Summary
Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Gut posta bağışıklık hücrelerinin inflamatuvar barsak hastalıkları (IBD) patogenezinde için önemlidir. Integrin bağımlı hücre adezyon addressins için bu süreçte önemli bir adımdır ve tedavi stratejileri ile yapışma müdahale başarıyla kurulmuştur. Anti-α4β7 integrin antikor, vedolizumab, Crohn hastalığı (CD) klinik tedavisi için kullanılır ve ülseratif kolit (UC) ve daha fazla bileşikler takip etmek olasıdır.
Yapışma yordamı ayrıntılarını ve anti-integrin antikorlar eylem mekanizmaları hala bu alanda fonksiyonel araştırma için sınırlı kullanılabilir teknikleri nedeniyle birçok bakımdan pek açık değildir.
Burada, IBD bağlamında insan hücre adezyon akışı koşullar altında fonksiyonel analiz ve anti-integrin tedavilerin etkisi için bir dinamik yapışma tahlil mevcut. Gerçek zamanlı mikroskobik analizi ile ultrathin cam kaplı isteyebileğinizi kılcal damarlar ile birincil insan hücreleri perfüzyon dayanmaktadır. Tahlil iyileştirmeler ve değişiklikler için fırsatlar sunar ve potansiyelleri mekanik keşifler ve çevirim uygulamalar için tutar.
Introduction
Hücre hareket vazgeçilmez geliştirme ve işlevi çok hücreli organizmalar için sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir ama aynı zamanda çok sayıda hastalıkları1patogenezinde karıştığı. Stok yenileme ve genişletme iltihaplı dokulara immunologically aracılı hastalıkları2 patojen hücrelerinin katkıda beri son zamanlarda artan ilgi, periferik dokulara kan akışından bağışıklık hücreleri izleme sürecinin kazanmıştır ,3. Özellikle, posta iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD) translasyonel yakınlık derecesine sahip olduğu gösterilmiştir. Gut posta ile müdahale tedavi anti-α4β7 integrin antikor vedolizumab etkinliği büyük klinik çalışmalarda4,5 ' te gösterilen ve gerçek klinik pratikte6,7 ' başarılı bir şekilde kullanılmıştır , 8. daha fazla bileşikler9,10izleyin muhtemeldir. Benzer şekilde, tedavi anti-α4 integrin antikor, natalizumab, multipl skleroz (MS)11tedavisi için kullanılır.
Ancak, bizim işlevsel izleme süreci genel olarak anlama ve bu tür tedavi antikorların etki mekanizması özellikle hala sınırlı. İyi posta hücre hayvan zinciri ve sağlam tutuklama trans endotel geçiş12,13tarafından takip önde gelen sonraki hücre adezyon ile çalışırken de dahil olmak üzere birkaç adımdan oluşan kuruldu. Yukarıda bahsedilen antikorlar integrinler damar duvarının addressins üzerinde endotel ile etkileşimi engelleyen hücre yüzeyinde etkisiz hale getirin. Bu firma hücre adezyon14,15engel düşünülmektedir. Henüz, biz sadece hücre posta, farklı hücre alt kümeleri için belirli integrinler fark uygunluğunu anlamaya başlıyor. Ayrıca, farklı anti-integrin antikorlar etkisi alt kümeleri hücre ve bir sürü açık soru IBD gut izleme ve anti-yapışma tedaviler alanında önde gelen büyük ölçüde bilinmeyen doz-yanıt ilişkilerdir.
Bu nedenle, bu tür soruları çözmek için uygun araçlar umutsuzca ihtiyaç vardır. Anti-integrin antikorlar etkisi integrin isteyebileğinizi etkileşim defa ağırlıklı olarak bağlama etkinliği/bağlama inhibisyon veya statik yapışma deneyleri16,17 akış sitometresi ile değerlendirilmesi tarafından değerlendirilmiştir ,18,19,20, böylece bariz basitleştirilmesi ve fizyolojik durum sapma ile. Biz son zamanlarda insan addressins hücrelere integrin bağımlı yapışma ve anti-integrin antikorlar altında kesme stres2etkileri çalışmaya dinamik yapışma tahlil kurulmuş. Teknik prensibi daha önce fare hücreleri21,22ile göstermiştir. Burada, bu uyarlanmış ve yukarıda belirtilen çevirim sorulara yönelik olarak geliştirilen, mekanizmaları ile anti-integrin antikorlar vivo içindetedavisinin açılış roman caddeleri için daha iyi anlıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki bölümlerde açıklanan çalışmalar Etik Komitesi Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg onayı göre gerçekleştirilmiş.
