Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

एक में इन विट्रो मॉडल एक समानांतर प्लेट छिड़काव प्रणाली के जीवाणु पालन के लिए भ्रष्टाचार के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

हम एक में इन विट्रो प्रवाह चैंबर मॉडल है, जो भ्रष्टाचार के ऊतकों को बैक्टीरियल पालन की जांच की अनुमति देता में डिजाइन घर का वर्णन ।

Abstract

विभिन्न वाल्वों नाली और स्टेंट-घुड़सवार वाल्व जन्मजात हृदय रोग के साथ रोगियों में सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ (RVOT) वाल्व प्रतिस्थापन के लिए उपयोग किया जाता है । जब कृत्रिम सामग्री का उपयोग हालांकि, इन भ्रष्टाचार जीवाणु संक्रमण और विभिंन मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं ।

बैक्टीरिया और मेजबान कारकों है कि सूक्ष्मजीवों के अंतर्वाहिकी पालन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा की पहचान के लिए बेहतर संक्रमण की शुरुआत के pathophysiology ऐसे संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ (IE) के रूप में समझने के लिए और निवारक विकसित करने के लिए महत्व का है रणनीतियों. इसलिए, सक्षम मॉडल के विकास के लिए शारीरिक कतरनी शर्तों के तहत बैक्टीरियल आसंजन की जांच के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक नए के उपयोग का वर्णन इन विट्रो छिड़काव चैंबर में डिजाइन समानांतर प्लेटों के आधार पर कि ऐसे उजागर extracellular मैट्रिक्स, endothelial कोशिकाओं और निष्क्रिय क्षेत्रों के रूप में भ्रष्टाचार के ऊतकों के विभिंन घटकों के जीवाणु पालन के अध्ययन की अनुमति देता है . इस विधि के साथ संयुक्त कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) गिनती प्रवाह के तहत बैक्टीरियल आसंजन के प्रति भ्रष्टाचार सामग्री की प्रवृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त है । इसके अलावा, प्रवाह चैंबर प्रणाली कतरनी शर्तों के तहत बैक्टीरियल आसंजन में रक्त घटकों की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हम का प्रदर्शन किया है कि ऊतक के स्रोत, उनकी सतह आकृति विज्ञान और जीवाणु प्रजातियों विशिष्टता हमारे में घर बनाया इन विट्रो छिड़काव मॉडल का उपयोग करके भ्रष्टाचार के ऊतकों के लिए बैक्टीरियल पालन में प्रमुख कारकों का निर्धारण नहीं कर रहे हैं ।

Introduction

Staphylococcus aureus (एस aureus) डाह रणनीतियों की एक किस्म को रोजगार के लिए मेजबान प्रतिरक्षा रक्षा प्रणाली बस्तियां जैविक या गैर जैविक मानव संचलन में प्रत्यारोपित सतहों दरकिनार, जो गंभीर intravascular संक्रमण की ओर जाता है जैसे पूति और यानी1,2,3,4,5. IE एक महत्वपूर्ण कृत्रिम हृदय वाल्व के आरोपण के बाद रोगियों में जुड़े जटिलता उपचार जबकि व्यक्तिगत IEare की शुरुआत करने के लिए योगदान कारक अभी तक पूरी तरह से6,7समझ नहीं रहता है । प्रवाह की स्थिति के तहत, बैक्टीरिया कतरनी बलों, जो वे क्रम में जहाज की दीवार8का पालन करने के लिए दूर करने की जरूरत है मुठभेड़ । मॉडल है, जो बैक्टीरिया और कृत्रिम वाल्व ऊतक या प्रवाह के तहत endothelium के बीच एक साथ खेलने का अध्ययन करने की अनुमति, ब्याज के रूप में वे vivo स्थिति में और अधिक प्रतिबिंबित ।

कई विशिष्ट तंत्र endothelial कोशिकाओं को बैक्टीरियल पालन (ईसीएस) और उजागर subendothelial मैट्रिक्स को सुविधाजनक बनाने (ECM) ऊतक औपनिवेशीकरण और वनस्पति की परिपक्वता के लिए अग्रणी, IE9में आवश्यक जल्दी कदम जा रहा है । विभिंन स्ताफ्य्लोकोच्कल सतह प्रोटीन या MSCRAMMs (माइक्रोबियल सतह घटक चिपकने वाला मैट्रिक्स अणुओं को पहचानने) आसंजन के मध्यस्थों के रूप में वर्णित किया गया है कोशिकाओं की मेजबानी और fibronectin जैसे अणुओं के साथ बातचीत से प्रोटीन ECM करने के लिए, फाइब्रिनोजेन, कोलेजन और वॉन Willebrand फैक्टर (VWF)8,10,11। हालांकि, कुछ डाह कारकों के अंतर आणविक तह को ध्यान में रखते हुए, ज्यादातर स्थैतिक स्थितियों में अध्ययन किया, इन बातचीत के कई अंतर्वाहिकी संक्रमण में रक्त परिसंचारी में अलग प्रासंगिकता हो सकता है ।

