traits à 3 700 tr/min. Effectuer l’homogénéisation à l’aide d’un broyeur de tissu 10 mL mortier et un pilon. Entre homogénéisation de chaque échantillon individuel, nettoyer le pilon à l’aide d’éthanol à 70 %.
NOTE : Homogénéisation traits soient cohérentes en termes de rythme et l’ampleur. - Versez l’homogénat dans des tubes à centrifuger étiquetées.
4. étapes de centrifugation
- Ajouter 8,0 mL de solution de dextran de 26 % dans chaque tube à centrifuger étiquetés contenant l’homogénat de cerveau.
- Inverser le tube deux fois, puis soigneusement vortex l’échantillon. Procéder à l’utilisation du vortex de chaque échantillon à l’aide des angles multiples pour assurer un mélange intime de la solution de l’homogénat de cerveau avec une solution de dextran de 26 %.
- Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
Remarque : Pour certaines analyses, il est utile de comparer les microvaisseaux avec parenchyme du cerveau. L’évaluation de l’expression de la protéine dans le parenchyme du cerveau soient nécessaires, le surnageant de cette étape de centrifugation (c.-à-d., fraction parenchymateuses de cerveau) soient collecté et stocké à-80 ° C pour une utilisation future. - Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur vide et pipette Pasteur en verre.
Remarque : Attention il faut ne pas déranger le culot. Dans le cas contraire, quantité des microvaisseaux recueillis sera réduite, qui va considérablement diminuer le rendement de protéine de cette procédure. - Resuspendre le culot dans 5,0 mL de BMB contenant inhibiteur de protéase cocktail (c.-à-d. 1,0 μL inhibiteur de protéase cocktail / 1,0 mL de tampon de BMB). Vortex du culot pour assurer un mélange complet.
- Ajouter 8,0 mL de dextran de 26 % dans chaque tube à centrifuger et vortex comme décrit aux points 4.1-4.2 du présent protocole.
- Centrifuger les échantillons à 5 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- À l’aide d’une fiole à vide et la pipette en verre, aspirer le surnageant et veiller à ce que granulés contenant des microvaisseaux de cerveau n’est pas perturbé.
Remarque : Matériel d’excès qui adhère à la paroi du tube ne contient pas les microvaisseaux et soigneusement Nettoyez et enlevé. - Répétez les étapes 4,5 à 4,8 an supplémentaires deux fois.
- Une fois 4 étapes de centrifugation de dextran sont terminés, ajouter 5,0 mL de BMB à chaque boulette et vortex pour remettre en suspension l’échantillon.
Remarque : Après l’achèvement de l’étape 4.10, microvaisseaux ensemble peuvent être collectées pour l’analyse de la localisation de la protéine. Cela est possible en prenant un 50 μL aliquote de remises en suspension microvaisseaux pellet et étalement sur une lame de microscope. Microvaisseaux sont ensuite fixés à 95 ° C pendant 10 min sur un bloc de chauffage suivi par fixation dans l’éthanol glacé pour une supplémentaire de 10 min. de diapositives peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation pour les études d’imagerie thermique.
5. Ultracentrifugation pour préparer des échantillons de cerveau Total Membranes microvasculaire
- Transfert des échantillons à l’homogénéisateur verre réfrigéré.
- À l’aide d’un homogénéisateur électriques aériennes, homogénéiser les tissus cérébraux à l’aide de 8-10 et descendre de coups à 3 000 tr/min. L’homogénéisation est effectuée à l’aide d’un broyeur de tissu 10 mL mortier et un pilon. Nettoyer le pilon à l’aide d’éthanol à 70 % après homogénéisation de chaque échantillon individuel.
- Transférer les échantillons pour nettoyer les tubes ultracentrifugeuse. Le nombre et la peser chaque tube individuel. Équilibre et apparier les tubes avant le chargement dans le rotor ultracentrifugeuse.
Remarque : Tous les pesant et appariement des tubes ultracentrifugeuse doivent être effectués avec les bouchons sur pour assurer une mesure précise du poids du tube. - Centrifuger les échantillons à 150 000 x g pendant 1 h à 4 ° C.
