Summary
Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.
Abstract
La barrera blood - brain (BBB) es un tejido de barrera dinámica que responde a varios estímulos fisiopatológicos y farmacológicos. Tales cambios resultantes de estos estímulos pueden grandemente modular la entrega de la droga al cerebro y, por extensión, causan grandes desafíos en el tratamiento del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Muchos cambios BBB que afectan a la farmacoterapia, involucran proteínas que son localizadas y expresadas en el nivel de las células endoteliales. De hecho, tales conocimientos sobre fisiología BBB en salud y enfermedad ha despertado considerable interés en el estudio de estas proteínas de membrana. Desde un punto de vista de investigación de ciencia básica, esto implica un requisito para un método simple pero robusto y reproducible para el aislamiento de los microvasos del tejido de cerebro de animales experimentales. Para preparar muestras de membrana de microvasos recién aislados, es imprescindible que preparaciones de muestra enriquecidas en células endoteliales pero limitadas en presencia de otros tipos de la célula de la unidad neurovascular (astrocitos, microglía y neuronas, pericitos). Un beneficio adicional es la capacidad para preparar muestras de animales individuales con el fin de captar la verdadera variabilidad de expresión de proteínas en una población experimental. En este manuscrito, se proporcionan detalles con respecto a un método que se utiliza para aislamiento de microvasos de cerebro de rata y preparación de muestras de la membrana. Enriquecimiento de microvasos, de muestras derivadas, se logra con cuatro pasos de centrifugación donde dextrano está incluido en el tampón de muestra. Este protocolo puede ser adaptado fácilmente por otros laboratorios para sus aplicaciones específicas. Muestras generadas de este protocolo se han demostrado para producir datos experimentales sólidos de los experimentos de análisis de proteína que pueden ayudar grandemente a la comprensión de las respuestas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos.
Introduction
La barrera blood - brain (BBB) existe en la interfase entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación sistémica y juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Específicamente, las funciones BBB a precisamente control soluto concentraciones en el líquido extracelular cerebral y suministrar eficientemente los nutrientes requeridos para satisfacer las demandas metabólicas considerable del CNS1por tejido cerebral. Estas funciones implican que el BBB, que existe principalmente en el nivel de la célula endotelial microvascular, debe poseer mecanismos discretos que permiten algunas sustancias a parénquima cerebral asegurando que xenobióticos potencialmente perjudiciales no se acumulan. De hecho, las células endothelial microvasculares del cerebro no son fenestradas y exhiben limitada pinocitosis, que aseguran que la falta de permeabilidad no selectiva2. Además, las células endoteliales de cerebro microvessel expresan firmemente proteínas cruce cruce y adherentes que actúan a la forma física "sello" entre las células endoteliales adyacentes y restringir enormemente difusión paracelular de sustancias transmitidas por la sangre en cerebro parénquima. De hecho, la permeabilidad selectiva de sustancias endógenas y exógenas requiere expresión funcional de transportadores de la absorción y flujo de salida de3. Uniones en generales, firmemente, las uniones y transportistas trabajan en conjunto para mantener las propiedades de la única barrera de la BBB.
El BBB es una barrera dinámica que responde a los estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos. Por ejemplo, se ha demostrado estrés hipoxia/reoxygenation para modular la expresión de proteínas de Unión estrecha crítica (es decir, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que se asocia con permeabilidad paracelular mayor para marcadores vasculares como sacarosa4,5,6. Observaciones similares se han realizado en el BBB en el ajuste de lesión de cerebro traumática7 y dolor inflamatorio periférico8,9. Estas mismas enfermedades también pueden modular los mecanismos de transporte en el BBB10,11,12,13,14. De hecho, lesión hipoxia/reoxygenation mejora la expresión funcional del anión orgánico transporte polipéptido 1a4 (Oatp1a4) en el BBB, que puede conducir a aumentos significativos en el transporte de sangre al cerebro de sustratos específicos de transporte de Oatp tales como taurocholate de atorvastatina13. Propiedades BBB también pueden ser modificados por la farmacoterapia, un mecanismo que puede formar una base para ambos cambios profundos en la eficacia de la droga en el cerebro y las interacciones de los fármacos. Por ejemplo, mecanismos de señalización acetaminofén objetivos del receptor nuclear en las células endothelial microvasculares del cerebro, aumenta la expresión funcional del transportador de eflujo crítica P-glicoproteína (P-gp) y modifica la analgesia dependiente del tiempo conferidos por la morfina, un fármaco analgésico opiáceo y P-gp establecido transportan sustrato15. Una profunda comprensión de los cambios BBB, que puede ser inducida por enfermedades o por drogas, también requiere la identificación y caracterización de mecanismos específicos que controlan estas modificaciones. De hecho, se han identificado vías de señalización discretas en células endothelial microvasculares del cerebro que controlan la expresión molecular de ensambladura apretada proteínas16,17 y transportistas15, 18,19. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que vías moleculares complejas están involucradas en la regulación de uniones estrechas BBB y transportadores en salud y enfermedad.