इसलिए, हम एक इन इन विट्रो समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर मॉडल है, जो ECM के विभिंन घटकों और ईसीएस ऊतक RVOT स्थिति में प्रत्यारोपित भ्रष्टाचार के संदर्भ में बैक्टीरियल पालन के आकलन की अनुमति देता में तैयार घर में मौजूद । इस काम में वर्णित विधि के समग्र प्रयोजन के लिए बैक्टीरिया और अंतर्निहित अंतर्वाहिकी ऊतकों के बीच बातचीत के तंत्र का अध्ययन करने के लिए है प्रवाह की स्थिति है, जो बारीकी से कर रहे हैं से संबंधित में vivo वातावरण के रूप में रक्त रोगजनकों एस. aureus. इस उपंयास दृष्टिकोण भ्रष्टाचार ऊतक की संवेदनशीलता पर ध्यान केंद्रित करने के जीवाणु पालन के लिए IE के विकास के लिए संभावित जोखिम कारकों की पहचान सतहों ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. के लिए भ्रष्टाचार के ऊतकों की तैयारी इन विट्रो अध्ययन

नोट: तीन प्रकार के ऊतकों का उपयोग किया गया: गोजातीय पेरीकार्डियम पैच (बीपी), Cryopreserved Homograft (CH) और गोजातीय Jugular नस भ्रष्टाचार (BJV) । BJV नाली और CH के मामले में (ऊतक यूरोपीय Homograft बैंक द्वारा संसाधित (EHB) और तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत करने से पहले का उपयोग करें), दोनों दीवार और वाल्वुलर पुस्तिकाओं का इस्तेमाल किया गया । बीपी पैच और BJV नाली निर्माताओं से खरीदे गए थे । उपयोग करने से पहले, गल EHB निर्देश12निंनलिखित दर्पण ।

  1. उपयोग करने से पहले ०.९% NaCl के साथ सभी ऊतकों कुल्ला ।
  2. परिपत्र ऊतक टुकड़े (व्यास में 10 मिमी) में कटौती करने के लिए एक डिस्पोजेबल त्वचा बायोप्सी पंच का उपयोग ऊतक बायोप्सी तैयार करें ।
  3. प्रयोज्य बाँझ नश्तर का उपयोग कर एक ही ऊंचाई पर सभी ऊतक पैच कट.
  4. glutaraldehyde (उदाहरण के लिए BJV नाली) के साथ तय ऊतकों के लिए, मानव एल्ब्युमिन के २०० g/एल के साथ 4 ° c पर रातोंरात भ्रष्टाचारी टुकड़े करना निर्धारण बेअसर ।
  5. एक microtiter प्लेट में ०.९% NaCl के साथ glutaraldehyde के अवशेषों को धो लें ।  1 मिनट के लिए 3 बार दोहराएं ।

2. छिड़काव प्रयोगों के लिए बैक्टीरिया तैयार करना

नोट: तीन बैक्टीरियल अलग इस्तेमाल किया गया: एस aureus कोवान (ATCC १२५९८), एस epidermidis ATCC १४९९०० और एस sanguinis NCTC ७८६४ । एस aureus और एस epidermidis tryptic सोया शोरबा (TSB) में ३७ डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो गए थे और एस sanguinis 5% के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो गया था2 मस्तिष्क दिल अर्की शोरबा (BHI) ।

  1. एक ठोस रक्त आगर प्लेट पर बैक्टीरिया की रातोंरात संस्कृति तैयार करते हैं ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृति के लिए एक ंयूएलर-Hinton रक्त आगार प्लेट पर बंद और inoculate पर जमे हुए बैक्टीरिया को परिमार्जन करने के लिए एक बाँझ पाश का प्रयोग करें ।
  2. रात भर रक्त आगर संस्कृति से एक एकल कॉलोनी लेने के लिए एक बाँझ टीका पाश का उपयोग करें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक 14 मिलीलीटर ट्यूब और संस्कृति में 10 मिलीलीटर TSB या BHI में inoculate ।
  3. रात भर संस्कृतियों (३००० x g, 4 ° c, 10 मिनट) और फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर में छर्रों resuspend (पंजाब) खारा । बर्फ पर 14 मिलीलीटर ट्यूबों रखें ।
  4. ३.७ मिलीग्राम/एमएल 5 (6)-carboxy-fluorescein एन-hydroxy-succinimidyl एस्टर (CF) में इथेनॉल और स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस के समाधान के एक aliquot तैयार करें । इसके अलावा CF के स्टॉक को पतला करने के लिए १५० µ g/mL का उपयोग करके ' ultrapure ' पानी
    नोट: प्रकाश से ट्यूबों की रक्षा एल्यूमीनियम पंनी और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर ।
  5. जीवाणु (३००० एक्स जी, 4 ° c, 10 मिनट) केंद्रापसारक और पंजाब के ८०० µ एल में छर्रों resuspend और १५० µ g/एमएल CF समाधान के २०० µ एल जोड़ने (30 µ जी के अंतिम एकाग्रता/एमएल छिड़काव प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया) । एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रकाश से ट्यूबों की रक्षा और 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर का उपयोग कर गर्मी ।
  6. लेबलिंग के बाद, पंजाब और स्पिन में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) समाधान के 2% के साथ ब्लॉक (३००० x g, 4 ° c, 10 min) । एक धोने कदम के साथ का पालन करें (३००० एक्स जी, 4 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) द्वारा पंजाब और गोली बैक्टीरिया के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर ।
  7. 107 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU)/mL (ंयूएलर-Hinton रक्त आगार प्लेटों पर CFU गिनती द्वारा सत्यापित), जो ०.६५ के एक आयुध डिपो६०० (ऑप्टिकल घनत्व) से मेल खाती है प्राप्त करने के लिए पंजाबियों के साथ बैक्टीरिया को पतला । छिड़काव प्रयोगों से पहले बर्फ पर ट्यूबों अंधेरे में रखें ।
    नोट. ध्यान रखें कि आयुध डिपो६०० माप बैक्टीरिया की अनुमानित संख्या को प्रतिबिंबित । गणना करने के लिए प्रभावी टीका खुराक, धारावाहिक कमजोर पड़ने विधि एक अतिरिक्त आवश्यक कदम है के रूप में ३.८ अनुभाग में वर्णित आयुध डिपो आधारित संख्या की पुष्टि ।