- À l’aide d’une fiole à vide et la pipette Pasteur en verre, aspirer le surnageant à l’aide de soin de ne pas perturber la pastille de la membrane capillaire.
- Selon la taille de granule, ajouter un volume suffisant de tampon de stockage, ce qui comprend l’eau désionisée et BMB dans un ratio de 1:1 (v/v). En général, granulés sont resuspendues dans 400-500 μL de tampon de stockage. Ajouter cocktail inhibiteur de protéase au stockage tampon dans une proportion de 1,0 μL / 1,0 mL de tampon de stockage.
- Échantillons de vortex de resuspendre le culot dans un tampon de stockage.
- À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférer les échantillons de membrane capillaire dans un tube de microcentrifuge d’étiquetées 1,5 mL.
- Échantillon de passage à travers une aiguille seringue 5 x pour s’assurer que l’échantillon est bien mélangé et qu’aucun agrégat cellulaire n’existence.
- Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à leur utilisation pour l’analyse.
NOTE : La teneur en protéines de chaque échantillon de membrane des microvaisseaux est mesurée à l’aide de la méthode de Bradford.
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Representative Results
L’écoulement expérimental pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de membrane microvaisseaux est montré dans la Figure 1. À l’aide de la procédure présentée ici, réussite de l’isolement des microvaisseaux intacts du cerveau de rat est démontrée (Figure 2 a). Ces navires ont été obtenus à l’issue de la centrifugation avec dextran et immédiatement avant le début d’ultracentrifugation pour préparer les échantillons de membrane (c.-à-d., après l’achèvement de l’étape 4.10). Dans cette image, le microvaisseaux est taché à l’aide d’un anticorps contre Oatp1a4, un transporteur qui s’est avéré être bien exprimée à la membrane plasmique du cerveau des cellules endothéliales microvasculaires2,11,13, 18. En utilisant l’analyse par western blot (Figure 2 b), membrane, préparations des microvaisseaux récoltées dans les rats Sprague-Dawley femelles ont été montrées pour être enrichi en plaquettes cellules endothéliales molécule d’adhésion-1 (PECAM-1, également connu sous le nom CD31), une protéine marqueur pour capillaires de cerveau. PECAM-1 est un inhibiteur corécepteur impliqués dans les lymphocytes T et cellules B signalisation qui est fortement exprimée à la membrane plasmique des cellules endothéliales vasculaires. Lors de l’optimisation du présent protocole, l’enrichissement PECAM a été observée dans la membrane échantillons préparés à l’aide de deux et quatre étapes de centrifugation de dextran. Comme le montre la Figure 2 b, il n’y avait aucune différence dans l’expression PECAM entre échantillons préparés à l’aide de ces étapes de centrifugation différents ; Toutefois, quatre tours de dextran ont entraîné dans la meilleure expression des protéines de transport endothéliale, qui indique enrichissement des microvaisseaux améliorée dans les échantillons. En outre, l’utilisation des quatre dextrans rotations meilleure élimination de constituants cellulaires indésirables comme il est indiqué par une expression réduite des protéines neuronales marqueur comme synaptophysine18. Par conséquent, toutes les préparations ultérieures pour les membranes cérébrales microvaisseaux ont été effectuées à l’aide de quatre étapes de centrifugation de dextran. Dans nos expériences de transfert de western, la tubuline protéine constitutive de microtubules a été utilisée comme un contrôle de chargement. Tel que déterminé par l’analyse de protéine de Bradford, préparations membranaires donnent généralement des concentrations de protéines comprise entre 5,0 mg/mL et 10,0 mg/mL. Résultats de dosage de protéines représentant sont représentés dans le tableau 1. Les valeurs de ces protéines ont déterminé basé sur une courbe standard qui a été générée à l’aide de l’albumine sérique bovine (BSA ; 2,0 mg/mL) la norme (Figure 3). Échantillons de protéines ont été dilués 10 fois dans l’analyse de Bradford.
