Summary
Динамический адгезии иммунокомпетентных клеток к стенке сосуда является необходимым условием для кишечника самонаведения. Здесь мы представляем протокол для функциональной в vitro пробирного анализа воздействия антител анти Интегрин, chemokines или других факторов на динамических клеточной адгезии клеток человека с помощью addressin покрытием капилляров.
Abstract
Гут самонаведения иммунных клеток имеет важное значение для патогенезе воспалительных заболеваниях кишечника (IBD). Интегрин зависимой клеточной адгезии к addressins является важным шагом в этом процессе и терапевтические стратегии, мешая адгезии были успешно установлены. Интегрин антитела анти α4β7, vedolizumab, используется для клинического лечения болезни Крона (CD) и язвенного колита (UC) и дальнейшего соединения могут последовать.
Детали сцепления процедуры и механизмы действия антител анти Интегрин во многих отношениях из-за ограниченных имеющихся методов для функциональных исследований в этой области по-прежнему неясны.
Здесь мы представляем динамического адгезии assay для функционального анализа адгезии клеток человека условиях потока и влияние анти Интегрин терапии в контексте IBD. Он основан на перфузии первичных клеток человека через капилляры addressin покрытием ультратонких стекла с микроскопический анализ в реальном времени. Assay предлагает разнообразные возможности для уточнения и изменения и проводит потенциалов для механистический открытий и трансляционная приложений.
Introduction
Ячейки движения жестко регулируется процесс незаменимым для развития и функционирования многоклеточных организмов, но также замешан в патогенезе множества заболеваний1. Недавно процесс самонаведения иммунных клеток из крови в периферических тканях приобрел все большее внимание, так как он способствует пополнения и расширения болезнетворные клетки в воспаленных тканях иммунологически опосредованной заболеваний2 ,3. В частности было показано самонаведения иметь трансляционная отношение при воспалительных заболеваниях кишечника (IBD). Vedolizumab антитела Интегрин терапевтического анти α4β7, вмешиваясь в кишечнике самонаведения показал эффективность в крупных клинических испытаний в4,5 и успешно используется в реальной клинической практике6,7 , 8. дальнейшие соединения могут последовать9,10. Аналогично антитела Интегрин терапевтического анти α4, natalizumab, используется для лечения рассеянного склероза (РС)11.
Однако наши функциональные понимание самонаведения процесса в целом и механизм действия таких терапевтических антител в частности еще ограничено. Хорошо известно, что головка самонаведения состоит из нескольких этапов, включая клетки привязывать и прокатки с последующим клеточной адгезии, ведущих к фирмы арест последовал транс эндотелиальной миграции12,13. Вышеупомянутые антитела нейтрализовать интегринов на поверхности клеток, предотвращая взаимодействие с addressins на эндотелий стенок сосудов. Это считается препятствуют фирмы клеток адгезии14,15. Тем не менее мы только начинаем понимать дифференциального актуальность конкретных интегринов для клеток самонаведения различных клеток подмножеств. Кроме того воздействие антител анти Интегрин на различных мобильных подмножеств и доза ответ ассоциаций в основном неизвестны, ведущих к много открытых вопросов в области кишечника самонаведения и антиадгезионное терапии в IBD.
Таким образом отчаянно необходимы удобные инструменты для решения таких вопросов. Эффект анти Интегрин антител на Интегрин addressin взаимодействие пока преимущественно была оценена оценки эффективности/привязки ингибирование привязки с проточной цитометрии или через статического прилипания анализов16,17 ,18,19,20, таким образом с очевидной упрощение и отклонение от физиологические ситуации. Мы недавно создали динамический адгезии пробирного учиться Интегрин зависимых адгезии клеток человека в addressins и последствия антител анти Интегрин под касательное напряжение2. Принцип метода ранее было продемонстрировано с мыши клетки21,22. Здесь он был адаптирован и разработаны для решения упомянутых выше вопросов, поступательные, открытие Роман способы лучше понять механизмы терапии с анти Интегрин антител в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
По словам одобрения Комитета по этике Фридрих-Александр Университета Эрланген-Нюрнберг выполнены исследования, описанные в следующих разделах.
1. Подготовка капилляров
- Подключите прямоугольный капилляров к резиновой трубки растяжения труб на одной стороне с маленькие ножницы и внимательно вставляя капиллярные (примерно 0,5 см) в трубку. Уплотнение связь между капилляров и трубки с пластиковой парафин фильм.
- Слой капилляра с 20 мкл addressin (рекомбинантный ФК химеры; 5 мкг/мл, addressin, например MAdCAM-1, в буфере покрытие (150 мм NaCl + 1 мм HEPES)) или соответствующие изотипа управления решения с помощью пипетки p20 (жидкость будет впитывался сам капилляр). Затем печать стороне, не подключен к Трубы пластиковые парафин пленкой и инкубировать для по крайней мере 1 ч при 37 ° C. Использование капилляр заполнена только с буфером покрытия или с соответствующим изотипа управления как отрицательный контроль.
- Удалите пластиковые парафин фильм от кончика капилляра, пустые покрытие, позволяя жидкости замочить из капилляров на бумажные полотенца и блок капилляров для по крайней мере 1 час с 20 мкл блокирования раствор (1 x PBS с 5% BSA) при 37 ° C. Уплотнение открытой стороне капилляра с пластиковой парафин фильм. Не удаляйте блокирования решения прежде чем микроскопии.
2. ячейки изоляции, лечения и подготовки для микроскопии
Примечание: Эти шаги могут выполняться во время инкубации периодов, необходимых для подготовки капилляров.
- После обоснованное письменное согласие согласно положениям о местном сбор 18 мл антикоагулянтом полной человеческой крови с коллекцией асептических крови из вен локтевого добровольчества лиц (например, IBD больных и здоровых элементов управления) Комитет по этике.
Примечание: Этот шаг следует выполнять только обученный и опытный медицинский персонал согласно национальных и/или местными правилами. - Заполните крови в 50 мл трубки и разбавляют объем 35 мл с ПБС. Затем подложка смесь крови PBS с 10 мл градиента плотности среды.
- Выполнение градиентного центрифугирования плотность 15 мин на 800 x g и 24 ° C без тормозов для разделения клетки.
- Собирайте мононуклеаров периферической крови (получения), аспирационных слой белых клеток прямо на вершине плотность градиента среднего слоя (ясно среднего слоя). Перевести репликацию в свежий 50 мл трубки, заполнить до 50 мл с ПБС и центрифуги для 10 мин 300 x g и 10 ° C.
- Отменить супернатанта, Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл ПБС и впоследствии рассчитывать число клеток, например, с помощью Нойбауэр клеток подсчета камеры.
- Необязательно: Для изучения адгезии гранулоцитов выполните следующую процедуру. В противном случае перейдите к шагу 2.7 и 2.8.
- Соберите гранулоцитов слой (нижний слой после плотность градиентного центрифугирования, содержащие также эритроцитов). Ресуспензируйте клетки в 40 мл ПБС. Затем добавить 8 мл 6% декстрана в однократном ПБС, осторожно перемешать и пусть клетки отложений на 30 минут при комнатной температуре.
Примечание: Эритроцитах будет опускаться на дно трубки, в то время как гранулоцитов будет оставаться во взвешенном состоянии. - После 30 мин собирать супернатанта, передачи в свежий 50 мл трубки и центрифуги для 6 мин 300 x g и 4 ° C. Отменить супернатант и лизируют оставшиеся эритроцитов, добавив 5 мл 0,2% NaCl в ddH2O. инкубировать в течение 1 мин.
- Добавьте 5 мл 1,4% NaCl в ddH2O и инкубировать еще минуту. Остановить гипотонический lysis, добавив 20 мл ПБС и центрифуги для 6 мин на 300 x g и 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл ПБС. Затем подсчет числа клеток с помощью Нойбауэр клеток подсчета камеры.
- Соберите гранулоцитов слой (нижний слой после плотность градиентного центрифугирования, содержащие также эритроцитов). Ресуспензируйте клетки в 40 мл ПБС. Затем добавить 8 мл 6% декстрана в однократном ПБС, осторожно перемешать и пусть клетки отложений на 30 минут при комнатной температуре.
- Необязательно: Для изучения адгезии КСДОР подмножеств, очистки различных типов клеток или подмножества (например, CD4+ и CD8+ T клетки или CD19+ B клеток) с использованием микрошарики согласно протоколу производителя или активирован флуоресценции ячейка, сортируя (FACS). В противном случае перейдите к шагу 2.8.
- Центрифуга суспензию клеток для 10 мин 300 x g и 10 ° C. Отменить супернатант и запятнать клетки с ячейкой, отслеживание краситель (например, CFSE), в соответствии с инструкциями производителя.
- Впоследствии центрифуга клетки для 10 мин на 300 x gи удалить супернатант. Ресуспензируйте в ПБС, определить количество клеток и центрифуги снова за 10 мин на 300 x g.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле окрашенных клеток в соответствующее количество буфера адгезии (150 мм NaCl + 1 мм HEPES + 1 мм MgCl2 + 1 мм CaCl2) для получения подвеска 1,5 х 106 клеток/мл. Затем добавьте соответствующее количество 100 мм2 НКД для получения конечной концентрации 1 мм.
Примечание: Эти клетки теперь готовы для микроскопии. - Дополнительно: Лечить клетки с цитокинами, нейтрализующих антител или других соединений. В противном случае перейдите к шагу 3.
- Пропустить шаг 2.10 и Ресуспензируйте окрашенных клеток гранулы из шага 2.9 в RPMI среднего (с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина) для получения концентрации 1,5 х 106 клеток/мл.
- Пипетка 1 мл суспензии этой ячейки в столько скважины плиты 48-хорошо, как есть условия для проведения анализа. Всегда готовить один колодец с необработанной клетки к открытию через немелованной капиллярные как отрицательный контроль и один колодец с необработанной клетки к открытию через addressin покрытием капиллярные как позитивный элемент управления.
- Для лечения с анти Интегрин антител добавьте соответствующее количество антител (например, 10 мкг/мл vedolizumab) суспензии клеток. Инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Для лечения с цитокинами добавьте соответствующее количество рекомбинантных цитокинов (например, 10 нг/мл CXCL10) суспензии клеток. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
- После инкубации урожай, resuspending клетки, несколько раз с помощью пипетки p1000 клетки. Перевести клетки в 2-мл пробирку, хорошо снова промыть с 1 мл раствора 1 x PBS и добавить в 2-мл пробирку. Определите номер ячейки.
Примечание: Инкубационный адэрентных клеток населения (например, моноцитов) может потребовать дополнительных мер (например., лечение с трипсином) для отсоединения клетки от пластины.
- Центрифуга клетки для 10 мин на 300 x g при 10 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в соответствующее количество адгезии буфер для получения подвеска 1,5 х 106 клеток/мл. Затем добавьте соответствующее количество 100 мм2 НКД для получения конечной концентрации 1 мм. При предварительной обработки с chemokines не добавляйте НКД2 суспензию клеток. Эти клетки теперь готовы для микроскопии.
Примечание: Минимальный объем, используемый для assay зависит насос и трубы используется. В этом исследовании, используя Перистальтический насос и трубы, указанного в Таблице материаловтребуется минимальный объем 400 мкл. Если желаемый и (в зависимости от типа клеток и доходность), концентрация клеток в суспензии может быть увеличена для измерения адгезии выше в более короткий период времени. - Потенциальные изменения: пробирного конкурентоспособные динамические адгезии
- Выполните вышеупомянутые шаги с различных клеточных популяций необходимо сравнить друг с другом (например, нормативных и клеток-эффекторов T изолировали через магнитный шарик изоляции, следуя инструкциям изготовителя согласно шагу 2.7).
- Пятно каждой популяции с другой краской (например, CFSE и FarRed), как описано в шагах 2.8 – 2,9 уметь дифференцировать клеточных популяций при микроскопии.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте окрашенных клеток окатышей в соответствующее количество буфера адгезии (150 мм NaCl + 1 мм HEPES + 1 мм MgCl2 + 1 мм CaCl2) для получения подвеска 1,5 х 106 клеток/мл.
- Смесь равных объемов клеточных суспензий (например, 500 мкл регулирующих Т-клеток) и 500 мкл клеток-эффекторов T для получения окончательного смешанные клетки концентрация 1,5 х 106 клеток/мл. Затем добавьте соответствующее количество 100 мм2 НКД для получения конечной концентрации 1 мм. Такие подвески может впоследствии быть использована для конкурентного анализа процесса адгезии, perfusing различных клеточных популяций через же капилляров.