3. इन विट्रो छिड़काव प्रयोगों एक समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर का उपयोग

  1. पर्वत 10 मिमी व्यास में बायोप्सी और एक ही मोटाई (चरणों में तैयार १.१-१.५) भीतरी सतह का सामना करना पड़ बैक्टीरिया निलंबन के साथ संपर्क में पाने के साथ एक प्रवाह चैंबर प्रणाली में ।
    नोट: विभिंन भ्रष्टाचारियों भर में एक ही ऊतक मोटाई सुनिश्चित करता है कि एक ही ऊतक की ऊंचाई सभी शर्तों में लामिना प्रवाह की अनुमति चैनल में पहुंच गया है । प्रवाह कक्ष के सभी तत्वों को प्रस्तुत कर रहे है और चित्रा 1में वर्णित है ।
    1. प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, एक 8 मिमी परिपत्र वेध और एक रबर गैसकेट के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड के बीच दौर ऊतक टुकड़ा जगह है ।
      नोट: माइक्रोस्कोप स्लाइड अल्ट्रा पतली नीचे फिल्म के पास 8 मिमी छेद की पीढ़ी की अनुमति है । रबर शीट के साथ साथ, यह ऊतक को ठीक करता है नमूना और बहने मध्यम और भी प्रयोग के दौरान बायोप्सी के विस्थापन को रोकता है के बीच सीधा संपर्क को सक्षम करने के लिए । जांच ऊतक, जो प्रवाह (छोटे व्यास) के संपर्क में है की सतह संदंश द्वारा हेरफेर नहीं किया जा सकता है ।
    2. गैसकेट शीट कि चैंबर के नीचे धातु फ्रेम में एंबेडेड है में ऊतक के साथ धारक डालें ।
    3. पहले डाला ऊतक धारक के साथ चैंबर के नीचे भाग पर इसी गैसकेट शीट के साथ ऊपरी धातु फ्रेम संलग्न । बाद में आठ शिकंजा और पेंच पागल के साथ पूरे चैंबर माउंट । सुनिश्चित करें कि चैंबर ऊंचाई हमेशा भ्रष्टाचारियों भर में एक ही है ।
      नोट: चैंबर ऊंचाई हमेशा शिकंजा कसने पर निर्धारित किया जाना चाहिए । किसी कैलिपर या मापनी का उपयोग करें ।
  2. एक सिकुड़नेवाला पंप और ट्यूबों के साथ द्रव जलाशय के साथ प्रवाह कक्ष कनेक्ट ।
  3. 107 CFU/एमएल के निलंबन के साथ ऊतकों Perfuse (CFU गिनती और आयुध डिपो६०० माप से संबंधित द्वारा सत्यापित) फ्लोरोसेंट-एक कतरनी तनाव के साथ पंजाब में बैक्टीरिया लेबल 3 डाइन/cm2 (डाइन प्रति वर्ग सेंटीमीटर दबाव इकाई) द्वारा सिकुड़नेवाला पंप के अर्थ 1 एक ४०० मिलीलीटर बैक्टीरियल जलाशय (में घर डिजाइन, 1 चित्राका उपयोग कर के लिए प्रवाह दर 4 एमएल/) ३७ ° c में वातानुकूलित एक प्लेट थर्मोस्टेट (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर ।
  4. एक ही संग्रह जलाशय का उपयोग कर १०० मिलीलीटर बैक्टीरियल सस्पेंशन लगातार पुनर्वितरित ।
  5. छिड़काव के बाद, चैंबर को ध्वस्त करने के लिए भ्रष्टाचार जारी है और एक 12 में पंजाब के 4 मिलीलीटर के साथ ऊतक टुकड़ा धोने दो बार-खैर थाली 3 मिनट के लिए एक प्रयोगशाला कक्षीय शेखर का उपयोग कर । बाद में एक छोटे व्यास के एक त्वचा बायोप्सी पंच का उपयोग कर भ्रष्टाचार के भीतरी भाग में कटौती ।
  6. एक अलग 14 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक ऊतक बायोप्सी प्लेस बाँझ ०.९% NaCl के 1 मिलीलीटर युक्त । #1 के रूप में ट्यूब लेबल ।
  7. 10 मिनट (आयाम = १००% और आवृत्ति = ४५ kHz) के लिए एक sonication स्नान का उपयोग कर ऊतक से बैक्टीरिया अलग करें ।
    नोट: ऊतक भ्रष्टाचारियों से बैक्टीरिया की पूरी टुकड़ी पैच की गर्मी में ३७ ° c पर रातोंरात TSB तरल माध्यम में मूल्यांकन किया जाना चाहिए एक बैक्टीरिया मुक्त समाधान के साथ इलाज पैच नियंत्रण की तुलना में आयुध डिपो६०० माप के बाद ।
  8. CFUs गिनती करने के लिए ंयूएलर-Hinton रक्त आगार प्लेटों पर एक धारावाहिक कमजोर पड़ने विधि का प्रयोग करें ।