Après le dosage de la protéine, microvaisseaux échantillons de membrane peuvent être utilisés pour des méthodes biochimiques pour l’analyse des protéines telles que l’analyse par western blot, dot blots ou co-immunoprécipitation. Figure 4 a dépeint une tache occidentale représentative pour le BBB transport protéines glucose transporteur-1 (Glut-1) où on a analysé les échantillons prélevés dans le tableau 1 . Effacer des bandes individuelles au poids moléculaire approprié (c.-à-d., s’attend à être 54 kDa) pour ce BBB fortement exprimés protéines ont été détectés dans chaque échantillon de membrane. Chaque voie individuelle dans cette tache occidentale représente échantillon de membrane microvaisseaux préparée à partir d’un seul animal expérimental. Protéine égale dans chaque voie a été déterminée à l’aide de sodium-potassium ATPase (c.-à-d., Na+/k+ ATPase ; poids moléculaire prévu = 113 kDa) comme un contrôle de chargement. Comme le montre la Figure 4 b, expression plus élevée de Glut-1 à la BBB a été observée chez les rats mâles par rapport à leurs homologues féminins. Aucune différence dans l’expression de Na+/k+ ATPase a été observée entre les animaux mâles et femelles. Pour cette analyse densitométrique, les bandes ont été quantifiés à l’aide de logiciels ImageJ.
Figure 1 : schéma des procédures et protocoles d’isoler les microvaisseaux de cerveau de rat et de préparer les échantillons de la membrane. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : données représentatives montrant des microvaisseaux intact et expression d’une protéine de marqueur de cellules endothéliales vasculaires. A: Immunofluorescence souillant montre la localisation des Oatp1a4, un transporteur qui s’est avéré être bien exprimée à la BHE, dans un cerveau intact microvaisseaux isolé comme décrit dans le présent protocole. Localisation de Oatp1a4 a été détectée à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin spécifique contre les Oatp1a4 à une dilution de 01:10. L’anticorps secondaire est un fluorescent IgG de anti-lapin conjugué ayant servi à une dilution de 1 : 300. Echelle = 7,5 μm. B: Analyse par Western blot attestent la pureté des microvaisseaux échantillons montrant l’enrichissement de la protéine de marqueurs spécifiques de cellules endothéliales PECAM-1, qui a été détectée à l’aide d’un anticorps monoclonal de souris à une dilution au 1/100. L’anticorps secondaire est une anti-souris IgG à une dilution de 1/50 000. BH = homogénat de cerveau, MV = fraction brute microvaisseaux, MVM = microvaisseaux membranes du cerveau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : une courbe standard pour l’analyse de protéine de Bradford. Albumine sérique bovine (BSA) a été utilisé comme un standard et a été dilué pour les concentrations suivantes : 0, 0,125, 0,25, 0,50, 0,75, 1.0, 1.5 et 2.0 mg/mL. Absorbance a été mesurée à = 595 nm. Chaque point de données représente une moyenne de trois mesures d’absorbance par concentration de BSA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : la tache occidentale représentative montrant des différences liées au sexe dans l’Expression de Glut-1 dans la Membrane échantillons préparés d’isolé microvaisseaux de cerveau de Rat. A: analyse par Western blot montre l’expression de Glut-1 dans la membrane des échantillons préparés à partir des microvaisseaux isolé des rats Sprague-Dawley mâles et femelles. Glut-1 a été détectée à l’aide d’un anticorps monoclonal de lapin à une dilution de 1/500. L’anticorps secondaire est un anticorps monoclonal IgG anti-lapin à une dilution de 1:40,000. Na=/k+ ATPase, un marqueur de la membrane plasmique et le contrôle de chargement, a été détectée à l’aide d’une IgG anti-lapin polyclonaux à une dilution de 1:40 000. B: Analyse densitométrique de Glut-1 expression dans les échantillons de membrane isolés des rats Sprague-Dawley mâles et femelles. Les résultats sont exprimés en moyenne et des 6 animaux expérimentaux par groupe de traitement. Les astérisques indiquent les points de données qui sont statistiquement significatives du contrôle. Une valeur de p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Animal | Absorbance moyenne | Absorbance ajusté | Concentration calculée | Concentration réelle |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| 1 mâle | 0.7967 | 0.3859 | 0,768 | 7.68 |
| 2 mâles | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| 3 mâles | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| 4 mâles | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7,72 |
| 5 mâles | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| 6 mâles | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| 1 femelle | 0.7114 | 0.3006 | 0,578 | 5.78 |
| 2 femelles | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7.74 |
| 3 femelles | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| 4 femelles | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 5 femelles | 0.8008 | 0,39 | 0.7773 | 7.77 |
| 6 femelles | 0.7975 | 0.3867 | 0,77 | 7.7 |
Tableau 1 : Concentrations de protéines représentant de cerveau microvaisseaux préparations dérivées de Rats mâles et femelles Sprague-Dawley. Valeurs d’absorbance ajusté sont déterminés en déduisant l’absorbance de fond à l = 595 nm d’absorption moyenne des valeurs pour chaque animal expérimental. Dans cet essai, absorbance de fond était déterminé à être 0.4108.
