Summary
在这里, 我们提出了一个新的方法, 以准确地测量体温差异的被动系统过敏 (PSA) 和食品过敏小鼠模型使用红外线温度计。此过程在以前的 PSA 结果中得到了准确的复制。
Abstract
小鼠体温测量对研究过敏和过敏性症状至关重要。直肠探针为温度读数是普遍的, 并且他们被证明是准确和可贵的在这方面。然而, 这种温度测量方法要求小鼠进行麻醉, 以便插入探针而不损伤动物。这就限制了同时观察鼠标的其他表型的能力。为了研究其他表型, 同时测量温度, 直肠探头是不理想的, 另一种方法是需要的。在这里, 我们引入了一种无创测温方法, 全国加工业副产品了对小鼠麻醉的要求, 同时保持了直肠探头在体温测量中的同等可靠性。我们使用红外线温度计, 在2和150毫米的范围内检测出体表温度。这种体温测量方法成功地在小鼠被动系统过敏实验中可靠地复制了温度变化趋势。我们表明, 体表温度约2.0 °c 低于直肠探针测量, 但温度下降的程度遵循相同的趋势。此外, 我们用同样的方法观察在食物过敏模型中的小鼠, 同时评估温度和活动水平。
Introduction
体温测量是监测1、2动物模型过敏性症状影响的重要组成部分。传统上用直肠探针温度计测量了3、4小鼠的温度差异。通过这些测量, 调查人员可以可靠地描述变量之间的温度差异;然而, 这种方法是一个耗时的过程, 导致小鼠的苦恼, 这可以增加人体核心温度。直肠探查也可引起粘膜撕裂和感染3。此外, 应麻醉小鼠, 以人道地插入直肠探针测量温度3。这是一个缓慢的过程, 它禁止在短时间内测量连续温度。此外, 在这段时间内, 老鼠的活动表型不能被观察到, 直到麻醉完全磨损, 这是另一个耗时的过程。最近, 其他可靠的方法来测量体温已经使用皮下植入被动红外转发器标签或无线电发射机, 包括温度传感器3,5,6。虽然这些方法被一些研究人员接受为理想的实践, 但由于在皮肤或身体的另一部分的温度传感器的外科植入, 所以由于最初的成本高昂和对老鼠的苦恼, 这些办法没有得到广泛的应用。
为了证明温度差异是一个准确的反映症状在疾病模型1,2, 小鼠必须清醒的温度测量, 并能够返回到他们的正常表型活动在测量前后立即。为此目的, 我们寻求一种可以实现这一目标的方法。
我们的目标是准确和廉价的测量鼠标体温, 不需要麻醉和不限制活动, 使观察的行为表型期间和之后的温度测量。为了实现这一目标, 显然需要一种比标准直肠温度探针更少侵入的技术。红外线温度计已经在临床上使用了数十年, 特别是在儿科, 以获得准确的体温读数。它一直是一种替代方法, 使临床医生能够迅速和准确地获得温度测量的婴儿和挑剔的儿童积极流动。我们在小鼠中实施了同样的技术, 并开发了一种成功的方法来获得温度而无需麻醉。重要的是, 我们表明, 这种方法能够复制已建立良好的被动系统性过敏反应的温度变化的结果, 同时也能够观察的活动, 鼠标在整个测量。此外, 我们使用相同的方法来评估食物过敏小鼠的体温, 同时调查其他症状, 以证明体温确实是准确反映的活动水平和整体表型的鼠标。
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Protocol
所有动物实验均经 la 的过敏和免疫学研究所动物护理和使用委员会批准。
1. 麻醉期间小鼠体温测量
- 将鼠标放在麻醉感应箱中。麻醉使用1升/分钟氧与5% 异氟醚的流动。
注: 麻醉在鼠标停止自愿运动并在三十年代不动的情况下被证实. 或者, 监测呼吸率, 一旦老鼠呼吸1呼吸每2或更长, 麻醉被证实。 - 用食指和拇指把老鼠抱在脖子的颈背上, 用小指握住尾巴, 以暴露下腹部。
- 将红外线温度计传感器放在下腹部下方, 同时按住鼠标, 使其身体与地面平行。
注意: 温度计的外平表面 (不是传感器的表面) 应该大约2–5毫米远离腹部的表面。这复制的结果的温度测量, 而小鼠没有麻醉 (在2节中描述)。确定腹部靶点是很重要的。瞄准两个上部的奶头可以取得一致的结果。 - 按住扳机来测量温度。确保鼠标和温度计保持稳定。
2. 无麻醉鼠标体温测量
- 把鼠标从尾巴的中间捡起来。
-
露出老鼠的腹部。
- 允许鼠标保持在一个直边的表面, 如打开的笼子的嘴唇或笼顶与它的前爪。
注意: 这使得鼠标伸展上身, 露出腹部。 - 或者, 允许鼠标保持在温度计的上直边, 并使鼠标坐在温度计的外层表面上, 它的腹部刚好超过红外线传感器。
注: 任何时候后爪在温度计表面休息, 确保脚不妨碍传感器从腹部表面。带有足部梗阻的温度计可以测量低于腹部的温度。
- 允许鼠标保持在一个直边的表面, 如打开的笼子的嘴唇或笼顶与它的前爪。
- 按住扳机来测量温度。
注意: 老鼠倾向于移动;在小鼠相对较少的移动时采取温度测量方法, 在测量身体的同一位置时要注意。
3. 被动全身性过敏7
-
0天: 免疫球蛋白 E (IgE) 的敏感性。
- 准备200µL (每只老鼠) 的抗 dinitrophenyl (硝基) IgE 的浓度为100µg/毫升在 PBS。
- 腹腔注射200µL 的抗 dinitrophenyl () IgE, 仅在步骤3.1.1 或 pbs 中制备 (pbs 仅为负控制)。用26克针注射。执行注射只是侧向中线, 大约在两个最下位的奶头之间。
-
1天: 诱发过敏反应与再蛋白蛋白。
- 准备100µL (每只老鼠), 在10毫克/毫升浓度为0.9% 氯化钠。
- 麻醉步骤1.1 中所述的老鼠。
- 使用步骤1中描述的技术测量体温。
- 静脉注射注射100µL, 在步骤3.2.1 中制备。用30克针注射。对 retroorbital 静脉窦进行注射。将针插入眼睛内侧的浅角, 瞄准眼睛后面。
- 注射后, 把老鼠放在单独的笼子里。确保小鼠从麻醉中恢复。观察他们觉醒并成为主动移动。
- 使用红外线温度计测量体温, 每隔10分钟观察其活动70分钟。
4. 小鼠食品过敏模型8,9
注意: 示意图如图 2所示。
-
0天: 使小鼠对卵/明矾敏感。
- 在 PBS 中准备100µL (每只老鼠) 卵 (0.5 毫克/毫升) 和明矾 (10 毫克/毫升)。漩涡在低设置为30分钟。
- 麻醉步骤1.1 中所述的老鼠。
- 使用26克针, 腹腔注射每只老鼠与100µL 的卵/明矾混合物准备在步骤4.1.1。
注: 在每次注射前, 将卵/明矾混合物再次旋转, 以确保匀质混合。有关注射站的详细信息, 请参阅步骤3.1.3。 - 注射后, 把老鼠放回原来的笼子里。确保小鼠从麻醉中恢复。观察他们觉醒并成为主动移动。
-
14天: 对卵子/明矾进行第二次敏化。
- 重复步骤4.1.1、4.1.2 和4.1.3。
-
28-46 天: 每隔一天就用卵子挑战老鼠。
- 准备100µL (每只老鼠) 的卵在250毫克/毫升浓度在 PBS。
注: 混合物应用手轻轻摇动, 而不是用旋涡来最小化气泡形成。- 如果使用食品过敏抑制剂, 准备抑制剂9。准备100µL (每只老鼠) 抑制剂在1毫克/毫升浓度在 PBS。这可以为每只老鼠提供100µg 抑制剂。
注: 每只老鼠不超过100µL 抑制剂, 因为老鼠只能处理200µL 的总饲量在一个挑战日。100µL 对于卵子挑战也是必要的, 100 µL 是抑制剂使用的最大推荐体积。
- 如果使用食品过敏抑制剂, 准备抑制剂9。准备100µL (每只老鼠) 抑制剂在1毫克/毫升浓度在 PBS。这可以为每只老鼠提供100µg 抑制剂。
- 麻醉步骤1.1 中所述的老鼠。
- 口服饲每只老鼠100µL 卵溶液 (25 毫克卵100µL 的 PBS gavaged 每只老鼠), 这是在步骤4.3.1 准备。
- 如果使用抑制剂, 利用以下步骤中描述的相同技术饲的抑制剂 (或 PBS 控制) 准备在步骤 4.3.1.1 30 分钟前的卵子挑战。30分钟后, 继续下一步。
- 使用1毫升注射器的饲针。把100µL 的卵放入注射器中。
- 将针头插入口中;然后, 指针指向左侧或右侧的喉咙, 轻轻地滑动针通过食道。注射100µL 卵。
注: 为确保针头不在气管内, 在注射卵子前观察主动呼吸。如果进入气管而不是食道, 针的插入也会受到早期的抵制。
- 把老鼠放进各自的笼子里。为便于观察大便质量, 使用无寝具的网箱。
- 确保从麻醉中恢复。观察小鼠苏醒并自发移动。
- 使用2节中描述的技术, 测量小鼠在 timepoints 10、20、40和60分钟内的体温。
- 准备100µL (每只老鼠) 的卵在250毫克/毫升浓度在 PBS。
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Representative Results
无源性全身性过敏反应: iv. 型注射, 10 周 BALB 小鼠被麻醉。在注射之前, 我们测量了他们的体温 (视频 1), 如步骤1所述。图 1显示了静脉注射后两个种群的温度趋势。IgE 敏化鼠的最大温度降为3.0 摄氏度, 20 分钟, 而 PBS 控制鼠标的最大下降1.1 °c 在20分钟7。此外, 在整个过程中, 根据每个鼠标的移动性评估活动分数。老鼠首先观察, 没有任何鼓动。然后, 通过将计算器的手引入笼子并与鼠标进行软接触, 观察到了它们的躁动。根据它们的反应, 对小鼠进行评估, 并以1到3的比例评分。分数为1表示鼠标是静止的或最小的移动与和不鼓动;分数为2表示鼠标是静止不动, 移动与躁动, 而不进行快速回避运动;分数为3表示鼠标是移动或静止不动, 移动与躁动, 并作出快速规避动作。视频 2和3提供了两组示例, 其中举例说明了温度测量方法以及相应的活动水平测量。红外线温度计的使用, 不需要麻醉就可以进行温度测量, 这反过来又允许在温度测量之前、期间和之后进行行为表型评估;相比之下, 传统的直肠探针需要麻醉, 因此在温度测量的几分钟内排除任何行为评估。
食物过敏小鼠模型8: 鼠标模型的示意图如图 2所示。在敏化时, 小鼠是8至10周龄的雌性 BALB 鼠。在每次对体温和活动的挑战后, 老鼠观察到10、20、40和60分钟。一个代表性的结果如图 3所示的温度变化在挑战7。小鼠最大温度下降10分钟;因此, 10 分钟的温度是用来与体温在10分钟的活动水平 (以评分的基础上所描述的标准)。活动评分和气温下降呈统计学意义的相关性 (图 4)。如被动全身过敏反应部分所述, 由于缺乏麻醉, 使用了红外测温仪进行行为观察。相比之下, 直肠探头会在温度测量时阻止任何行为观察或评估。任何时候, 温度和其他活动表型必须记录, 这是必要的, 使用不需要麻醉的温度测量系统。
图 1: BALB 小鼠被动全身性过敏反应.在0天, 两只老鼠被注射了抗再利用的 IgE, 然后 iv 在1天注射了生理盐水或二元蛋白。在注射前用红外线温度计测量体温, 注射后每10分钟70分钟.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 食品过敏小鼠模型示意图.在0天, BALB 小鼠对卵和明矾有敏感的 ip, 14 天又一次。在每项挑战之前的28天, 30 分钟, 小鼠口服 gavaged 与 PBS 控制或食物过敏抑制剂 (HRF-2CArecombinant 组胺释放因子与它的两个半胱氨酸交换与 alanines)9。小鼠被挑战为25毫克卵的免疫球蛋白。每隔一天就对9项挑战进行挑战。实验发现小鼠体温测量和活动评分为10、20、40和60分钟后的挑战。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: BALB 鼠食品过敏模型.通过红外测温仪对第七卵挑战后的温度变化进行监测。典型的结果显示从至少四独立实验 (**, p < 0.01 在 PBS 和2CA 治疗之间由学生的 t 测试; ns: 不重要)。误差线 = SEM.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 在食品过敏实验中, 活性与温度的相关性为10分钟.结果反映了从4组独立实验中所得到的测量值。请单击此处查看此图的较大版本.
视频 1: 在小鼠被麻醉时体温测量.老鼠体温测量可以采取或不麻醉。对于一致的测量, 必须始终瞄准在同一身体位置的温度计。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
视频 2: 活动水平在40分钟后, 即白蛋白 iv 注射液.小鼠最初观察时不激动, 然后以鼓动。根据它们的反应, 对小鼠进行了评估, 并在1到3的活动范围内得分。左侧的鼠标 (反扩散敏化鼠标) 的分数为 1, 而右侧的鼠标 (PBS 控制鼠标) 的分数为3。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
视频 3: 体温测量在40分钟后, 即白蛋白 iv 注射液.这一数字表明, 红外温度计准确和无创性测量体温没有麻醉的能力。此外,视频 2中显示的活动分数反映了该视频中测量的温度降的程度。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
视频 4: 传感器的后爪阻塞温度读数误差.这段视频展示了在温度和没有脚在传感器周长之间的差异。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
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Discussion
所述的协议是建立在不使用麻醉的情况下测量体温的目标。尽管它相对容易获得的温度读数, 有几个警告, 以适应这种技术, 除了更明显的影响, 如处理压力和不同的环境温度。
首先, 为了在整个实验中保持一致的温度读数, 测量温度的位置必须使用解剖标志来确定, 而研究者必须能够复制所述身体的测量。位置。通过在直边表面上保护鼠标的前爪, 如笼子的唇或温度计的边缘, 腹部容易暴露在温度计的红外线传感器上。通常, 腹部是一个大的表面积, 允许一些灵活性的一致结果。此外, 腹部有稀疏的头发比鼠背表面, 因此允许更准确的体温读数。
其次, 在温度测量时, 后爪必须始终被监测。当温度计靠近腹部时, 老鼠往往会把脚放在温度计上。当脚或脚趾位于传感器的圆周内时, 温度读数可能低于腹部, 如视频 4所示。这是很重要的, 让鼠标跨在传感器两侧的脚, 同时保持圆周没有任何身体部位或物体以外的腹部表面。
第三, 在测量时, 小鼠的腹部表面不能湿润。潮湿的表面会改变温度计准确测量温度的能力;通常, 测量的温度将低于实际值。这一问题可以避免, 通过保持在笼子里的小鼠与新鲜的床上用品在观察期间的过程中。这也确保了每次测量温度时, 腹部表面的干燥都是标准化的。
最后, 红外线温度计比直肠探头有更大的误差幅度, 尽管只是稍有轻微。用直肠探头测量的误差幅度为0.1 摄氏度, 而红外线温度计则为0.2 摄氏度。与 PSA 实验中各种群温度下降的总体差异相比, 这一误差幅度极小。更重要的是, 一个项目需要一个微妙的0.1 °c 的差异可能也预见到其他误差的差距, 无论是否使用红外线温度计或直肠探头。在本议定书的编写过程中, 还表明, 用植入温度转发器测量的人体核心温度与红外线温度计测量的体表温度之间有很好的相关性, 在脂多糖诱发的体温过低6。
过去8、10没有观察到食品过敏模型中的温度下降。评价标准以前是通过腹泻评分确定表型的严重性;然而, 这种方法缺乏客观性。通过使用红外线温度计, 我们可以发现细微的温度下降。然后, 我们能够将这些与活动水平相关联, 因为老鼠在手术过程中没有被麻醉。这种方法允许快速, 准确, 易于使用, 无创, 廉价的方法来测量小鼠体温, 同时能够观察其他表型, 否则将错过, 如果小鼠被麻醉的直肠探针测量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
川上刚实验室的研究得到了 NIH 赠款的支持: R01 AR064418-01A1、R01 HL124283-01、R21 AI 115534-01 和 R41AI124734-01。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-contact infrared thermometer | SinoPie | DT-8861 | |
| Anti-dinitrophenyl (DNP) IgE | Sigma Aldrich | D8406-.2MG | |
| PrecisionGlide 30 G needle | BD | 305128 | |
| PrecisionGlide 26 G needle | BD | 305111 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| Dinitrophenyl - human serum albumin | Biosearch Technologies | D-5059-10 | |
| Ovalbumin from chicken egg white | Sigma Aldrich | A5503-50G | |
| Imject Alum | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| Animal Feeding Needles, disposable | Fisher Scientific | 01-208-87 |
References
- Finkelman, F. D. Anaphylaxis: lessons from mouse models. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 120 (3), Quiz 516-507 506-515 (2007).
- Lee, J. K., Vadas, P. Anaphylaxis: mechanisms and management. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 41 (7), 923-938 (2011).
- Newsom, D. M., Bolgos, G. L., Colby, L., Nemzek, J. A. Comparison of body surface temperature measurement and conventional methods for measuring temperature in the mouse. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (5), 13-18 (2004).
- Wong, J. P., Saravolac, E. G., Clement, J. G., Nagata, L. P. Development of a murine hypothermia model for study of respiratory tract influenza virus infection. Laboratory Animal Science. 47 (2), 143-147 (1997).
- Quimby, J. M., Olea-Popelka, F., Lappin, M. R. Comparison of digital rectal and microchip transponder thermometry in cats. Journal of American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 402-404 (2009).
- Mei, J., Riedel, N., Grittner, U., Endres, M., Banneke, S., Emmrich, J. V. Body temperature measurement in mice during acute illness: implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8 (1), 3526 (2018).
- Doyle, E., Trosien, J., Metz, M. Protocols for the induction and evaluation of systemic anaphylaxis in mice. Methods in Molecular Biology. 1032, 133-138 (2013).
- Brandt, E. B., et al. Mast cells are required for experimental oral allergen-induced diarrhea. The Journal of Clinical Investigations. 112 (11), 1666-1677 (2003).
- Ando, T., et al. Histamine-releasing factor enhances food allergy. The Journal of Clinical Investigations. 127 (12), 4541-4553 (2017).
- Brandt, E. B., et al. Targeting IL-4/IL-13 signaling to alleviate oral allergen-induced diarrhea. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 53-58 (2009).