    1. एक एकल 14 मिलीलीटर ट्यूब बाँझ खारा के 10 मिलीलीटर के साथ sonication के बाद प्राप्त जीवाणु निलंबन के धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए तैयार करें । #2 के रूप में इस ट्यूब लेबल ।
      नोट: प्रत्येक ऊतक प्रयोग के लिए ०.९% NaCl के 10 मिलीलीटर के साथ एक ट्यूब आवश्यक है ।
    2. तैयार ३ १४ मिलीलीटर ट्यूबों के साथ 10 बाँझ ०.९% NaCl के सीरियल कमजोर पड़ने के लिए प्रारंभिक जीवाणु निलंबन से चरण २.७. लेबल ट्यूबों के रूप में इस प्रकार है #3, #4, #5 ।
      नोट: इस चरण में छिड़काव प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले बैक्टीरियल सस्पेंशन में असली CFU नंबर जानना जरूरी है ।
    3. भंवर मिश्रण एक ट्यूब के लिए 15 एस भंवर ऊतक बायोप्सी के साथ ट्यूबों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रारंभिक जीवाणु निलंबन धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए ।
    4. तीन आगार प्लेटें तैयार करें, ऊतक प्रयोग के लिए दो (छिड़काव के बैक्टीरिया और नियंत्रण छिड़काव) और perfusions के लिए इस्तेमाल किया प्रारंभिक जीवाणु निलंबन के लिए तीसरे एक ।
    5. निम्नलिखित तरीके से ऊतक प्रयोग के लिए प्रति प्लेट तीन क्षेत्रों लेबल 10-1, 10-3 और 10-4. बैक्टीरियल perfusates में CFUs की संख्या की गणना करने के लिए, इस प्रकार के रूप में प्लेट लेबल: 10-1, 10-3, 10-5 और 10-7.
      नोट: सभी संकेत के रूप में 10-1, 10-3 और इतने पर CFU/एमएल की अंतिम संख्या का उल्लेख पर अगले दिन की गणना की प्लेटों आगर । कंट्रोल प्लेट को किसी सेक्टर की जरूरत नहीं पड़ती । उपयोग करने से पहले, रक्त प्लेटें लामिना हूड के नीचे रखा जाना चाहिए और अतिरिक्त नमी को हटाने के लिए खोला ।
    6. धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी जारी रखने के लिए, ट्यूब #1 के १०० µ एल स्थानांतरण ट्यूब #2 और भंवर के साथ जोरदार मिश्रण ।
    7. फैला १०० ट्यूब की सामग्री के µ एल #1 और #2 इसी सेक्टरों पर 10-1 और 10-आगर प्लेट के3 . इसी तरह, सेक्टर 10-4पर ट्यूब #2 के फैले 10 µ एल, 10 µ एल के प्रत्येक खंड से 4 अलग वृद्धि प्राप्त करने के लिए 4 बार इस चरण को दोहराएँ.
      नोट: सेक्टर 10-4पर चढ़ाना के लिए इस्तेमाल छोटी मात्रा के कारण, यह बढ़ी हुई CFUs की एक औसत संख्या बनाने के लिए कई बूंदों की सलाह दी जाती है ।
    8. आरंभिक संस् कृति के धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए, कदम २.७ से बैक्टीरियल सस्पेंशन के १०० µ l को ट्यूब #3 पर ट्रांसफर करें और भंवर के साथ जोरदार मिश्रण करें । ट्यूब #3 के १०० µ एल जोड़ें ट्यूब #4 और मिश्रण अच्छी तरह से, बाद में ट्यूब #5 के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    9. फैल १०० ट्यूबों की सामग्री के µ l #3, #4, #5 और समायोजित बैक्टीरियल निलंबन (चरण २.७), क्रमशः, सेक्टरों पर 10-3, 10-5, 10-7 और रक्त आगर प्लेट के 10-1 .
    10. लामिना हूड में रक्त आगार प्लेटें छोड़ जीवाणु फैलता शुष्क हवा, आम तौर पर 10 मिनट के लिए । बाद में, रात भर की मशीन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें रखें ।
    11. रात भर की गर्मी के बाद, बैक्टीरियल कालोनियों के लिए आसंजन से ऊतक बायोप्सी के परिणामस्वरूप CFUs की संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से CFUs/एमएल छिड़काव के लिए इस्तेमाल शुरू बैक्टीरियल निलंबन में गिनती । CFU/मुख्यमंत्री2के रूप में व्यक्त परिणाम ।