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Discussion
Dans cet article, on décrit une méthode simple et efficace de préparation des échantillons de protéines de membrane des microvaisseaux fraîchement isolées du tissu de cerveau de rat. Plusieurs approches pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat ou de la génération des préparations membranaires de microcirculation isolée ont été signalés dans la littérature13,20,21,22 , 24. bien que le protocole d’isolement microvaisseaux décrit ci-dessus est semblable dans son principe, cette approche a été optimisée pour permettre la préparation des échantillons de la membrane avec un rendement excellent protéine provenant d’un seul animal expérimental. Cette avancée a éliminé la nécessité pour les microvaisseaux de piscine depuis au moins trois rats Sprague-Dawley afin d’obtenir des échantillons avec enrichissement en protéines satisfaisante devant servir à diverses approches de l’analyse des protéines. Ces approches incluent, mais ne se limitent pas à, analyse par western blot, dot blots et co-immunoprécipitation. Il est à noter que la pratique de la mise en commun des microvaisseaux de plusieurs animaux de laboratoire pour générer un seul échantillon grandement réduit la variabilité entre les groupes. Dans cette mesure, mise en commun des microvaisseaux peut entraîner des données avec la diffusion réduite qui ne représente pas le vraie variabilité dans l’expression de la protéine observée dans une population d’animaux de laboratoire. Puisque les échantillons peuvent être préparés à partir des animaux de laboratoire unique, la vraie variabilité d’une population d’étude est capturée, qui permet d’obtenir des données expérimentales à obtenir qui est plus représentatif du processus physiopathologique et pharmacologique sous examen. Un avantage supplémentaire est que les échantillons de membrane microvaisseaux peuvent être préparés en utilisant un nombre réduit d’animaux de laboratoire.
Peut-être le plus important de tenir compte dans l’exécution du présent protocole comprend les étapes de centrifugation. En effet, centrifugeuses peuvent différer entre les laboratoires en raison de leur âge, fabricant, et/ou global condition et intégrité. Cela peut conduire à des variations importantes dans le niveau réel g (ou niveau de tr/min) depuis un spin à l’essorage. Le rôle de cette variation dans l’intégrité de l’échantillon peut être minimisé par centrifugation de tous les échantillons en une seule analyse comparative dans le rotor même en même temps. Par exemple, si un rotor a seulement douze places disponibles pour les tubes à échantillon, puis l’isolement et la préparation des échantillons des microvaisseaux lors d’une expérience individuelle sera limités à douze. Cet examen fait en sorte que les échantillons préparés sont de qualité comparable et qu’aucune variabilité dans l’expression de la protéine moyenne entre groupes expérimentaux peut être assignée à la condition de traitement lui-même.
Une autre considération implique la préparation de la solution de dextran de 26 %, qui est nécessaire pour la séparation des microvaisseaux et tissu parenchymateux cérébral par centrifugation différentielle. Dextran est un polymère de glucose avec une prévalence de lié α-1, 6 unités et possède généralement une structure linéaire de25. Il a aussi une capacité de liaison de hautes eaux. Par exemple, 1 g de dextran 75 (c.-à-d., dextran avec un poids moléculaire moyen de 75 000 Da est utilisé dans le présent protocole) conserve environ 20-25 mL d’eau. Cette propriété de dextran peut conduire à profonds défis en dissolvant la poudre dans la mémoire tampon aqueuse. Solubilité dans l’eau peut être améliorée en chauffant la solution de dextran à une température maximale de 40 ° C. Lors du chauffage, le polymère interagit moins avec des molécules d’eau, provoquant ainsi le dextran d’adopter une conformation moins élargie (c.-à-d., plus faible degré de rétention d’eau) en solution. Chauffage à des températures plus élevées entraînera le polymère de dextran à se décomposer et, par conséquent, elle sera inefficace comme réactif de séparation. En outre, il est essentiel que le pH de la solution de dextran être ajusté à 7.4 immédiatement avant l’emploi. Solutions de dextran 26 % peuvent éprouver des quarts de pH important, même plus de 1-2 heures après préparation. En raison de ces considérations, la solution de dextran 26 % doit être prêt le jour de l’expérience, mais avec un délai suffisant avant l’isolement du tissu cérébral à permettre pour la dissolution et l’ajustement du pH.
Une limitation de ce protocole implique la présence d’autres types de cellules de l’unité neurovasculaire (UNV) dans les microvaisseaux préparations. En plus de cellules endothéliales, l’UNV est composé de différents composants cellulaires, y compris les cellules gliales (astrocytes, la microglie), péricytes et neurones 3,26,27. Isolement des microvaisseaux de rongeur cerveau montre généralement enrichissement avec les cellules endothéliales vasculaires ; Cependant, l’expression des protéines neuronales marqueur ainsi qu’expression de la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP), un marqueur astrocytaire établie, est également observée. En outre, les péricytes sont présentes dans les préparations d’échantillon en raison de leur association intime avec l’endothélium vasculaire. À l’heure actuelle, il est pratiquement impossible d’isoler les microvaisseaux des animaux expérimentaux et d’éliminer tous les péricytes, neurones et les astrocytes. Toutefois, ce protocole a été avancé par l’intermédiaire de plusieurs étapes de centrifugation afin que les échantillons sont enrichies dans les cellules endothéliales (c.-à-d., comme indiqué par la meilleure expression de PECAM-1 suite à chaque étape de centrifugation) avec une présence limitée des autres types de cellule ( par exemple, comme indiqué par réduit l’expression de la protéine marqueur neuronal synaptophysine-1 suite à chaque étape de centrifugation).
Dans l’ensemble, cette approche pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de membrane peut être adaptée à n’importe quel laboratoire ayant un intérêt dans l’étude des protéines BBB conditions physiopathologiques et pharmacologiques. Par exemple, ce protocole prévoit des microvaisseaux échantillons qui peuvent être utilisés pour l’étude des protéines de transport de drogue qui se sont exprimés à la BBB2,18. La robustesse de cette approche a permis l’observation des changements discrets dans Oatp1a4 en réponse à des stimuli pharmacologiques, les données expérimentales qui a informé la conception d’études rigoureuses pour évaluer la fonction de transporteur et de la réglementation à la BHE. Le protocole décrit ci-dessus peut également être appliqué à des analyses de protéine des protéines des jonctions serrées et des protéines des jonctions adherens dans un effort pour comprendre la BHE dans des conditions physiologiques et d’étudier les changements dans l’intégrité BBB en réponse à physiopathologiques et des facteurs de stress pharmacologiques. Clairement, ce protocole peut être adapté pour de multiples applications dans le domaine BBB et représente donc une méthode simple mais robuste et reproductible qui peut être incorporée dans des études BBB nécessitant une analyse des protéines.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01-NS084941) et la Commission de recherche biomédicale en Arizona (ADHS16-162406) à PTR. WA a reçu au-delà de prise en charge d’une nomination pré-doctoral à une bourse de formation du instituts de santé National (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery? AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