1. kılcal hazırlanması
- Dikdörtgen kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle (yaklaşık 0.5 cm) kılcal tüp içine ekleme tarafından alıpkendi için bağlayın. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın.
- İsteyebileğinizi (rekombinant Fc chimera; 5 µg/isteyebileğinizi, Örneğin MAdCAM-1, kaplama arabelleği (150 mM NaCl + 1 mM HEPES) mL) veya p20 pipet kullanarak uygun izotip kontrol çözümü 20 µL ile kılcal kat (sıvı emmek kendisi kılcal damar). Sonra yan Boru Plastik parafin film ile bağlı değil mühür ve en az 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya Sadece kaplama arabellek veya negatif kontrol olarak uygun izotip kontrol ile dolu bir kılcal kullanın.
- Plastik parafin film kılcal uç--dan kaldırmak için en az 1 h 20 µL çözüm (1 x PBS ile %5 BSA) 37 ° C'de engelleme ile bir kağıt havlu ve blok kılcal üzerinde kılcal dışında sıvı emmek izin vererek kaplama boş Plastik parafin film ile kılcal açık tarafına kapatın. Mikroskopi geçmeden önce engelleme çözüm kaldırmaz.
2. hücre izolasyon, tedavi ve Mikroskopi için hazırlık
Not: Aşağıdaki adımları sırasında kuluçka dönemleri için kılcal hazırlık gerekli gerçekleştirilebilir.
- Sonra yerel düzenlemelere göre bilinçli yazılı onayı ile kişi (Örneğin, IBD hastalar ve/veya sağlıklı kontrol) gönüllü kübital damar küme bir aseptik kan koleksiyon 18 mL anticoagulated tam insan kanı toplamak Etik Komitesi.
Not: Bu adımı yalnızca ulusal ve/veya yerel düzenlemelere göre eğitimli ve deneyimli sağlık personeli tarafından gerçekleştirilmelidir. - 50 mL tüp içine kan doldurmak ve 35 mL 1 x PBS ile hacmi oranında seyreltin. O zaman yoğunluk gradient orta 10 mL kan-PBS karışımla altına koymak.
- Yoğunluk gradient Santrifüjü 15dk vasıl 800 x g ve fren ayrı hücreler olmadan 24 ° C için gerçekleştirin.
- Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk gradient orta tabakası (net orta tabaka) tam üstünde beyaz hücre katmanı aspirating tarafından toplamak. PBMCs taze 50 mL tüp içine aktarmak, ilâ 50 mL 1 x PBS ve 300 x g ve 10 ° c de 10 dakika santrifüj ile doldurmak
- Süpernatant atmak, hücre Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend ve daha sonra hücre sayıları, odası sayma Neubauer hücre kullanarak Örneğin, saymak.
- İsteğe bağlı: çalışmaya granülosit yapışma gerçekleştirmek aşağıdaki yordamı. Aksi halde adım 2.7 veya 2.8 ile devam edin.
- Granülosit katman (yoğunluk gradient Santrifüjü Ayrıca eritrositler içeren sonra alttaki katman) toplamak. 40 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. %6 8 mL ekleyin 1 x PBS, Dextran karışımı yavaşça ve hücreleri tortu, oda sıcaklığında 30 dakika izin.
Not: granülosit süspansiyon kalırken eritrositler tüpü dibine batacak. - 30 dk sonra süpernatant toplamak, bir taze 50 mL tüp ve 300 g ve 4 ° c x 6 dk santrifüj içine transfer Süpernatant atmak ve 5 mL %0,2 de ekleyerek kalan eritrositler lyse NaCl GKD2O. Incubate 1 dk için.