4. छिड़काव पर भ्रष्टाचार के ऊतकों को पालन बैक्टीरिया का प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. छिड़काव के बाद, पंजाब के साथ ऊतक टुकड़े धो (३.५ कदम देखें) और एक भ्रष्टाचार के भीतरी हिस्सा एक छोटे व्यास के एक पंच का उपयोग काट ।
  2. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट और बढ़ते मध्यम (सामग्री की मेज) की जगह बूंदें तैयार करें ।
  3. अपने perfused सतह के साथ ऊतक के प्रत्येक टुकड़े को बढ़ते माध्यम की एक ही बूंद पर रखें ।
  4. एक प्रतिदीप्ति स्कैनर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर एक थाली पढ़ें । एक जीवाणु लेबलिंग के लिए इस्तेमाल fluorophore के अनुसार उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के मापदंडों निर्धारित करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

बेहतर IE विकास के पीछे तंत्र को समझने के लिए, इस मॉडल जीवाणु और ऊतक जुड़े कारकों के मूल्यांकन में सक्षम बनाता है संक्रमण शुरू होने की vivo स्थिति में मौजूद ।

विस्तार में, इन विट्रो में उपंयास के लिए विभिंन भ्रष्टाचार के ऊतकों को प्रवाह की स्थिति में जीवाणु आसंजन perfusing द्वारा फ्लोरोसेंट लेबल के ऊतकों में कतरनी तनाव के शारीरिक रेंज में 3-10 डाइन/ RVOT के लिए cm2 . इस काम में, हम 4 मिलीलीटर/min कि 3 डाइन/cm2के लिए संगत की एक प्रवाह दर का उपयोग किया । सभी ऊतक पैच में ०.३ mm के चैनल ऊंचाई ध्यान में रखते हुए, घुड़सवार भ्रष्टाचार और लगभग ३९ mm, छिड़काव चैंबर के मध्यम प्रवेश के बीच की दूरी ( 1 चित्रामें दिखाया गया है) की गारंटी पूरी तरह से विकसित लामिना प्रवाह (Re = ३.८९ है २००० से काफी कम है; प्रवेश लंबाई = ०.०५ mm दूरी ' प्रवेश-' भ्रष्टाचार, उचित प्रवाह पैटर्न संभालने के लिए आवश्यक मानकों से काफी छोटा है) ।

कतरनी तनाव की स्थिति के तहत, विभिंन भ्रष्टाचार के ऊतकों में एक समान जीवाणु लगाव दोनों एस aureus और एस epidermidis संक्रमण के लिए मनाया गया था (चित्रा 2 और चित्रा 3) । हालांकि महत्वपूर्ण नहीं, aureus के उच्च आसंजन CH पत्रक के प्रति एक प्रवृत्ति ध्यान देने योग्य था ।

के लिए एस sanguinis BJV दीवार के पालन की एक महत्वपूर्ण कमी पाया गया जब बीपी पैच की तुलना में (4 चित्रा; P < ०.०५). जब बैक्टीरिया की 3 प्रजातियों की तुलना, एस sanguinis एस aureus और एस epidermidis के संबंध में BJV दीवार के लिए काफी कम आसंजन प्रस्तुत करता है (पी < ०.०१ और पी < ०.०५ क्रमशः, वीडियो देखें) । सामांय में, हम सभी के लिए कतरनी तनाव के तहत जांच की ऊतकों को एक समान जीवाणु आसंजन मनाया ।

CFU गिनती से हमारे डेटा (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एक उच्च प्रवाह स्कैनर (चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7) का उपयोग कर समर्थन कर रहे हैं. छवियां लेबल वाले भ्रष्टाचार के ऊतकों का पालन बैक्टीरिया का स्पष्ट घावों पेश कर रहे हैं । इस दृष्टिकोण के कारण, हम सीधे छिड़काव पर किसी भी पद प्रयोगात्मक प्रसंस्करण के बिना चित्रण प्रयोजनों के लिए ऊतकों कल्पना कर रहे थे ।