Un reto importante en el estudio de la BBB es el requisito indispensable de un método simple y eficaz para el aislamiento de los microvasos del tejido cerebral derivado de animales de experimentación y posterior preparación de las muestras de la membrana. Estas muestras deben estar preparadas para que sean tanto enriquecidos en las células endothelial microvasculares del cerebro y limitadas en presencia de otros tipos de células. En los últimos años, múltiples metodologías para el aislamiento de la microcirculación del cerebro de roedor se han divulgado en la literatura científica13,20,21,22. Este artículo describe un método reproducible para el aislamiento de microvasos del cerebro de la rata y para la preparación de las muestras enriquecidas con membrana endoteliales que puede utilizarse para el análisis de expresión de la proteína y simple, robusto. Una ventaja de este protocolo de aislamiento de microvasos es la capacidad para obtener preparaciones de muestra de alta calidad y con la suficiente producción de proteínas de un animal experimental individual. Esto permite la consideración de la variabilidad entre animal en la expresión de la proteína. Tal un avance en el presente Protocolo ha mejorado considerablemente la robustez de los estudios BBB porque sobrestimación o subestimación de la verdadera magnitud de los cambios de la proteína en el BBB ahora puede ser evitada. Además, la inclusión de múltiples pasos de centrifugación con dextrano permite mayor enriquecimiento de microvasos en muestras experimentales facilitando la eliminación de componentes celulares no deseados como las neuronas.
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Protocol
Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y se ajustan a la investigación Animal e institutos nacionales de salud (NIH): directrices de experimentos (llegar) En Vivo . El flujo de procedimientos para el protocolo se muestra en la figura 1.
1. preparación para el procedimiento
- Preparar el buffer del microvessel de cerebro (BMB). Inicie pesando 54,66 g D-mannitol, 1,90 g EGTA y base de 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (es decir, Tris) 1,46 g en un vaso limpio. Añadir 1,0 L de agua desionizada. Mezclar los componentes del buffer BMB con un agitador magnético. Una vez que la solución se ha mezclado bien, ajustar el pH a 7.4 con 1,0 M de HCl.
- Preparar solución de dextrano (75.000 MW) 26% (w/v) antes de anestesiar a los animales. Preparar la solución de dextrano como se describe en los pasos siguientes.
Nota: Es muy importante preparar esta solución antes de tiempo porque dextrano puede tomar aproximadamente 1.5-2 h para disolver en buffer acuoso.- Pesar el dextrano en polvo (26 g por 100 mL de tampón) en un vaso limpio.
- Mida el volumen adecuado de BMB y servir en un vaso limpio, separado.
- BMB para verter lentamente en el vaso de precipitados que contiene dextrán en polvo. Mezcle manualmente el dextrano en polvo durante verter de BMB con una varilla de vidrio mezclar.
- Ajustar el pH a 7.4 con 1,0 M HCl inmediatamente antes de usar.
Nota: Un aislamiento típico de microvessels cerebrales de las ratas de Sprague-Dawley individuales 12 (hombre o mujer; 3 meses de edad, 200-250 g cada uno) requiere 200 mL de solución de dextrano (es decir, dextrano de 52 g en 200 mL de BMB).
2. extracción de tejido cerebral de ratas Sprague-Dawley
- Tras el deseado tratamiento experimental, anestesiar ratas Sprague-Dawley con ketamina (50 mg/kg, i.p. de 2,5 mL/kg) y xilacina (10 mg/mL, 2.5 mL/kg I, p.). Diluir la ketamina y xilacina en solución salina 0.9% para una concentración final de 20 mg/mL y 4,0 mg/mL respectivamente. Eutanasia a animales por decapitación usando una afilada guillotina con arreglo a directrices IACUC. Utilice el mismo procedimiento para las ratas de Sprague-Dawley machos y hembras.
- Resecar la piel del cráneo de ratas haciendo un solo corte transversal usando tijeras quirúrgicas.
- Con gubias, cuidadosamente retire la placa de cráneo y exponer el cerebro.
- Quitar el cerebro con una espátula. Separar el cerebro y el tejido cerebral aislado dentro un tubo cónico de 50 mL que contiene 5 mL de BMB. Añadir 1,0 μL de inhibidor de la proteasa cóctel por 1,0 mL de tampón de BMB inmediatamente antes del uso.
3. procesamiento del cerebro
- Transferir el tejido cerebral del tubo cónico de 50 mL a una placa de Petri limpia.
- Con unas pinzas, gire suavemente el cerebro en papel de filtro de diámetro de 12,5 cm para quitar las meninges externas, que libremente se adhieren a la corteza cerebral. Suavemente presione el tejido cerebral contra el papel de filtro y gire el tejido otra vez. Gire el papel filtro con frecuencia durante este paso.
- Separar el plexo coroideo de los hemisferios cerebrales con unas pinzas.
Nota: El plexo coroide aparece como un tejido membranoso transparente localizado en la superficie de los ventrículos cerebrales. - Suavemente aplanar el tejido cerebral y eliminar resto de meninges y bulbos olfativos con unas pinzas.
- Coloque el tejido cerebral cortical en un mortero de vidrio frío. Añadir 5,0 mL de inhibidor de proteasa que contiene BMB cóctel al mortero.
- Usando un homogeneizador de tendido eléctrico, homogeneizar el tejido cerebral con 15 arriba y abajo movimientos a 3.700 rpm. Realizar homogeneización usando una amoladora de tejido de mortero de 10 mL. Entre homogeneización de cada muestra individual, limpia el mortero con etanol al 70%.
Nota: Homogeneización trazos deben ser coherentes en términos de ritmo y magnitud. - Vierta el homogeneizado en tubos de centrífuga etiquetados.
4. centrifugación pasos
- Añadir 8,0 mL de solución de dextrano de 26% a cada tubo de centrífuga etiquetado que contiene homogeneizado de cerebro.
- Invertir el tubo dos veces y luego vórtice completamente la muestra. Llevar a cabo el Vortex de cada muestra usando ángulos múltiples para asegurar una mezcla completa de solución de homogeneizado de cerebro con solución de dextrano de 26%.
- Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
Nota: Para algunos análisis, es útil comparar microvessels cerebrales con la parenquimia del cerebro. Debe ser la evaluación de la expresión de proteínas en el tejido cerebral requiere, el sobrenadante de esta paso de centrifugación (es decir, fracción parenquimatosa cerebral) puede ser recogido y almacenado a-80 ° C para su uso futuro. - Quite el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío y pipeta Pasteur de vidrio.
Nota: Debe tenerse cuidado para no perturbar el sedimento. De lo contrario, se reducirá cantidad de los microvessels cerebrales recogidos, que disminuirá significativamente la producción de proteína de este procedimiento. - Resuspender el sedimento en 5,0 mL de BMB con inhibidor de la proteasa cocktail (es decir, 1,0 μL inhibidor de la proteasa cóctel por 1,0 mL de tampón de BMB). Vórtice de la pelotilla para asegurar una mezcla completa.
- Añadir 8,0 mL de dextrano de 26% a cada tubo de centrífuga y vortex como se describe en los pasos 4.1 4.2 del presente Protocolo.
- Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Usando un frasco de vacío y una pipeta de cristal, aspirar el sobrenadante y asegurar que pellet que contiene los microvasos cerebrales no se interrumpa.
Nota: Material de exceso que se haya adherido a la pared del tubo no contiene microvasos y debe ser cuidadosamente limpiado y quitado. - Repita los pasos 4.5 a 4.8 un adicional dos veces.
- Una vez 4 pasos de centrifugación dextrano se han completado, agregar 5,0 mL de BMB a cada pellet y agitar para Resuspender la muestra.
Nota: Después de finalización de paso 4.10, todo microvessels pueden recogerse para el análisis de la localización de la proteína. Esto puede lograrse tomando 50 μL alícuota del microvessel suspende de nuevo la pelotilla y manchar en un portaobjetos de vidrio. Microvasos son entonces calor fijo a 95 ° C por 10 min en un bloque de calentamiento seguido de fijación en etanol helada para un adicional mínimo 10 diapositivas luego pueden ser almacenado a 4 ° C hasta que la necesite para los estudios por imágenes.
5. ultracentrifugación para preparar muestras de membranas microvasculares del cerebro Total
- Transferir las muestras al homogenizador de vidrio frío.
- Usando un homogeneizador de tendido eléctrico, homogeneizar el tejido cerebral con 8-10 arriba y abajo movimientos a 3.000 rpm. Homogeneización se realiza usando una amoladora de tejido de mortero de 10 mL. Limpiar el mortero con etanol al 70% después de homogeneización de cada muestra individual.
- Transferir muestras para limpiar tubos de ultracentrífuga. Número y peso de cada tubo individual. Balance y par los tubos antes de cargar el rotor de la ultracentrífuga.
Nota: Todos los peso y emparejamiento de los tubos de la ultracentrífuga se realizarán con las tapas en para asegurar una medición precisa de pesos tubo. - Centrifugar las muestras a 150.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Usando un frasco de vacío y vidrio, pipeta Pasteur, aspirar el sobrenadante utilizando cuidado de no perturbar el sedimento de la membrana capilar.
- Basado en el tamaño de la pelotilla, añadir un volumen apropiado de búfer de almacenamiento, que se compone de agua desionizada y BMB en una proporción de 1:1 (v/v). Por lo general, Pellet se resuspendió en 400-500 μL de buffer de almacenamiento de información. Añadir cocktail de inhibidores de proteasa en el búfer de almacenamiento en una proporción de 1,0 μL por 1.0 mL de buffer de almacenamiento.
- Muestras de vórtice para Resuspender el pellet en buffer de almacenamiento.
- Utilizando un pipeta Pasteur de vidrio, transferir las muestras de la membrana capilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado.
- Muestra del paso a través de una aguja de jeringa x 5 para la muestra se mezcla bien y que no hay agregados celulares.
- Almacenar las muestras a-80 ° C hasta que se para el análisis.
Nota: El contenido de proteína de cada muestra de membrana de microvasos se mide utilizando el método de Bradford.
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Representative Results
El flujo experimental para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de membrana de microvasos se muestra en la figura 1. Utilizando el procedimiento presentado aquí, se demostró acertado aislamiento de microvasos intacto del cerebro de la rata (figura 2A). Estos buques fueron obtenidos después de la centrifugación con dextrano e inmediatamente antes de comenzar la ultracentrifugación para preparar muestras de membrana (es decir, siguiente de terminada la paso 4.10). En esta imagen, los microvasos se tiñen con un anticuerpo contra Oatp1a4, un transportador que ha demostrado ser bien expresada en la membrana plasmática de cerebro las células endoteliales microvasculares2,11,13, 18. Mediante análisis de western blot (figura 2B), membrana preparaciones de microvasos de ratas hembras Sprague-Dawley fueron demostradas ser enriquecido en plaquetas células endoteliales adherencia molecule-1 (PECAM-1, también conocido como CD31), una proteína del marcador para microvasculatura cerebral. PECAM-1 es un inhibitorio co-receptor en células T y células B de señalización que se expresa altamente en la membrana plasmática de las células endoteliales vasculares. Durante la optimización de este protocolo, enriquecimiento de PECAM fue observada en muestras de membrana con dos y cuatro pasos de centrifugación de dextrano. Como se muestra en la figura 2B, no hubo diferencias en la expresión PECAM entre muestras preparadas usando estos pasos de centrifugación diferentes; sin embargo, dio lugar cuatro vueltas de dextrano en la mayor expresión de proteínas de transporte endotelial, que indica enriquecimiento del microvessel mejorada en las muestras. Además, el uso de cuatro dextranos giros eliminación mejorada de componentes celulares no deseados según lo indicado por la expresión reducida de proteínas del marcador neuronal como el synaptophysin18. Por lo tanto, todas las preparaciones posteriores para las membranas de microvasos cerebrales se realizaron cuatro pasos de centrifugación de dextrano. En nuestros experimentos de la western blot, la tubulina proteína constituyente de microtúbulos se utilizó como control de carga. Según lo determinado por el análisis de la proteína de Bradford, preparaciones de membrana producen típicamente las concentraciones de proteína que oscilan entre 5,0 mg/mL y 10,0 mg/mL. Resultados de cuantificación de proteínas representativas se muestran en la tabla 1. Estos valores de proteína se determinaron basados en una curva estándar generada utilizando albúmina sérica bovina (BSA; 2,0 mg/mL) como el estándar (figura 3). Las muestras de proteína se diluyeron 10 veces en el ensayo de Bradford.
Tras la cuantificación de la proteína, muestras de membrana de microvessel pueden ser utilizadas para bioquímicos metodologías para el análisis de la proteína tales como análisis de western blot, dot Blot o co-inmunoprecipitación. Figura 4A muestra un inmunoblot representativo para el BBB transporte proteína glucosa transportador-1 (Glut-1) donde se analizaron las muestras del cuadro 1 . Claro solo bandas de peso molecular adecuado (es decir, predijo que 54 kDa) para esta BBB altamente expresado proteína fueron detectados en cada muestra de membrana. Cada carril individual en esta mancha blanca /negra occidental representa muestra de membrana del microvessel preparado a partir de un solo animal experimental. Proteína igual en cada carril se determinó usando ATPase sodium-potassium (es decir, Na+/+ ATPasa k; peso molecular predicho = 113 kDa) como control de carga. Como se muestra en la Figura 4B, se observó mayor expresión de Glut-1 en el BBB en ratas machos en comparación con sus contrapartes femeninas. No en expresión de Na+/+ ATPasa k se observaron diferencias entre los animales masculinos y femeninos. Para este análisis densitométricos, bandas fueron cuantificadas usando el software ImageJ.
Figura 1: esquema de procedimientos y protocolos para aislar microvasos de cerebro de rata y preparar muestras de membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: datos representativos mostrando microvessel intacta y la expresión de una proteína del marcador de células endoteliales vasculares. A: Tinción de inmunofluorescencia demostró la localización de Oatp1a4, un transportador que ha demostrado ser bien expresada en la BBB en una microvessel intacto cerebro aislado como se describe en este protocolo. Oatp1a4 localización fue detectada usando un anticuerpo policlonal de conejo específico contra Oatp1a4 a una dilución de 1:10. El anticuerpo secundario fue un fluorescente IgG anti-conejo conjugado que se utilizó a una dilución de 1:300. Barra de escala = 7,5 μm. B: Mancha blanca /negra occidental análisis demuestran la pureza de las muestras del microvessel mostrando el enriquecimiento de la proteína del marcador de células endoteliales específicos PECAM-1, que se detectó con un anticuerpo monoclonal de ratón en una dilución 1: 100. El anticuerpo secundario fue un anti-ratón IgG en una dilución de 1: 50.000. BH = homogeneizado de cerebro, MV = fracción de crudo microvessel, MVM = membranas de microvasos cerebrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: una curva estándar representativa para el análisis de la proteína de Bradford. Albúmina de suero bovino (BSA) se utilizó como estándar y se diluyó a las siguientes concentraciones: 0, 0.125, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 y 2.0 mg/mL. La absorbancia se midió en = 595 nm. Cada punto de datos representa un promedio de tres lecturas de absorbancia por concentración de BSA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: inmunoblot representativo mostrando diferencias de sexo en la expresión de Glut-1 en la membrana de las muestras preparadas de microvasos de cerebro de rata aislado. A: análisis de Western blot muestran expresión de Glut-1 en muestras de membrana de microvasos aislado de ratas Sprague-Dawley machos y hembras. GLUT-1 se detectó con un anticuerpo monoclonal de conejo en una dilución de 1: 500. El anticuerpo secundario fue un IgG anti-conejo monoclonal en una dilución de 1:40,000. Na=/k+ ATPasa, un marcador de membrana plasmática y el control de carga, fue detectado usando una IgG policlonal de anti-conejo a diluciones de 1: 40.000. B: Análisis densitométrico de la expresión de Glut-1 en muestras de membrana aislado de ratas Sprague-Dawley machos y hembras. Los resultados se expresan como media SEM de 6 animales de experimentación por grupo de tratamiento. Los asteriscos indican los puntos de datos que son estadísticamente significativos de control. Un valor de p < 0.05 se considera estadísticamente significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Animal | Absorbancia media | Ajustado de la absorbancia | Concentración calculada | Concentración real |
| (Λ = 595 nm) | (mg/ml) | (mg/ml) | ||
| 1 macho | 0.7967 | 0.3859 | 0.768 | 7.68 |
| 2 hombre | 0.7849 | 0.3741 | 0.7417 | 7.42 |
| 3 hombre | 0.8187 | 0.4079 | 0.8173 | 8.17 |
| 4 hombre | 0.7985 | 0.3877 | 0.7721 | 7.72 |
| 5 hombre | 0.7943 | 0.3835 | 0.7628 | 7.63 |
| 6 macho | 0.7251 | 0.3143 | 0.6084 | 6.08 |
| Hembra 1 | 0.7114 | 0.3006 | 0.578 | 5,78 |
| Hembra 2 | 0.7993 | 0.3885 | 0.7738 | 7,74 |
| 3 mujer | 0.8201 | 0.4093 | 0.8203 | 8.2 |
| 4 mujer | 0.7526 | 0.3418 | 0.6698 | 6.7 |
| 5 mujer | 0.8008 | 0.39 | 0.7773 | 7.77 |
| 6 mujer | 0.7975 | 0.3867 | 0.77 | 7.7 |
Tabla 1: concentraciones de proteína representante de cerebro Microvessel preparaciones derivan de ratas Sprague-Dawley macho y hembra. Valores de absorbancia ajustado se determinan restando la absorbancia de fondo a l = 595 nm de absorbancia media valores para cada animal experimental. En este ensayo, la absorbancia de fondo fue determinada para ser 0.4108.
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Discussion
En este artículo, se describe un método simple y eficaz de preparación de muestras de proteínas de membrana de microvasos recién aisladas de tejido cerebral de rata. Varios enfoques para aislamiento de microvasos de cerebro de rata o generación de las preparaciones de membrana de microvasculatura aislada se han divulgado en la literatura13,20,21,22 , 24. Si bien el protocolo de aislamiento del microvessel descrito es similar en principio, este enfoque ha sido optimizado para permitir la preparación de las muestras de la membrana con proteínas excelente rendimiento de un solo animal experimental. Este avance ha eliminado la necesidad de a piscina microvasos de ratas Sprague-Dawley por lo menos tres para obtener muestras con enriquecimiento de proteína satisfactorio para su uso en diversos enfoques para el análisis de la proteína. Estos enfoques incluyen, pero no se limitan a, análisis de western blot, dot Blot y co-inmunoprecipitación. Cabe señalar que la práctica de la agrupación de microvasos de animales experimentales múltiples para generar una muestra considerablemente reduce la variabilidad entre grupos. En este sentido, agrupación de microvessel puede resultar en datos con la extensión reducida que no representa la verdadera variabilidad en la expresión de la proteína observada en una población de animales de experimentación. Ya que muestras se pueden preparar de solo animales de experimentación, es capturada la verdadera variabilidad de una población de estudio, que permite datos experimentales para obtener es más representativo del proceso fisiopatológico o farmacológico bajo examen. Un beneficio adicional es que se pueden preparar muestras de membrana de microvasos utilizando un número reducido de animales de experimentación.
Tal vez la consideración más importante en la ejecución de este protocolo incluye los pasos de centrifugación. De hecho, centrifugadoras pueden diferir entre laboratorios debido a su edad, fabricante, o general condición e integridad. Esto puede conducir a variaciones significativas en los real g nivel (o rpm) de vuelta a vuelta. Puede minimizar el papel de esta variación en la integridad de la muestra por centrifugación de las muestras en un solo análisis comparativo juntos en el mismo rotor al mismo tiempo. Por ejemplo, si un rotor tiene ranuras solamente doce tubos, entonces el aislamiento y la preparación de muestras de microvasos en un experimento individual se limitará a doce. Esta consideración garantiza que las muestras preparadas son de calidad comparable y que cualquier variabilidad en la expresión de la proteína promedio entre grupos experimentales puede ser asignada a la condición de tratamiento sí mismo.
Una consideración adicional consiste en la preparación de la solución de dextrano de 26%, que se requiere para la separación de los microvasos cerebrales y tejido parenquimal cerebral mediante centrifugación diferencial. Dextrano es un polímero de glucosa con una prevalencia de α-1, 6-unidades y por lo general posee una estructura lineal25. También tiene una capacidad de retención de agua alta. Por ejemplo, 1 g de dextrán 75 (es decir, dextrano de peso molecular promedio de 75.000 Da como se utiliza en este protocolo) conserva unos 20-25 mL de agua. Esta propiedad de dextrano puede conducir a grandes desafíos en disolver el polvo en el buffer acuoso. Solubilidad en agua puede mejorarse mediante el calentamiento de la solución de dextrano a una temperatura máxima de 40 ° C. Al calentarse, el polímero interactúa menos con moléculas de agua, causando dextrano a adoptar una conformación menos ampliada (es decir, menor grado de retención de agua) en la solución. Calefacción a temperaturas más altas hará que el polímero dextrano romper y, por consiguiente, será ineficaz como un reactivo de separación. Además, es esencial que el pH de la solución de dextrano se ajustó a 7,4 inmediatamente antes del uso. Soluciones de dextrano de 26% pueden experimentar cambios de pH importantes, incluso sobre 1-2 horas después de la preparación. Debido a estas consideraciones, la solución de dextrano 26% debe prepararse en el día del experimento, pero con tiempo suficiente antes del aislamiento del tejido de cerebro para permitir la disolución y ajuste de pH.
Una limitación de este protocolo consiste en la presencia de otros tipos de la célula de la unidad neurovascular (NVU) en preparaciones de microvasos. Además de las células endoteliales, el NVU está conformada por distintos componentes celulares, incluyendo células gliales (astrocitos y microglia), pericitos y neuronas 3,26,27. Aislamiento de microvasos de cerebro de roedor demuestra típicamente enriquecimiento con células endoteliales vasculares; sin embargo, la expresión de proteínas del marcador neuronal, así como expresión de la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP), un marcador establecido de astrositos, también se observa. Además, pericitos están presentes en preparaciones de la muestra debido a su íntima asociación con el endotelio vascular. En la actualidad, es prácticamente imposible aislar los microvessels del cerebro de animales experimentales y eliminar todos los pericitos, neuronas y astrocitos. Sin embargo, este protocolo se ha avanzado a través de múltiples pasos de centrifugación para que las muestras están enriquecidas en células endoteliales (es decir, como se indica por la expresión mejorada de PECAM-1 siguiendo cada paso de centrifugación) con presencia limitada de otros (tipos de células es decir, como se indica por redujo la expresión del marcador neuronal proteína sinaptofisina-1 después de cada paso de centrifugación).
En general, este enfoque para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana puede ser adaptado en cualquier laboratorio con un interés en el estudio de proteínas BBB en condiciones fisiopatológicas o farmacológicas. Por ejemplo, este protocolo proporciona muestras de microvasos que pueden ser utilizadas para el estudio de las proteínas de transporte de droga que endógeno se expresan en el BBB2,18. La robustez de este enfoque ha permitido la observación de cambios discretos en Oatp1a4 en respuesta a los estímulos farmacológicos, datos experimentales que ha informado diseño de estudios rigurosos para evaluar la función del transportador y la regulación en el BBB. El protocolo descrito anteriormente puede aplicarse también al análisis de proteína de Unión estrecha proteínas y proteínas de ensambladura de los adherens en un esfuerzo por entender el BBB en condiciones fisiológicas y a estudiar cambios en la integridad BBB en respuesta a patofisiológico y factores de estrés farmacológicos. Claramente, este protocolo puede ser adaptado para múltiples aplicaciones en el campo BBB y por lo tanto, representa un método simple pero robusto y reproducible que puede ser incorporado en los estudios BBB que requieren análisis de proteínas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (R01-NS084941) y la Comisión de investigación biomédica de Arizona (ADHS16-162406) al PTR. WA ha recibido más allá del apoyo de una cita de predoctoral a nacional institutos de salud entrenamiento becado (T32-HL007249).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
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