- 5 mL % 1,4 ekleyin NaCl GKD2O ve başka bir dakikalığına kuluçkaya. Hipotonik lizis 20 mL 1 x PBS ve santrifüj 300 x g de 6 dk ve 4 ° c için ekleyerek durdurmak
- Hücre Pelet 10 mL 1 x PBS resuspend. O zaman, hücre sayıları odası sayma Neubauer hücre kullanarak sayılır.
- Granülosit katman (yoğunluk gradient Santrifüjü Ayrıca eritrositler içeren sonra alttaki katman) toplamak. 40 mL 1 x PBS hücrelerde resuspend. %6 8 mL ekleyin 1 x PBS, Dextran karışımı yavaşça ve hücreleri tortu, oda sıcaklığında 30 dakika izin.
- İsteğe bağlı: PBMC alt kümeleri yapışma çalışmaya, farklı hücre tipleri veya alt kümelerini arındırmak (Örneğin, CD4+ ve CD8+ T hücreleri veya CD19+ B hücreleri) lastikteki üreticinin protokolüne göre veya floresan-harekete geçirmek kullanma sıralama (FACS) hücre. Aksi halde adım 2.8 ile devam edin.
- Hücre süspansiyon için 300 g ile 10 ° c x 10 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve üreticinin yönergelerine göre (Örneğin, CFSE) boya izleme hücre içeren hücrelerin leke.
- Daha sonra hücreler için 300 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 1 x PBS resuspend, cep telefonu numarasını ve 300 x g, 10 min için tekrar santrifüj belirleyin.
- Süpernatant atın ve lekeli hücre Pelet yapışma arabellek (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) uygun miktarda 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için resuspend. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin.
Not: Bu hücreler artık Mikroskopi için hazırsınız demektir. - İsteğe bağlı: antikorlar veya diğer bileşikler nötralize sitokinler, hücrelerle tedavi. Aksi durumda, adım 3 ile devam edin.
- Adım 2.10 atlarsanız, lekeli hücre Pelet adım 2,9 RPMI orta resuspend (%10 FBS ve % 1 ile penisilin/streptomisin) 1.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için.
- Bu hücre süspansiyon 1 mL 48-şey plaka kadar kuyu pipet olarak çözümlenmesi için koşullar. Her zaman negatif kontrol olarak kaplanmamış bir kılcal damar yoluyla periosteum tedavi edilmezse hücrelerle bir şey ve tedavi edilmeyen hücrelerin pozitif kontrol olarak isteyebileğinizi kaplı kılcal damar yoluyla periosteum ile bir şey hazırlamak.
- Anti-integrin antikorlar ile tedavisi için antikor (Örneğin, 10 µg/mL vedolizumab) uygun miktarda hücre süspansiyon için ekleyin. 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Sitokinler ile tedavi için hücre süspansiyon rekombinant sitokin (Örneğin, 10 ng/mL CXCL10) uygun miktarda ekleyin. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
- Kuluçka sonra birkaç kez p1000 pipet kullanarak hücreleri resuspending tarafından hücre hasat. Hücreler 2 mL tüp içine aktarmak, tekrar 1 mL 1 x PBS ile durulayın ve 2 mL tüp ekleyin. Cep numarasını belirleyin.
Not: Ek önlemler yapisan hücre popülasyonlarının (örneğin, monosit) kuluçka gerektirebilir (Örn., tripsin ile tedavi) plaka hücrelerden ayırmak için.
- Santrifüj hücreler için 300 x g 10 ° C'de 10 dakika Süpernatant atın ve hücre Pelet yapışma arabellek 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için uygun miktarda resuspend. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin. Kemokinler ile pretreating ne zaman MnCl2 hücre süspansiyon eklemeyin. Bu hücreler Mikroskopi için hazırsınız.
Not: tahlil için kullanılan en küçük birim pompa ve boru kullanılan üzerinde bağlıdır. Peristaltik pompa ve boru Malzemeleri tablo, belirtilen kullanarak bu çalışmada 400 µL en küçük bir birim için gerekli oldu. İstenen ve uygulanabilir (hücre tipi ve verim) bağlı olarak, kısa bir süre içinde daha yüksek yapışma ölçmek için süspansiyon hücre konsantrasyonu artırılabilir. - Olası değişiklik: rekabetçi dinamik yapışma tahlil
- Birbirlerine (Örneğin, düzenleyici ve aracılığıyla üretici talimatları adım 2.7 göre manyetik boncuk izolasyon izole efektör T hücreleri) karşılaştırılmak üzere farklı hücre popülasyonlarının ile yukarıda belirtilen adımları uygulayın.
- Her nüfus farklı bir boya (Örneğin, CFSE ve FarRed) mikroskopi sırasında hücre popülasyonlarının ayırt edebilmek için 2.8-2,9 adımda açıklandığı gibi leke.
- Süpernatant atın ve lekeli hücre topakları yapışma arabellek (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) uygun miktarda 1.5 x 106 hücre/mL süspansiyon elde etmek için resuspend.
- Mix (Örneğin, 500 µL düzenleyici T hücreleri) ve 500 µL efektör T hücrelerinin hücre süspansiyonlar eşit miktarda bir final elde etmek için 1.5 x 106 hücre/mL hücre konsantrasyonu karışık. O zaman, 100 mM MnCl2 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için uygun miktarda ekleyin. Böyle süspansiyonlar, yapışma süreci rekabet analizi için farklı hücre popülasyonlarının aynı kılcal damar yoluyla ventriküler tarafından daha sonra kullanılabilir.
3. canlı hücre görüntüleme dinamik yapıştırılması
- Mikroskobunun açın ve uygun filtreyi seçin veya dye(s) (Örneğin, 488 CFSE için nm lazer), uygun bir amaç (Örneğin, 40 X) ve satın alma modunu etkinleştirme zamanlı hızlandırılmış görüntü izleme hücre heyecanlandırmak için lazer.
- Plastik parafin film kılcal uç--dan kaldırmak ve kılcal tüp bir tarafta küçük makasla germe ve dikkatle kılcal (yaklaşık 0.5 cm) ekleme (yaklaşık 5 cm uzunlukta) boru kısa bir parçası bağlantı tüpün içine. Kılcal boru plastik parafin film arasındaki bağlantıyı kapatın.
- Kılcal bir fiksasyon tepsi (Örneğin, bir dikdörtgen boşaltma kılcal uzunluğundan daha ile 6-şey plaka kapak) bağlama ve kılcal odak ve hazır olması sabit kılcal mikroskop, tepsi sahibinin yer Mikroskopi için.
- Alıpkendi peristaltik pompa karşılık gelen çentik yerleştirin ve kılcal için hücre süspansiyon içeren göre örnek tüpüne bağlı değil sonuna yerleştirin. Kılcal diğer tarafında kısa tüp akışı aracılığıyla toplamak için 15 mL tüp içine yerleştirin.
- Boru dolgu izin hücre süspansiyon neredeyse kılcal ulaşıncaya kadar dakikada 500 µL bir debi ile. O zaman 100 µL/dak bir debi ile kılcal doldurun izin ver.
Not: Bir hızlı kılcal dolduruyor hücre süspansiyon kılcal içinde normal bir dağılım sağlar. - Kılcal hücre süspansiyon ile dolu debisi 10 µL/dk ayarlanır.
Not: farklı bir boyut veya farklı peristaltik pompa kılcal kullanıldığında bu akış oranları değişebilir. Bu çalışmada, 10 µL/dk debisi pompa ve kılcal vivo içinde kan akımı taklit etmek için optimize edildi. - Zaman atlama çekim yavaş yavaş kılcal isteyebileğinizi kaplı içinde duvar boyunca her 2 hareket hücre s 3 dk toplam.
Not: Aralıkları ve toplam süre ele alınması gereken hücre tipi ve soru göre değişiklik gösterebilir. - Kılcal atılmadan önce bütün kılcal videoda gösterildiği bölüm temsilcisi olduğundan emin olmak için mikroskop göz parçası ekran. Gerekirse, ikinci bir kayıt olun.
- Boru pompadan ücretsiz ve kalan sıvı hemen 2 mL tüp içine o zaman Kılcal boru fiksasyon tepsisinden çıkarıp koşup ile sonraki kılcal devam bildirin.
4. değerlendirme ve hücre sayımı
- Hızlandırılmış sıra uygun yazılım ile açın ve ilk üç görüntüler ("başlangıç") ve ("son") son üç görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarma.
- Açık ImageJ, üç "Başlayan" görüntüleri dönüştürmek için 32 bit ('görüntü | Türü | 32 bit') ve birleştirme resimler (' resim | Renk | Kanalları birleştirme; kırmızı, yeşil ve mavi renkleri atamak için farklı resimler). Bileşik görüntü RGB dönüştürmek (' resim | Type-RGB') ve TIFF dosyası olarak kaydedin. "Son" görüntüleri ile yineleyin.
Not: farklı renklerle lekeli hücrelerle rekabetçi dinamik yapışma deneyleri içinde farklı hücre popülasyonlarının yapışma ayrı ayrı analiz etmek için görüntülerin kanalları bölündüğünü. - Beyaz hücreleri saymak "Başlangıç" ve "Son" bileşik içinde görünür ve "Başlangıç" "sonunda" beyaz hücrelerden beyaz hücre sayısı çıkarın.
Not: yeni kalarak sayısını 3 dk zaman aralığında hücreleri farkı temsil eder. Bileşik görüntüde, taşınan hücreleri önceki ve sonraki çerçeve içinde başka bir yere içinde Yerelleştir beri ilgili çerçeveye atamış belirli renk görünür. Yapışık, hücreler için aynı nokta örtüşme beyaz kırmızı, yeşil ve mavi sinyalleri. - Daha iyi sonuçlar görmek için hızlandırılmış dizilerinden bir video ImageJ kullanarak Örneğin, derleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntemi sunulan bu el yazması amacı insan hücre adezyonu endotel duvara vivo içinde süreci yakın olarak işlevsel olarak benzetimini yapmak için hücre adezyon ve müdahaleci antikorların rol değerlendirmek. Bu nedenle, ultrathin kılcal addressins ile kaplı ve perfüzyon pompa kullanarak faiz fluorescently etiketli insan hücreleri ile derin. Canlı hücre addressins için insan hücrelerinin yapışma Imaging kullanarak gerçek zamanlı (Şekil 1) görülebilir.
Bu yöntem özellikle IBD Anti-yapışma tedaviler mekanizmaları aydınlatmak uygundur. Üç addressins biri olmadığı durumlarda perfüzyon ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 ve insan PBMCs chimera izotip Fc ile kaplı kapiller Şekil 2Agösterildiği gibi işaretli yapışma için yol açar. Buna ek olarak, yapışma izotip kaplı kılcal damarlar için en az düzeydedir. İntegrin isteyebileğinizi etkileşimleri nötralize antikorlar genellikle kullanan inhibisyonu izotip kontrol antikorlar (dinlerinden gösterildiği Şekil 2Bhavuza alınmış, eklendiğinde, bu dinamik yapışma, belirgin bir düşüş yol açar nicel veriler Şekil 2C).
Benzer şekilde, kemokinler integrin benzeşme modülasyon üzerinde etkisini bu sistemde böyle peptidler içinde vitroile ön kuluçka tarafından soruşturma olması. Şekil 3, CD4 tedavisi temsilcisi verilerde gösterildiği gibi+ MAdCAM-1 tedavi edilmezse insan hücrelere kıyasla yüksek yapışma için insan T hücreleri ile CCL2 ya da CXCL10 yol açar.
Şekil 1: iş akışı şematik Gösterim. İsteyebileğinizi, hazırlık ultrathin kılcal kaplı ve fluorescently etiketli insan hücreleri (solda) ile bir peristaltik pompa (orta) ve hızlandırılmış mikroskobu (sağda) kullanarak kılcal damar hücreleri perfüzyon izledi. Başvuru23izinle değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: dinamik yapışma insan periferik kan mononükleer hücrelere (PBMCs) denetimi bağışçılardan farklı addressins. (A)yeni kalarak sayısı PBMCs belirli addressins veya Fc izotip kontrol ile kaplı kılcal damarlar için (n = 6). (B) temsilcisi görüntüleri ICAM-1 kaplı kılcal damarlar tedavi edilmemiş (NT) PBMCs veya hücreleri ile derin dinamik yapıştırılması 10 µg/mL anti-CD18 antikor veya 10 µg/mL IgG izotip kontrol ile inkübe. Başlangıç: 3 dk dizisinin ilk üç görüntüleri birleştirilir; Bitiş: 3 dk dizi birleştirilmiş son üç görüntüleri; yapışan hücreleri olarak adı geçen beyaz. Fark (Yani, yeni yapışan hücreleri) yanı sıra numaraları gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. (C) = (her 10 µg/mL konsantrasyonu kullanılan) anti-integrin antikorlar dinamik yapışma üzerinde etkisi. Sol: Numara yeni ICAM-1 ile kaplı ve periosteum ile kılcal damarlar için yapışan hücreleri tedavi edilmezse, anti-CD18 tedavi veya IgG izotip hücreleri denetimi değerlendirilmesi; Orta: Numara yeni yapışan hücreleri ile derin ve VCAM-1 ile kaplı kılcal damarlar için tedavi edilmezse, natalizumab tedavi veya IgG izotip hücreleri denetimi değerlendirilmesi; Sağ: Numara yeni yapışan hücreleri ile derin ve MAdCAM-1 ile kaplı kılcal damarlar için tedavi edilmezse, vedolizumab tedavi veya IgG izotip kontrol tedavi hücreleri (n = 5 – 6). Çubuklar anlamına gelir standart hata ortalamaya (SEM) ile gösterir. İstatistiksel test gerçekleştirilen ile tek yönlü ANOVA Newman-Keuls birden fazla karşılaştırma testi ile takip (* p < 0,05; ** p < 0,01). Başvuru23izinle değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Kemokin aracılı dinamik yapışma insan CD4+ T hücre MAdCAM-1'e. Bir temsilcisi dinamik yapışma görüntülerden tahlil MAdCAM-1-kaplı kılcal damarlar ile tedavi edilmemiş (NT) CD4 periosteum içinde+ T hücre veya hücreleri inkübe 10 ng/mL rhCXCL10 veya 100 ng/mL rhCCL2. Başlangıç: 3 dk dizisinin ilk üç görüntüleri birleştirilir; Bitiş: 3 dk dizi birleştirilmiş son üç görüntüleri; yapışan hücreleri olarak adı geçen beyaz. Fark (Yani, yeni yapışan hücreleri) yanı sıra numaraları gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 µm. Preincubation ile muhtemelen integrin benzeşme modülasyon nedeniyle artan dinamik yapışma kemokinler yol açar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
SupplementaryVideos: film üç dakika ile fluorescently etiketli PBMCs derin MAdCAM-1 kaplı kılcal üzerinden görüntü sıralarını. (A)kılcal tedavi edilmezse hücrelerle periosteum. (B) kılcal damar hücreleri ile periosteum 10 µg/mL vedolizumab ile tedavi. (C) kılcal damar hücreleri ile periosteum 10 µg/mL insan IgG izotip kontrol ile tedavi. Hücre alt akış yukarı, yeni yapışan hücreleri Beyaz oklarla belirtilmiştir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki Protokolü dinamik adezyonu endotel ligandlar için insan bağışıklık hücrelerinin çalışma için yararlı bir yöntem açıklanır. Kaplamalı ligandlar, periosteum hücre tipleri veya alt kümeleri, kuluçka ek uyaranlara veya farklı nötralize antikorlar ile varyasyon ile neredeyse var sınırsız potansiyel uygulamalar. Bu nedenle, bu tür dinamik yapışma deneyleri temel araştırma hem de geliştirmek ve klinik tedavisi ilaçlarla yapışma işlemine engel optimize etmek için yardımcı olabilir translasyonel sorgular her iki temel soruları cevaplamak yararlı olabilir.
Belgili tanımlık yarar klinik Anti-yapışma tedavilerin etkileri araştırmaya testin son zamanlarda göstermiştir. Ayrıca, farklı türleri ve integrinler miktarda ifade farklı hücre popülasyonlarının tahlil23geçerliliğini destekleyen ilgili addressins için dinamik yapıştırılması tutarlı düzeyleri göster.
Genel olarak, protokolün tamamlanmasından yaklaşık 6 saatlik çalışma ihtiyacı ve ara teknik sorunlar sunar. Kılcal kaplama başladıktan sonra kritik bir sorunu dehidratasyon kaçınmaktır. Bu kuluçka adımları sırasında doğru sızdırmazlık ve kapiller dikkatli işleme ne zaman çözümleri alışverişi gerektirir. Buna ek olarak, bazı dikkatli perfüzyon işleminin başlatılmasını gerektirir. Tüp ölü hacmi nedeniyle, tüm boru son perfüzyon akış hızı ile doldurmak için mümkün değildir. Öte yandan, akış hızı yüksek hız ile kılcal kızarma sonra değişen statik yapışma dinamik yapışma açısından geçerlilik sınırlama olanağı önde gelen akış kesinti riskini üzerine kuruludur. Bu nedenle, zamanında geçiş yapılmasına son akış hızı önemlidir. Son akış hızı bağlı olarak kullanılan pompa, boru ve kılcal boyutu seçilmelidir. İnsan kan akımı yüksek endotel venüller 0,1 5 mümkün olduğunca yakından, ses akışı olarak taklit etmek için24,25mm/sn önerilir.
Tahlil zorluk belirgin değişiklikler uygulandığında artabilir. Örneğin, belirli T hücre alt kümeleri analizini kutuplaşma veya arıtma stratejileri26talep gerektirebilir. Ligandlar kılcal veya (ön) tedavi iç birleşimi kat gerekli olabilir beri Ayrıca, deneme içine hayvan zinciri, haddeleme ve hücre harekete geçirmek12 adımları takip dahil olmak üzere daha fazla zorluk artacak selektin bağımlı haddeleme ve kemokin indüklenen hücre harekete geçirmek ve integrin benzeşme modülasyon27için hesap için hücre nüfusuyla kemoterapi veya sitokinler periosteum. Ancak, bunlar olabilir özellikle işlevsel olarak farklı molekül böyle karmaşık bir etkileşim ile insan hücreleri ve ligandlar yönelik olarak sunulan tekniği sağlar gibi sorular gelecekteki araştırmalar için özellikle ilginç. Yukarıda belirtildiği gibi birçok farklı lekeli hücre popülasyonlarının aynı kapiller rekabetçi çözümlenirken dinamik yapışma başka bir karmaşıklık düzeyini ekleyebilirsiniz. Ayrıca, aynı zamanda endotel hücreleri rekombinant ligandlar28yerine sıvı sistemlerde kullanılabilir gösterilmiştir.
Bu işlev bir tahlil olmasına rağmen teknik yer molekülleri vitroseçili bir dizi karmaşık vivo içinde ağlara azalma ile sınırlıdır. Bu bilinmeyen veya beklenmedik ek faktörlerin etkileri gözden kaçan veya değil yeterince kabul olduğunu anlamına gelir. Etik kaygılar kez mekanik vivo içinde soruşturma29korusun ancak, sık sık bir sorun insan araştırma, olmasıdır.
Birlikte ele alındığında, bu protokol inflamatuar barsak hastalıkları integrin bağımlı dinamik yapışma ve anti-integrin terapiler analizi için işlevsel bir tahlil sunar. Temel ilke ise oldukça düz ileri ve gerçekleştirmek çok zor değil bu süslenmiş olabilir ve birkaç ilgili değişiklik ve IBD Anti-yapışma terapi ile ilgili translasyonel sorulara cevap potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F.N., Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda ve Boehringer için bir danışman olarak hizmet vermiştir. M.F.N. ve S.Z. Takeda ve Roche araştırma desteği aldı.
Acknowledgments
Araştırma CN, IA, MFN ve SZ klinik araştırma (IZKF) ve Erlangen-Nürnberg Üniversitesi, başka Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Alman Crohn ELAN programı için disiplinlerarası Center tarafından desteklendi ve Kolit Vakfı (DCCV), klinik araştırma grubu CEDER, Alman Araştırma Konseyi (DFG), DFG konu programın Microbiota, ortaya çıkan alan girişimi ve DFG işbirlikçi araştırma merkezleri 643, 796 ve 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