परिणाम प्रदर्शित करता है कि एक भ्रष्टाचार ऊतक के स्रोत, सतह रूपात्मक मतभेद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरियल adhesinsइन जैविक सामग्री के जीवाणु पालन के प्रमुख निर्धारक नहीं हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एक नव विकसित प्रवाह चैंबर प्रणाली की छवि (में घर डिजाइन के विभाग के जैव संकर & चिकित्सा वस्त्र, म-Helmholtz इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग, आकिन, जर्मनी). A. फ्लो चैंबर (1) घुड़सवार आयाम LxWxH के प्रवाह सेट: १२५ मिमी x ५५ मिमी x 18 मिमी (पेंच के साथ संयोजन में शिकंजा-पागल चैंबर के भागों को एक साथ पकड़ और रिसाव को रोकने के लिए पाल बांधने की रस्सी पर धातु फ्रेम के माध्यम से दबाव डाला); (2) कॉलम का ऊपरी भाग; (3) दो छेद के साथ ऊपरी गैसकेट शीट को ट्यूबिंग connectors, जो पंप और टयूबिंग प्रणाली के माध्यम से द्रव जलाशय के साथ प्रवाह कक्ष कनेक्ट तय; (4) मध्यम प्रवेश और ऊतक (प्रवेश लंबाई) के बीच की दूरी; ( 5) पतली पंनी स्लाइड (एक 8 मिमी परिपत्र वेध के साथ बैक्टीरियल निलंबन करने के लिए ऊतक के जोखिम की अनुमति) (स्लाइड के एक अवकाश में वहां एक रबर गैसकेट B9के लिए जगह है, छिड़काव के दौरान ऊतक टुकड़ा स्थिर); (6) एक समर्पित अवकाश के साथ नीचे पाल बांधने की रस्सी शीट के ऊतकों खुर्दबीन स्लाइड और रबर पाल बांधने की रस्सी के बीच घुड़सवार; (7) प्रवाह कक्ष का निचला भाग; B. पूरा सेट अप (8) पतली पन्नी स्लाइड; (9) रबर गैसकेट; (10) इसी के साथ आठ शिकंजा (11) आठ पेंच पागल; (१२) द्रव जलाशय (४०० मि.); (13) टयूबिंग प्रणाली; C. छिड़काव इकाई (14) the सिकुड़नेवाला पंप; (15) समर्पित टयूबिंग कि सिकुड़नेवाला पंप कार्रवाई की कठोरता को झेलने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एस aureus कोवान के आसंजन प्रवाह की स्थिति में भ्रष्टाचार के ऊतकों को । perfused में 5 भ्रष्टाचारी ऊतकों (नाली की दीवारें या वाल्वुलर पत्रक) को पंजाबियों में लगाया गया था । जीवाणु sonication द्वारा संक्रमित ऊतक के टुकड़ों से अलग थे । बैक्टीरियल आसंजन CFU गिनती विधि का उपयोग कर धारावाहिक कमजोर पड़ने से मूल्यांकन किया गया था और CFU/cm2के रूप में संकेत दिया । सभी परिणाम सामग्री की सीमा के कारण वाल्वुलर पत्रक के लिए अर्थ ± SEM (n > 3 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, नाली दीवारों के लिए n > 5) । CFU: कॉलोनी बनाने इकाई; बीपी: गोजातीय पेरीकार्डियम; BJV: गोजातीय jugular नस; CH: cryopreserved homograft. यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एस epidermidis के आसंजन प्रवाह शर्तों के तहत भ्रष्टाचार के ऊतकों को । perfused में 5 भ्रष्टाचारी ऊतकों (नाली की दीवारें या वाल्वुलर पत्रक) को पंजाबियों में लगाया गया था । जीवाणु sonication द्वारा संक्रमित ऊतक के टुकड़ों से अलग थे । बैक्टीरियल आसंजन CFU गिनती विधि का उपयोग कर धारावाहिक कमजोर पड़ने से मूल्यांकन किया गया था और CFU/cm2के रूप में संकेत दिया । सभी परिणाम सामग्री की सीमा के कारण वाल्वुलर पत्रक के लिए अर्थ ± SEM (n > 3 के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, नाली दीवारों के लिए n > 5) । CFU: कॉलोनी बनाने इकाई; बीपी: गोजातीय पेरीकार्डियम; BJV: गोजातीय jugular नस; CH: cryopreserved homograft. यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एस sanguinis के आसंजन प्रवाह शर्तों के तहत भ्रष्टाचार के ऊतकों को । perfused में 5 भ्रष्टाचारी ऊतकों (नाली की दीवारें या वाल्वुलर पत्रक) को पंजाबियों में लगाया गया था । जीवाणु sonication द्वारा संक्रमित ऊतक के टुकड़ों से अलग थे । बैक्टीरियल आसंजन CFU गिनती विधि का उपयोग कर धारावाहिक कमजोर पड़ने से मूल्यांकन किया गया था और CFU/cm2के रूप में संकेत दिया । सभी परिणामों के रूप में अर्थ ± SEM व्यक्त कर रहे है (n = 3 वाल्वुलर के लिए सामग्री की सीमा के कारण पत्रक; नाली दीवारों के लिए n > 5) । CFU: कॉलोनी बनाने इकाई; बीपी: गोजातीय पेरीकार्डियम; BJV: गोजातीय jugular नस; CH: cryopreserved homograft. यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). * P < ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से भ्रष्टाचार के ऊतकों के लिए एस aureus कोवान पालन का दृश्य. बाएं से दाएं: BJV नाली दीवार, BJV पत्रक, ch दीवार और ch पुस्तिका । यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर भ्रष्टाचार के ऊतकों को एस epidermidis पालन का दृश्य. बाएं से दाएं: BJV नाली दीवार, BJV पत्रक, ch दीवार और ch पुस्तिका । यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर भ्रष्टाचार के ऊतकों को एस sanguinis पालन का दृश्य. बाएं से दाएं: BJV नाली दीवार, BJV पत्रक, ch दीवार और ch पुस्तिका । यह आंकड़ा वेलोसो एट अल से संशोधित किया गया है । (वक्ष और हृदय शल्य चिकित्सा की पत्रिका १५५ (१), 325-332 (२०१८)). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हाल ही में नैदानिक टिप्पणियों RVOT6,13के वाल्व प्रतिस्थापन आया रोगियों में एक जटिलता के रूप में IE के लिए विशेष जागरूकता दे । IE में प्रत्यारोपित वाल्व की शिथिलता अंतर्वाहिकी व्यापक भड़काऊ और procoagulant प्रतिक्रियाओं1,14के लिए अग्रणी भ्रष्टाचार के साथ बैक्टीरियल बातचीत का परिणाम है । इन विट्रो में प्रस्तुत उपंयास मॉडल हमें जांच करने की अनुमति दी अगर ऊतक संरचनाओं और बैक्टीरियल कारकों में मतभेद के संक्रमण के लिए संवेदनशीलता मिलाना की संभावना है vivo इस्तेमाल किया भ्रष्टाचार15। BJV और CH भ्रष्टाचार ऊतक प्रवाह की स्थिति में बैक्टीरियल भर्ती के प्रति इसी तरह की प्रवृत्ति दिखाया । इसलिए, डेटा का सुझाव है कि सामांय में ऊतक के स्रोत और उसकी सतह संरचना के रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट जीवाणु चिपकने वाला प्रोटीन प्रति एसई प्रारंभिक जीवाणु पालन में प्रमुख निर्धारक कारक नहीं हैं ।