3. живой клетки визуализации динамических сцепления
- Включите микроскопом и выберите соответствующий фильтр или лазером для возбуждения отслеживания dye(s) (например, 488 нм лазер для CFSE), соответствующая задача (например, 40 X) и благоприятных время перерыва приобретения режим визуализации ячейки.
- Удалите пластиковые парафин фильм от кончика капилляра и подключить капилляра с короткий кусок трубки (примерно 5 см длины), растяжения труб на одной стороне с маленькие ножницы и внимательно вставляя капиллярные (примерно 0,5 см) в трубу. Уплотнение связь между капилляров и трубки с фильмом пластиковых парафина.
- Смонтировать капилляр на подносе фиксации (например, крышки от 6-ну пластины с прямоугольный вырез немного короче, чем длина капилляра) и фиксированной капилляров на лоток держатель микроскопа, так что капилляр в фокус и готов для микроскопии.
- Вставьте резиновую трубку в соответствующий паз перистальтического насоса и поместите конец не прикреплены к капилляра трубу согласно образца, содержащего суспензию клеток. Вставьте короткой трубки на другой стороне капилляра в 15 мл для сбора через поток.
- Пусть заполнения трубки с расходом 500 мкл в минуту до тех пор, пока суспензию клеток почти достигает капилляра. Затем пусть капиллярного заполнения с расходом 100 мкл/мин.
Примечание: Быстрое заполнение капилляра обеспечивает регулярное распределение суспензию клеток внутри капилляра. - Когда капилляр заполнена с суспензию клеток, настройте скорость потока до 10 мкл/мин.
Примечание: Эти скорости потока могут отличаться, когда капилляры другого размера или различных перистальтические насосы используются. В этом исследовании скорость потока 10 мкл/мин была оптимизирована для насоса и капилляров для имитации в естественных условиях поток крови. - Промежуток времени снимки клеток, медленно продвигаясь через капилляр вдоль addressin покрытием внутри стены каждые 2 s для в общей сложности 3 мин.
Примечание: Интервалы и общее время может варьироваться в зависимости от типа клеток и вопрос решаться. - Прежде чем выбросить капилляра, экран весь капилляров через глаз кусок Микроскоп, чтобы убедиться, что раздел показан на видео является представителем. При необходимости, сделайте вторую запись.
- Бесплатный труб из насоса и пусть оставшиеся жидкость бежать обратно в 2-мл пробирку, затем отсоедините лоток для крепления и капиллярной трубки и продолжать с следующий капилляров.
4. оценки и подсчета клеток
- Откройте покадровой последовательности с соответствующим программным обеспечением и экспорт первых трех изображений («начала») и три последние изображения («конец») как Tiff-файлы.
- Открыть три «Начало» изображения в ImageJ, преобразовать 32 bit ('изображение | Тип | 32 bit') и объединение картинок (' изображение | Цвет | Объединение каналов; Назначьте цвета красного, зелёного и синего различных изображений). Преобразование изображения в RGB (' изображение | Type-RGB') и сохраните как файл Tiff. Повторите с изображениями «Конец».
Примечание: В конкурентной динамичной адгезии анализов с клетками, окрашенных в разные цвета, сначала разделить каналы изображения отдельно анализировать адгезии различных клеточных популяций. - Граф белые клетки видна в композиционных материалах «Начала» и «Конец» и вычесть количество белых клеток в «Начале» из белых клеток в «Конец».
Примечание: Разница представляет количество недавно присоединения клетки в интервале времени, 3 мин. В составное изображение клетки, которые переехали видны в определенный цвет, который был назначен на соответствующих кадров, поскольку они локализовать в другом месте в предыдущий и следующий кадр. Для клеток, которые являются приверженцем, сигналов красного, зеленого и синего в том же месте дублировать белый. - Чтобы лучше визуализировать результаты, скомпилируйте видео с покадровой последовательности, например, с помощью ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод представлен в этой рукописи призвана имитировать процесс в vivo человека клеточной адгезии к эндотелиальных стене как можно ближе к функционально оценить клеточной адгезии и роль мешая антител. Таким образом ультратонкий капилляров с addressins покрытием и увлажненную с дневно обозначенные клеток человека интерес с помощью перфузионного насоса. С помощью живых клеток, визуализации адгезии клеток человека к addressins можно наблюдать в режиме реального времени (рис. 1).
Этот метод особенно подходит для выяснения механизмов антиадгезионное терапии в IBD. Как показано на рисунке 2А, перфузии капилляров, покрытая с ИКАМ-1 и VCAM-1, MAdCAM-1 ФК Isotype химеру с человека получения приводит к заметному адгезии, когда один из трех addressins присутствует. В отличие от сцепления с покрытием изотипа капилляров является минимальным. Ингибирование Интегрин addressin взаимодействий с использованием нейтрализующие антитела обычно приводит к заметное снижение динамического сцепления, что отсутствует, когда isotype антитела управления добавляются (репрезентивно показанный Рисунок 2B, пул количественные данные в рисунке 2 c).
Аналогичным образом влияние chemokines на Интегрин близость модуляции может расследоваться в этой системе предварительной инкубации с такие пептиды в пробирке. Как показано на репрезентативных данных на рисунке 3, лечение CD4+ человека Т-клеток с CCL2 или CXCL10 водит к увеличенной адгезией к MAdCAM-1 по сравнению с необработанными клеток человека.
Рисунок 1: Схематическое представление рабочего процесса. Подготовка addressin покрытием ультратонких капилляров и дневно обозначенные клетки человека (слева) следуют перфузии клеток через капилляр с использованием перистальтического насоса (в середине) и промежуток времени микроскопии (справа). Изменение с разрешения ссылки23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: динамические адгезии человека периферической крови мононуклеаров (получения) от управления доноров в различных addressins. (A) количество недавно присоединения получения капилляры, с покрытием или с конкретными addressins или с ФК изотипа управления (n = 6). (B) представитель образы динамических адгезии в капиллярах ИКАМ-1 с покрытием, увлажненную с необработанной репликацию (NT) или клетки инкубировали с 10 антитела анти CD18 мкг/мл или 10 мкг/мл IgG изотипа управления. Начало: Объединить первые три изображения последовательности 3 мин; Конец: Объединить три последние изображения последовательности 3 мин; Придерживаясь клетки изображены белый. Указываются их количество, а также разница (то есть, недавно присоединившихся клетки). Шкалы бар = 100 µm. (C) влияние антител анти Интегрин (каждый используется в концентрации 10 мкг/мл) на адгезию динамической. Слева: Число вновь присоединившихся клеток капилляров покрытием с ИКАМ-1 и увлажненную с лечить, лечить анти CD18 или IgG изотипа управления лечение клетки; Средний: Число вновь присоединившихся клеток капилляров покрытые VCAM-1 и увлажненную с лечить, лечить natalizumab или IgG изотипа управления лечение клетки; Справа: Число вновь присоединившихся клеток капилляров покрытием с MAdCAM-1 и увлажненную с лечить, лечить vedolizumab или IgG изотипа управления лечение клетки (n = 5 – 6). Бары указывают средства с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Статистическое тестирование проводилось с односторонним следуют несколько Ньюман-Keuls сравнения теста ANOVA (* p < 0,05; ** p < 0.01). Изменение с разрешения ссылки23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Хемокиновых опосредованной динамических адгезии человека CD4 клеток+ T MAdCAM-1. Изображения от представителя динамический прилипания пробирного в MAdCAM-1-покрытием капилляров, увлажненную с необработанной CD4 (NT)+ T клетки или клетки инкубировали с 10 нг/мл rhCXCL10 или 100 нг/мл rhCCL2. Начало: Объединить первые три изображения последовательности 3 мин; Конец: Объединить три последние изображения последовательности 3 мин; Придерживаясь клетки изображены белый. Указываются их количество, а также разница (то есть, недавно присоединившихся клетки). Шкалы бар = 100 µm. Preincubation с chemokines приводит к увеличению динамического адгезии, предположительно из-за Интегрин близость модуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
SupplementaryVideos: фильмы с трех минут последовательности изображений из капилляров MAdCAM-1 с покрытием, увлажненную с дневно обозначенные репликацию. (A) капиллярной увлажненную с необработанной клеток. (B) капиллярной увлажненную с клетками обрабатывают 10 мкг/мл vedolizumab. (C) капиллярной увлажненную с клетками обрабатывают 10 мкг/мл человека IgG изотипа управления. Мобильный поток снизу вверх, вновь присоединившихся клетки обозначаются белые стрелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вышеупомянутый Протокол описывает полезный метод для изучения динамических адгезии иммунных клеток человека в эндотелиальных лигандами. Путем изменения покрытием лигандов, типы перфузии клеток или подмножества, инкубации с дополнительные стимулы или различных нейтрализующих антител, она имеет почти неограниченные возможности применения. Таким образом такие анализы динамического присоединения может быть полезно ответить на оба фундаментальных вопросов фундаментальных исследований, а также переводческие запросы, которые могли бы помочь разработать и оптимизировать клинической терапии с препаратами, вмешиваясь в процесс присоединения.
Утилита анализа для изучения последствий клинической терапии антиадгезионное была недавно продемонстрирована. Кроме того различных клеточных популяций, выражая различные типы и количество интегринов показывают последовательное уровней динамического присоединения к соответствующим addressins, поддерживая действительность пробирного23.
В целом завершение протокола требуется около 6 часов работы и представляет промежуточные технические проблемы. После начала покрытие капилляра, критической проблемой, чтобы избежать обезвоживания. Это требует точной запечатывания во время инкубации шаги и тщательной обработки капилляров, при обмене решения. Кроме того начало процесса перфузии требует определенной осторожности. По объёму мертвых труб невозможно заполнить весь труб с расходом окончательный перфузии. С другой стороны изменяя скорость потока после промывки капилляра с высокой скоростью влечет за собой риск прерывания потока приводит к возможности статического прилипания, ограничивающие действия в отношении динамического адгезии. Таким образом важно своевременно переключиться в окончательном потока. Окончательный потока должен быть выбран зависит от насоса, труб и капиллярной размера используется. Чтобы имитировать человека кровотока в высокие эндотелиальные венулы как максимально, поток объемом 0.1-5 мм/s рекомендуется24,25.
Сложность анализа может заметно увеличить, когда применяются изменения. Например анализ Т-клеток конкретных подмножеств может потребовать сложных поляризации или очистки стратегии26. Кроме того, включая самонаведения шаги привязывая, прокатки и клетки активации12 в эксперимент будет способствовать дальнейшему увеличению сложности, так как это может быть необходимо пальто комбинации лиганда внутри капилляров или лечить (предварительно) увлажненную популяции клеток с химио - или цитокины для учета селектина зависимых прокатки и клеток хемокиновых индуцированной активации и Интегрин сродство модуляции27. Однако, это может быть особенно интересные вопросы для будущих исследований, особенно, как представлена методика позволяет функционально адрес такого сложного взаимодействия различных молекул с клетки человека и лигандами. Как упоминалось выше, конкурентоспособной анализ динамических сцепления нескольких по-разному окрашенных клеточных популяций в том же капиллярного может добавить еще один уровень сложности. Кроме того она также продемонстрировала, что эндотелиальные клетки могут использоваться в оптимизированных систем вместо рекомбинантных лигандов28.
Хотя это функционального анализа, техника ограничивается сокращения комплекс в vivo сетей к выбранным набором связанных молекул в пробирке. Это означает, что эффекты неизвестного или неожиданного дополнительных факторов может игнорировать или считается не достаточно. Однако это частая проблема в исследований человеческого, потому что этические соображения часто запрещают механистический в естественных условиях расследования29.
Взятые вместе, этот протокол представляет функциональные пробы для анализа динамических адгезии и анти Интегрин терапии Интегрин зависимых при воспалительных заболеваниях кишечника. В то время как основной принцип довольно прямо вперед и не слишком трудно выполнить, он может быть украшен и изменена в нескольких отношениях и имеет потенциал, чтобы ответить трансляционная вопросы, касающиеся антиадгезионное терапии в IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F.N. служил в качестве советника для Pentax, Джулиани, MSD, Abbvie, Янссен, Такэда и Boehringer. M.F.N. и с.з. получил поддержку исследований от Такеда и Рош.
Acknowledgments
Исследования CN, IA, НБН и SZ было поддержано междисциплинарный центр клинических исследований (IZKF) и ELAN программа Университета Эрланген-Нюрнберг, остальное Kröner-Fresenius-Stiftung, Фриц-Бендер-Stiftung, немецкий крона и Колит фонда (DCCV), клинических исследований группы CEDER немецкого совета научных исследований (DFG), программа тему DFG на микрофлору, новые поля инициативу и DFG совместных научно-исследовательских центров 643, 796 и 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