आम तौर पर, संक्रमित अंतर्वाहिकी साइट पर सूजन, ऊतक क्षति, प्लेटलेट और फाइब्रिन जमाव को पैदा करने के रास्ते कई खिलाड़ियों द्वारा सक्रिय कर रहे हैं1,16. इन विट्रो मॉडल में विकसित का एक प्रमुख लाभ stepwise शामिल खिलाड़ियों के योगदान का विश्लेषण करने का अवसर है । एकल बैक्टीरियल कारकों बैक्टीरियल उत्परिवर्ती उपभेदों या आनुवंशिक रूप से संशोधित उनकी सतह14पर एक आसंजन प्रोटीन व्यक्त बैक्टीरिया का उपयोग करके जांच की जा सकती है । अलग छिड़काव मीडिया, प्लाज्मा या रक्त का चयन करके, प्लाज्मा प्रोटीन और रक्त कोशिकाओं की भागीदारी का मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अलावा अध्ययन ऊतक संबंधित कारकों पर ध्यान केंद्रित करेंगे जिसके लिए ऊतक पूर्व हो जाएगा के साथ गर्मी उदाहरण प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाद में छिड़काव के लिए प्रवाह कक्ष में घुड़सवार पहले । कृत्रिम वाल्व यानी अस्पष्ट रहने की शुरुआत करने के लिए योगदान खिलाड़ियों के बाद से, भविष्य के अध्ययनों से एक अधिक जटिल प्रयोगात्मक सेटअप करने के लिए निर्माण द्वारा संभावित कारकों सुलझाना हो सकता है । इसके अलावा, इस प्रायोगिक सेटअप संभावना है कि ऊतकों को एक चुनाव आयोग परत के साथ बीज के लिए कतरनी निर्भर चुनाव आयोग जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कर सकते है वारिस । समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर भी चुनाव आयोग पर छिड़काव की अनुमति देता है, छिड़काव चैंबर के एक लचीला भीतर की ऊंचाई के कारण माइक्रोस्कोप स्लाइड कवर किया । कवर के विभिंन कोटिंग्स विभिंन extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन का उपयोग कर फिसल जाता है subendothelial मैट्रिक्स के साथ महत्वपूर्ण बातचीत का आकलन करने के लिए एक संभव विकल्प भी हैं । इसके अलावा, औषधीय अवरोधकों या कार्यात्मक एंटीबॉडी हमारे फ्लो चैंबर में संबंधित हालत में उनके प्रभाव के लिए जांच की जा सकती है । संक्षेप में, विभिन्न स्थितियों में बढ़ती जटिलता का अध्ययन किया जा सकता है ।

भ्रष्टाचार के संक्रमित क्षेत्र में भड़काऊ सक्रियण एक महत्वपूर्ण, कतरनी नियंत्रित कदम सक्रिय प्लेटलेट्स और monocytes के पक्ष एहसान है । ऊतक सतहों को बैक्टीरियल पालन पर कतरनी बलों के प्रभाव प्रमुख चिंता का विषय हैं । इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए, में प्रस्तुत की नवीनता इन विट्रो प्रणाली एक प्रवाह चैंबर में ऊतकों माउंट करने के लिए संभावना पर केंद्रित है । यह मौजूदा विकल्प है, जिसमें आम तौर पर बैक्टीरिया और अंतर्निहित ऊतकों के बीच स्थैतिक बातचीत की जांच की गई है से परे विधि के महत्व को पुष्ट । हालांकि कतरनी तनाव मिलाते हुए या अंय बाहरी बलों द्वारा प्रस्तुत किया गया था, यह एक ही स्तर पर मानकीकृत नहीं किया गया है के रूप में हम अपनी वर्दी प्रवाह मॉडल से प्राप्त कर सकते हैं ।

vivo में, एक गैर-शारीरिक प्रवाह पैटर्न प्रत्यारोपित नाली के वाल्व स्तर पर IE की शुरुआत के रूप में बैक्टीरियल आसंजन एहसान कर सकते हैं । कतरनी तनाव अप करने के लिए पाया गया था-cytokine स्राव के रूप में endothelial भड़काऊ मापदंडों को विनियमित करने और ऊतक कारक मध्यस्थता17में वृद्धि करने के लिए. अंतर्निहित बैक्टीरिया के साथ वाल्व कृत्रिम अंगों के लिए इस्तेमाल ऊतक की बातचीत और कतरनी तनाव के तहत चुनाव आयोग जीन अभिव्यक्ति पर उनके प्रभाव के लिए एक कम जीवाणु आसंजन और जीर्ण सूजन के लिए सक्षम वाल्व का निर्माण महत्वपूर्ण है ।

निर्मित चैंबर के बेसल तकनीकी मुद्दों लामिना प्रवाह18में मानकीकृत शर्तों के तहत जांच की अनुमति । जांच ऊतक के स्थल पर पूरी तरह से विकसित लामिना प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए चैंबर मध्यम प्रवेश से एक निश्चित दूरी में भ्रष्टाचार पर्वत का निर्माण किया है (काफी लंबी गणना प्रवेश लंबाई से, परिणाम और 1 चित्रादेखें) । प्रणाली में विभिंन पंपों का प्रयोग भविष्य में गुणवाला या अशांत प्रवाह की स्थिति में प्रयोग प्रदर्शन की अनुमति होगी ।

चैंबर के लचीले फ्रेम लीक से चैंबर प्रभावी ढंग से रोकता है और फ्रेम की आंतरिक ऊंचाई ऊतक मोटाई के लिए अनुकूल बनाने की अनुमति देता है । पूरी प्रणाली के निर्माण के एक परिसंचारी प्रवाह है, जो महत्व के मध्यम के एक संबंधित राशि का उपयोग कर के साथ लंबे समय तक चलने perfusions प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है । पिछले अध्ययनों के आधार पर हमारे आसंजन प्रोटोकॉल एक 1 एच मशीन4,19के लिए 107 CFU/एमएल की एक बैक्टीरियल टीका खुराक ग्रहण किया । इन सेटिंग्स का उपयोग करके, आसंजन के स्तर का पता लगाने योग्य थे, काफी कम हालांकि ऊतक भ्रष्टाचार की सतह के संतृप्ति के बिना बैक्टीरियल पालन की महत्वपूर्ण वृद्धि का पालन करने में सक्षम हो । इसके अलावा, समय की इस अवधि में, यह इस अध्ययन में लिया उपभेदों भर में बाध्यकारी में संभावित मतभेदों को नोटिस संभव था । कतरनी मापदंडों यहां संबोधित शारीरिक रेंज में थे और रक्त वाहिकाओं, जो RVOT के संबंध में हमारे लक्ष्य थे के लिए अनुकूलित ।

विधि के आगे संशोधन मध्यम के अधिक कुशल खपत पर प्रक्रिया के दौरान और साथ ही सेटअप बढ़ते के सरलीकरण पर ध्यान केंद्रित करेंगे । इसके अलावा, ऊतक विधानसभा के लिए कई स्लॉट सहित एक नए डिजाइन दक्षता के रूप में इस तरह के पहलुओं में एक संपूर्ण प्रयोग को कम करेगा ।

इस स्तर पर हमारे विधि अंत बिंदु परिणामों पर ध्यान केंद्रित है और गतिशील ऊतक सतह पर होने वाली घटनाओं के समय पाठ्यक्रम के रूप में वास्तविक समय अनुप्रयोगों के लिए परीक्षण नहीं किया गया था । इस प्रकार, इस व्यापक आवेदन विचाराधीन रहता है; हालांकि, ऐसे ऊतक autofluorescence, एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्रोटोकॉल के अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चैंबर के रूपांतरों के रूप में मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अपनी वर्तमान स्थिति में विधि को ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा माइक्रोस्कोप स्लाइड पर चुनाव आयोग परतों को बैक्टीरियल बाध्यकारी की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वर्तमान में, हम कर रहे है बैक्टीरिया और अंय रक्त घटकों की कल्पना/के बाद प्रयोगात्मक ऊतक प्रसंस्करण, जो औंधा द्वारा प्रवाह के तहत वास्तविक समय दृश्य के लिए संवेदनशील है के लिए एक की जरूरत के बिना फोकल माइक्रोस्कोप से बंधे कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी ।

इस अध्ययन में, बैक्टीरियल आसंजन के ठहराव CFU गिनती द्वारा प्रदान की गई थी जबकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक सहायक, गैर मात्रात्मक उपकरण था । समाधान एक पर्याप्त माइक्रोस्कोप लेंस की कमी से उत्पंन मुद्दों के कारण, प्रतिदीप्ति इमेजिंग निकला सीरियल कमजोर पड़ने से हमारे हाथ में कम reproducible हो । फिर भी, यह ठहराव के लिए प्रतिदीप्ति स्कैनिंग का उपयोग करें जब उपयुक्त उद्देश्य लेंस विश्वसनीय घावों ठहराव के लिए व्यास में 8 मिमी के पूरे भ्रष्टाचारी आकार रोशन सकता है संभव है । (जैसे ImageJ के रूप में) एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करना, निरपेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों की जांच की ऊतक नमूनों के लिए quantified हो सकता है और जीवाणु आसंजन आंतरिक नियंत्रण के लिए एक रिश्तेदार संकेत के रूप में उदाहरण के लिए व्यक्त किया जा सकता है (भ्रष्टाचारियों के साथ perfused गैर-लेबल वाले बैक्टीरिया).

इस प्रयोगात्मक सेटिंग की प्रमुख सीमा के साथ जुड़े मुद्दों में है इन विट्रो अध्ययनों में सामांय । इन विट्रो प्रवाह चैंबर मॉडल में इस का उपयोग करके पहुंचे परिणाम vivo पुष्टिकरण में के लिए एक पशु मॉडल को हस्तांतरित किया जा सकता है ।

अंत में, इस इन विट्रो मॉडल में एक stepwise तरीके से ऊतकों को बैक्टीरियल आसंजन की शुरुआत करने के लिए योगदान देने वाले एकल जीवाणु, ऊतक और कतरनी आधारित कारकों की जांच की अनुमति देता है । इसके द्वारा सक्षम ज्ञान और अधिक प्रभावी रोकथाम और IE के उपचार के विकास में योगदान कर सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई.

Acknowledgments

इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा प्रायोजित किया गया था अनुसंधान कोष कू Leuven (OT/14/097) आरएच को दी । TRV FWO रिसर्च फाउंडेशन के Postdoctoral फेलो थे-Flanders (बेल्जियम; अनुदान संख्या-12K0916N) और आरएच UZ Leuven के नैदानिक अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक १४३ Staphylococcus aureus संक्रामक अन्तर्हृद्शोथ आसंजन subendothelial मैट्रिक्स कतरनी तनाव प्रवाह चैंबर वाल्वुलर भ्रष्टाचारी ऊतकों RVOT
एक <em>में इन विट्रो</em> मॉडल एक समानांतर प्लेट छिड़काव प्रणाली के जीवाणु पालन के लिए भ्रष्टाचार के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter