Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.
Abstract
Homöostase der Gelenkknorpel hängt die Lebensfähigkeit der ansässigen Zellen (Chondrozyten). Leider kann mechanische Trauma weit verbreitete Knorpelzelltransplantation Tod, möglicherweise führend zu irreversiblen Ausfall des Gelenks und der Beginn der Arthrose auslösen. Darüber hinaus ist die Wartung der Knorpelzelltransplantation Rentabilität wichtig osteochondrale Transplantation Verfahren für optimale chirurgische Ergebnisse. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen synovialen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann in vergleichenden Studien verwendet werden, um zu untersuchen, die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder genetische Manipulationen sowie verschiedenen Stufen der Knorpel-Degeneration auf kurz- bzw. langfristigen Anfälligkeit von in-situ artikuläre Chondrozyten. Das Ziel des Protokolls eingeführt in das Manuskript soll die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche der murinen synovialen Gelenke zu beurteilen. Wichtig ist, ermöglicht diese Methode testen auf völlig intakte Knorpel ohne native Randbedingungen. Darüber hinaus ermöglicht es Echtzeit-Visualisierung von entscheidender gefärbten artikuläre Chondrozyten und einzelne Image-basierte Analyse der Zelle Verletzung durch Anwendung der kontrollierten statisch und Auswirkungen laden Therapien induziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass im gesunden Knorpel Explantaten die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung Ausmaß und die Auswirkungen der Belastungsintensität sensibel abhängt. Unsere Methode kann leicht angepasst, um die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen auf die mechanischen Anfälligkeit von in Situ artikuläre Chondrozyten zu untersuchen sein.
Introduction
Gelenkknorpel (AC) ist eine tragende Gewebe, das bedeckt und schützt Knochen in synovialen Gelenke, eine reibungslose gemeinsame Artikulation. Gewebe-Homöostase ist abhängig von der Lebensfähigkeit der Chondrozyten, der einzige Zelltyp mit Wohnsitz in AC. Jedoch kann Exposition des Knorpels zu extremen Kräfte aufgrund Trauma (z.B., fällt, Fahrzeug-Unfall oder Sport-Verletzungen) oder Post-traumatische Gelenkinstabilität Knorpelzelltransplantation Tod, führt zu irreversiblen Ausfall des Gelenks (Arthrose) induzieren. 1. Darüber hinaus in osteochondrale Transplantation Verfahren, die darauf abzielen, lokale Defekte in Knorpelschäden zu reparieren, Transplantat einfügen-assoziierten mechanische Trauma reduziert Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit und hat nachteilige Auswirkungen auf die chirurgischen Ergebnisse2.
Knorpel Explant Modelle werden häufig verwendet, um die Anfälligkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten mechanisch induzierte Zelltod zu studieren. Diese Modelle verwenden in der Regel Explantaten von großen Tieren Studie zu den Auswirkungen des Ladens Bedingungen, Umgebungsbedingungen und anderen Faktoren auf Zelle Schwachstelle3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15. Diese Modelle erfordern jedoch aufgrund der Größe der native Gelenke, in der Regel Entfernung eines Steckers aus der Gelenkfläche ein intaktes Gelenk, dabei Kompromisse bei der nativen Randbedingungen. Darüber hinaus ist sie in der Regel großen mechanischen Belastungen auf Zelle Verletzung zu induzieren. Alternativ bieten murinen Knorpel Explant Modelle mehrere Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen bei der Untersuchung der mechanischen Anfälligkeit der in Situ Chondrozyten. Diese Modelle erleichtert vor allem aufgrund ihrer kleineren Abmessungen, Prüfung von voll intakten Gelenkknorpel ohne nativen Gewebe Integrität zu verändern. Darüber hinaus laden der murinen Knorpel erfolgt über kleine Kontaktflächen, sodass Knorpelzelltransplantation Tod/Verletzung mit kleinen Lasten induziert werden kann (< 1 N). Schließlich ist die Maus Genom leicht manipuliert und ermöglicht Tests wie bestimmte Gene Auswirkungen die Anfälligkeit in Situ Chondrozyten gegen mechanische Verletzungen.
Das übergeordnete Ziel der Methode eingeführt, in diesem Manuskript ist zu quantifizieren und visualisieren-in real-time-die räumliche Ausdehnung der in Situ Zelle Tod/Verletzungen durch mechanische Belastungen auf völlig intakt Maus Knorpel-Knochen explants in Vitro. Diese Methode erfordert sorgfältige Präparation der Maus synovialen Gelenke ohne Kompromisse bei der Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit, gefolgt von mechanische Prüfung von äußerst gefärbten Explantaten mit einem Mikroskop montierte Gerät ähnlich wie eine Testplattform, die wir vor kurzem entwickelt murine Knorpel mechanischen Eigenschaften16zu quantifizieren. Während mechanische Prüfung, ist ein Großteil der (intakt) Gelenkfläche des Knochens seziert sichtbar auf einem einzigen Fluoreszenz Schliffbild, ermöglicht schnelle Analyse der Zellviabilität, nachdem eine Last angewendet wird. Eine ähnliche Analyse der Oberfläche Zellviabilität in murinen Knorpel Explantaten wurde zuvor, aber ohne gleichzeitige Anwendung der Last17durchgeführt. Mögliche Anwendungen unserer Methode sind vergleichende Studien untersuchen die Verwundbarkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten an verschiedenen kontrollierten Umwelt- und mechanischen sowie Screening von Behandlungen, die zur Verringerung der Empfindlichkeit der Chondrozyten auf mechanische Belastung.
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Protocol
Alle tierische Arbeit wurde von der University of Rochester Ausschuss für Tier-Mittel zugelassen.
(1) Lösungen
- Bereiten Sie Hank es ausgewogen Salzlösung (1 X HBSS), enthält Kalzium, Magnesium und kein Phenol-rot. Einstellen Sie den pH-Wert 7,4 durch Zugabe geringer Mengen von HCl oder NaOH.
- Passen Sie die Osmolarität zu 303 mOsm durch Zugabe von NaCl oder deionisiertes Wasser. Verwenden Sie den Puffer während Sezierungen, Probenvorbereitung und mechanische Prüfungen.
(2) Sezierungen des distalen Femur und der proximalen Humerus mit voll intakten Gelenkknorpel
- Einschläfern Sie die Maus nach institutionellen Richtlinien mit einer CO2 Inhalation Kammer gefolgt von zervikale Dislokation. Aseptischen Technik im ganzen zu folgen.
Hinweis: Mäuse zwischen 8 und 81 Wochen alt von jedem Stamm und Geschlecht können verwendet werden. - Verwenden Sie die folgenden chirurgischen Werkzeuge für Sezierungen: Mikro-Schere (verwendet für die Herstellung von Inzisionen), standard sezierenden Schere (verwendet für das Schneiden von Knochen), Skalpell mit #11 Skalpellklinge (zum Schneiden von weichem Gewebe verwendet), Juwelier Zange (verwendet für die Entfernung von weichen Gewebe) und standard Pinzetten (verwendet für das Schälen der Weichteile und der Haut).
- Folgen Sie für Sezierungen des distalen Femur den Anweisungen unten.
- Positionieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage.
- Machen Sie einen kleinen (ca. 5 mm)-Schnitt in der Haut auf dem vorderen Teil des Knies.
- Erweitern des Schnittes ganz um das Knie und ziehen Sie die Haut um die Knie Gelenk und Bein Muskeln freizulegen.
- Ausgehend von dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie das Messer zwischen die Quadrizeps-Muskel-Sehnen-Einheit und die vordere Seite der femoral Welle. Erweitern Sie den Schnitt in Richtung und vorbei an der Patella und abschließend schneiden durch die Mitte der Patellasehne, wodurch die Quadrizeps-Muskel-Sehnen-Einheit.
- Ausgehend von dem proximalen Ende des Oberschenkelknochens, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie das Messer zwischen die Kniesehne-Muskel-Sehnen-Einheit und die hintere Seite der femoral Welle. Sobald der Schnitt des Kniegelenks nähert, beginnen Sie schneiden durch das Weichgewebe, Vermeidung des Kontakts zwischen dem Skalpell und der Gelenkfläche auf den distalen Kondylen des Femurs. Beenden Sie den Schnitt vorbei an das Kniegelenk.
- Ziehen Sie den Quadrizeps und Kniesehne Muskeln um den Oberschenkelknochen verfügbar zu machen. Schneiden Sie jede überschüssige Muskel an den lateralen und medialen Seiten des Oberschenkelknochens.
- Schneiden Sie die Wadenmuskulatur auf der hinteren Seite der proximalen Tibia und drehen Sie das Bein um die hintere Seite des Oberschenkelknochens zu visualisieren.
- Setzen Sie die distalen Kondylen des Oberschenkels und des hinteren Oberfläche der proximalen Tibia durch entfernen überschüssiges Gewebe um das Kniegelenk.
- Schneiden Sie die vordere und hintere Kreuzband mit einem Skalpell schneiden Weg von der femoralen Kondylen. Ziehen Sie die Tibia von Femur und schneiden Sie der Bänder um die Unterschenkel aus dem Oberschenkelknochen zu trennen.
- Mit standard sezierenden Schere, Schnitt durch das Femur am proximalen Ende des Knochens (8 mm oberhalb der tibiofemoralen-femorale Gelenk) aus der lateralen Seite. Nach dem Schneiden des Knochens, wischen Sie alle sichtbaren Knochenmark auf der Außenseite des Knochens zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen von Knochenmarkzellen.
Hinweis: Schneiden von lateralen Seite reduziert das Risiko von Rissausbreitung entlang des Knochens. - Entfernen Sie umgebenden Weichteile (d.h., Bänder und überschüssige Muskel) aus dem Oberschenkelknochen mit Juwelier Pinzette und Aussetzen des Knorpels auf beide Kondylen am distalen Ende des Oberschenkelknochens. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Knorpel und Zange.
- Folgen Sie für Sezierungen des Humerus den Anweisungen unten.
- Positionieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage.
- Einen Einschnitt (~ 5 mm) in der Haut auf der hinteren Seite des Ellenbogens mit Mikro-Schere machen, den Schnitt rund um den Ellenbogen zu verlängern und ziehen Sie die Haut um die Muskeln von Arm und Schulter verfügbar zu machen.
- Ausgehend von dem proximalen Ende des Humerus, verwenden Sie eine Skalpellklinge (#11) entlang der distale Richtung schneiden. Positionieren Sie die Klinge zwischen den Trizeps-Muskel-Sehnen-Einheit und der hinteren Seite des Humerus. Den Schnitt am distalen Ende des Humerus zu verlängern und durch Durchtrennung der Sehne Trizeps beenden.
- Dann ziehen Sie den Trizeps am proximalen Ende des Humerus bis des Humeruskopfes ausgesetzt ist.
- Schneiden Sie das Bindegewebe um die Humeruskopfes mit einem Skalpellklinge (#11) ohne Berührung der Gelenkfläche und entfernen Sie die Gliedmaßen (Arm und Schulter) aus dem Körper zu. In regelmäßigen Abständen die Gelenkfläche des Humeruskopfes mit HBSS-Hydrat.
- Der Arm trennen Sie der Oberarmknochen durch erste Abbruch das proximale Ende der Ulna auf der hinteren Seite des Armes mit Zange und schneiden dann das Bindegewebe um das distale Ende des Humerus. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe am Humerus.
- Der Deltamuskel Tuber auf der hinteren Seite des Humerus mit standard sezierenden Schere abgeschnitten.
- Setzen Sie einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit HBSS Puffer seziert soll(en).
3. live (Calcein AM) / Toten (Propidium Jodid) Färbeprotokoll
- Fleck mit Calcein AM wie folgt.
- Machen Sie eine Stammlösung von Calcein AM durch Zugabe von 12,5 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in ein Fläschchen mit 50 µg von Calcein AM, was zu einer Lager Konzentration von 4 mg/mL (4,02 mM).
- Verdünnen Sie das Lager Calcein Lösung 1: 400 in HBSS zu einer Konzentration von 10 µg/mL (10,05 µM) von Kalzium AM (z. B. hinzufügen 1,25 µL der Stammlösung 500 µL HBSS).
- Zentrifugieren der verdünnten Färbelösung für 5 s bei 2.000 x g um sicherzustellen, dass alle des Farbstoffs, die gelegentlich an den Wänden des Schlauches halten kann, vermischt mit dem Puffer. Entfernen Sie den Überstand nicht. Vortex: die Lösung für die richtige Mischung zu gewährleisten.
- Ein 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL der verdünnten Färbelösung sezierte Probe umgesetzt. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 min in einem Thermomixer beim Rühren bei 800 u/min. Sicherstellen Sie, dass die Rohre in Alu-Folie zum Schutz vor Lichteinfall bedeckt sind.
- Übertragen Sie das Exemplar in Calcein AM freien HBSS Puffer. An dieser Stelle ist die Probe für die mechanische Prüfung bereit.
- Bereiten Sie Propidium Jodid (PI) Färbelösung wie folgt vor.
- Bereiten Sie die PI Färbelösung durch Verdünnung der gekauften Stammlösung (1 mg/mL, 1, 5 mM) 01:25 in HBSS, 40 µg/mL (60 µM) von PI zu erreichen. Fügen Sie 40 µL der Stammlösung zum Beispiel HBSS 1000 µL hinzu.
- Halten Sie die PI Färbelösung in Alu-Folie abgedeckt, um es vor Lichteinfall zu schützen. Verwenden Sie die Färbelösung unmittelbar nach der mechanischen Prüfung um verletzten Zellen (siehe Abschnitt 4) zu erkennen.
Hinweis: Man kann durchführen, die PI-Färbung vor der Verladung sowie zu strenger Beurteilung der Qualität von den Sektionen.
4. mechanische Testprotokoll
- Die Probe (Femur und Humerus) auf der Glas-Folie von einer benutzerdefinierten Mikroskop montierte mechanische Prüfeinrichtung zu platzieren, so dass die Gelenkfläche auf dem hinteren femoral Kondylen oder Humeruskopfes auf dem Glas (Abbildung 1 sitzt).
Hinweis: Befestigen Sie einen 10 mm langen hölzernen Applikator (Durchmesser = 2 mm) auf der distalen Seite des Humerus mit Cyanacrylat-Klebstoff bevor sie auf dem Gerät platziert, um die Probe auf die flache Oberfläche zu stabilisieren. Für eine detaillierte Beschreibung der mechanischen Testplattform siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 1. - Die Probe mit HBSS Hydrat und stellen Sie das Gerät mit der Probe auf dem Fluoreszenzmikroskop.
- Die artikuläre Chondrozyten mit Calcein AM gebeizt Bild (Anregung/Emission Wellenlängen = 495/515 nm) vor (Baseline) Anwendung der Last unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 4 X trocknen Objektiv (NA = 0,13). Einstellungen Sie die Übernahme-um die Bildqualität zu optimieren.
- Gelten Sie mechanische laden auf die Probe, so dass Gelenkknorpel gegen das Deckglas komprimiert wird.
- Gelten Sie für die statische Aufladungeine vorgeschriebene statische Belastung (z. B.0,5 N) auf die Probe (Femur und Humerus). Halten Sie die Last für 5 min und dann entfernen.
- Auswirkungenbeantragen Sie eine vorgeschriebene Schlagenergie (z.B. 1 mJ) auf die Probe durch Fallenlassen einer zylindrischen Impaktor bekanntes Gewicht (z.B.0,1 N) aus einer vorgeschriebenen Höhe (z.B. 1 cm). Lassen Sie die Last 5 s nach dem Aufprall.
Hinweis: Das Gewicht der Impaktor (mg) und der vorgeschriebenen Höhe (h) kann umgebaut werden Aufprall-Energie (E) unter Verwendung der folgenden Gleichung: E = Mgh.
- Inkubieren Sie das Exemplar in PI Färbelösung für 5 min bei Raumtemperatur.
- Die artikuläre Chondrozyten mit Calcein AM gebeizt Bild und PI (Anregung/Emission Wellenlängen = 535/617 nm) unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2).
(5) Datenanalyse
- Bereich der verletzten/toten Zellen durch die angewandte mechanische Belastung-Therapie zu quantifizieren.
- Öffnen Sie die Aufnahmen von der Gelenkfläche erworben vor und nach Anwendung der mechanischen Belastung in ImageJ18.
- Kombinieren Sie die Bilder in einem Stapel.
- Legen Sie den Maßstab der Bilder basierend auf die Bildauflösung.
- Verwenden Sie das Polygon -Werkzeug, um den Bereich zu definieren, wo die Zellen Calcein-negativ (Verlust der grünen Fluoreszenz) und PI-positiv (plus rote Fluoreszenz) wurde. Diese Zellen werden als verletzt oder tot sein.
- Ermitteln Sie Bereich der verletzten/toten Zellen mit dem Messwerkzeug .
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Representative Results
Sechs verschiedene angewendet laden Protokolle (statische Aufladung: 0,1 N, 0,5 N und 1 N für 5 min; und Stoßbelastung: 1 mJ, 2 mJ und 4 mJ) reproduzierbar induzierte quantifizierbare lokalisierte Bereichen der Zelle Verletzung im femoralen und Humerus Knorpel von 8-10 Wochen alten BALB/c Mäuse (erhalten ( Abbildung 2). Wichtig ist, wurde die räumliche Ausdehnung der Knorpelzelltransplantation Verletzungen auf die Gelenkfläche schnell und einfach in ImageJ gemessen. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die mechanischen Anfälligkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten von Ausmaß und die Auswirkungen der Belastungsintensität betroffen war. Insbesondere verschärft höhere Last Magnituden und höhere Auswirkungen Intensitäten deutlich die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung im Oberschenkelknochen und Humeri (Abbildung 3).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der benutzerdefinierten mechanische Prüfeinrichtung. (ein) montierte Gerät mit der zylindrischen Impaktor angewendet vorgeschriebenen mechanischen Belastungen und/oder Schlagenergien, ein Exemplar. Das Gerät wird ohne eine Probe angezeigt. (b) schematische Darstellung des Experiments. Kontrollierte statisch (z. B.0,1 N) und/oder Stoßbelastung (z.B. 1 mJ) kann auf der Oberseite der seziert Probe angewendet werden, so dass Gelenkknorpel gegen das Deckglas komprimiert wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Schliffbild der Gelenkfläche nach dem schädigenden mechanischen laden. Repräsentative Schliffbild artikuläre Oberfläche auf (einer) der distalen femoralen Kondylen und (b) des Humeruskopfes nach schädigenden mechanischen Belastung (Auswirkungen [1 mJ] und statische laden [1 N], beziehungsweise). Grüne Zellen sind von entscheidender Chondrozyten mit intakten Zellmembranen gefärbt, während rote Kerne verletzte Zellen mit permeabilized Zellmembranen zeigen. (c) Zoomed-im Blick auf die Umgebung des verletzten/toten Zellen (gelben Konturen) auf die Gelenkfläche des Humeruskopfes. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Bereich des verletzten/toten Zellen. Bereich des verletzten/toten Zellen auf der Gelenkfläche des distalen femoralen Kondylen (a, b) und des Humeruskopfes (c, d) nach (ein, c) statische (0,1 N, 0,5 N und 1 N; n = 6 pro Gruppe) und (b, d) Auswirkungen (1 mJ, 2 mJ und 4 mJ; n = 6 pro Gruppe) laden. Alle Knorpel-auf-Knochenproben wurden von weiblichen BALB/c 8-10 Wochen alten Mäusen erhalten. Daten sind Mittelwert + Standardabweichung; Klammern bezeichnen die statistische Signifikanz bei α = 0,05 durch Varianzanalyse (ANOVA) Test mit Tukey post Hoc Vergleiche bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Die oben beschriebenen Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um tragfähige und verletzten/Toten in Situ artikuläre Chondrozyten aus Maus Gelenke nach mechanischen Belastungen oder Auswirkungen vorgeschrieben zu visualisieren. Insbesondere konnten wir die mechanischen Anfälligkeit der Chondrozyten innerhalb voll intakten Gelenkknorpel aus zwei verschiedenen synovialen Gelenke zu analysieren: das Kniegelenk (distalen Oberschenkelknochen) und Schulter (Humeri). Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung an der Gelenkfläche sensibel hängt von Ausmaß und die Auswirkungen Belastungsintensität (Abbildung 3). Wichtig ist, erleichtert die Verwendung dieser Methode Untersuchungen der zelluläre Reaktion auf mechanische Belastung unter physiologisch relevanten Bedingungen. Das heißt, es ermöglicht das Testen der Gelenkknorpel auf einem intakten gemeinsame unter physiologischen und Supraphysiological lädt (siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 2).
Da die steile Lernkurve bei der Durchführung von Sezierungen murinen synovialen Gelenke und Herausforderungen bei der Erhaltung rentabel in Situ Chondrozyten an der Basislinie, einige Protokoll-Modifikation und Problembehandlung sein erforderlich. Das größte Risiko von schädlichen artikuläre Chondrozyten während Dissektion tritt während der Schritte 2.3.5 durch 2.3.10 und 2.4.5 durch 2.4.7. Um Verletzungen/Zelltod während Dissektionen zu minimieren, sollte der Forscher jeglichen Kontakt zwischen chirurgische Instrumente (z.B. das Skalpell beim Schneiden des Gewebes oder der Juwelier Zange beim Entfernen der Weichteile) und die Gelenkfläche der Probe vermeiden . Berühren der Gelenkfläche mit einem Handschuh induziert jedoch kleine Zelle Verletzung/Tod. Um die Basislinie Zellviabilität zu verbessern, kann es auch notwendig, die Reduzierung der Weichgewebe aus dem Gelenk entfernt sein. Darüber hinaus verringert sich mit feineren Werkzeugen in der Regel Dissektion-induzierte Zelltod. Letztlich, um das Fehlen der Dissektion-assoziierten Schäden der Gelenkknorpel Chondrozyten bei Studienbeginn rigoros zu bestätigen, ist es ratsam, die Exemplare mit beiden Durchlässigkeit Farbstoffe färben (Calcein AM und PI, vor der Verladung) besonders während der Forscher mit der Dissektion Verfahren vertraut zu machen (siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 3).
Angesichts der geringen Größe des Maus-Gelenks und der genetischen Manipulierbarkeit des Maus-Genoms, bieten murine Modelle mehrere Vorteile gegenüber großen Tiermodellen, Anfälligkeit der Gelenkknorpel Chondrozyten für mechanische Belastung zu studieren. Jedoch wurden die Autoren wissen, keine Studien zuvor durchgeführt um Verletzung/Tod von in Situ artikuläre Chondrozyten durch mechanische Belastung des intakten murinen Knorpel zu quantifizieren. Forscher verwenden in der Regel Explantaten aus Gelenke von großen Tiermodellen entfernt, inwieweit der Zelltod durch mechanische Verletzungen3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. Demgegenüber Mausmodellen erleichtern 1) Visualisierung der fast die gesamte Gelenkfläche auf einen bestimmten Knochen; und 2) Analysen nach dem Be- bzw. Post-Auswirkungen Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit in intakten Gelenken ohne native Randbedingungen. Darüber hinaus generieren, während komprimiert, Maus Proben wesentlich kleinere Kontaktflächen im Vergleich zu großen Tiermodellen; Daher sind Spannungen drastisch höher als bei großen Tiermodelle für eine gegebene Belastung Größenordnung. Daher kann Zelle Verletzung durch kleinere Lasten induziert werden. Darüber hinaus murinen Modelle erleichtern Forschung auf Knorpel-Degeneration, und insbesondere, Arthrose, als diese Krankheit induziert werden kann leicht in den Mäusen durch genetische19,20,21, 22, diätetische23,24 oder chirurgischen Manipulationen25,26,27,28. Darüber hinaus tritt spontane Arthrose in mehreren Mausstämme einschließlich BALB/c und C57BL/629,30.
In unseren repräsentativen Daten verwendet wir Lebensfähigkeit (lebenden/Toten) Flecken, um Verletzungen/Zelltod 5 min nach dem Entfernen der mechanischen Belastung zu quantifizieren. Wir anerkennen, dass diese Experimente nicht verletzte Zellen (Zellen mit vorübergehend gerissenen Membranen) unterscheiden können von abgestorbenen Zellen (Zellen mit dauerhaft Brüche Membranen). Das heißt, Zellen, die calcein negativ sind, und PI positiv-darauf hinweist, dass die Membran war zuvor permeabilized Mai Reparatur ihrer Membranen im Laufe der Zeit Skalen bis hin zu mehreren Minuten31Sekunden. In der Tat in einem separaten Satz von Experimenten, wir haben festgestellt, dass der Anteil der "verletzten" Zellen, die überleben, mechanische Trauma kleine (~ 5 %) ist aber bedeutend (siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 4). Daher ist die lebenden/Toten Färbung ein direktes Maß für Membran-Integrität, die nicht immer der Zellviabilität bezeichnend ist. Insbesondere sind PI-Positive und Calcein-Negative Zellen am treffendsten als "geschädigter" wo Verletzung ist definiert als ein (möglicherweise temporäre) Verlust der Integrität der Plasmamembran durch mechanische Trauma, definiert. Wir erkennen auch, dass unsere repräsentativen Daten wahrscheinlich nur unmittelbare (nekrotische) Zelltod widerspiegelt. Imaging-Exemplare zu späteren Zeitpunkten (z. B.48 h nach Entfernung der Last) dürfte die Quantifizierung der beiden nekrotische und apoptotischen Zelltod.
Bei Verwendung dieser Methoden sind einige Einschränkungen zu berücksichtigen. In unserer Studie Experimente für diese Handschrift haben wir 8-10 Wochen alten weibliche BALB/c Mäusen zeigen die Fähigkeiten der Testplattform (Abbildung 3). Jedoch durch spürbare Veränderungen im Zelldichte im Oberschenkelknochen der ältere Mäuse, die Bewertung der Belastung-induzierte Zelle Verletzung wird schwieriger (wenn möglich) in älteren Oberschenkelknochen (Erfolgsquote = 40 %). Im Gegensatz dazu verzeichneten keine spürbaren Veränderungen in Zelldichte auf Humeri 61-81-Woche-alten C57BL/6 Mäusen (siehe ergänzende Datei 1: Abschnitt 5), wodurch die Testplattform für nützlich machen im Alter von 8-81 Wochen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Methode verwendet wurde, um die räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung nur auf die Gelenkfläche des femoralen Kondylen und Humeruskopfes zu analysieren. Jedoch könnte die Methode weiter verlängert werden, um tiefenabhängige räumliche Ausdehnung der Zelle Verletzung durch Einsatz von Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie zu analysieren. Beachten Sie, dass die letztere Methode Verwendung teurer Ausrüstungen, Bild Erwerb länger und mehr beteiligt und zeitaufwendige Analyse erfordern würde. Zwar die Kontakt Lage zwischen den Gelenkknorpel und dem Deckglas physiologisch relevanten für Mäuse32,33, wurde dieser Ort schließlich nicht variiert. Jedoch ermöglicht unsere Testplattform Variation des Standortes Kontakt Wenn das Femur oder Humerus mit einem rotierenden Anker gegriffen wird.
Zusammenfassend haben wir eine in Vitro murinen Verletzungen-Modell entwickelt, die ermöglicht die Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen und/oder Auswirkungen auf die Gelenkfläche des intakten Gelenkknorpel. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung von Eindringmittel beschrifteten artikuläre Chondrozyten in Echtzeit und schnelle einzelne Image-basierte Analyse der Zelle Verletzung/Tod. Wichtig ist, können mit dieser Methodik die Auswirkungen der unterschiedlichen mechanischen Belastungen Regimen, verschiedenen Umweltbedingungen oder verschiedene genetische Manipulationen auf kurz- bzw. langfristigen Knorpelzelltransplantation Lebensfähigkeit getestet werden. Unsere Plattform bietet somit, ein Werkzeug, um grundlegende wissenschaftliche Fragen und Bildschirm therapeutische Ziele im Zusammenhang mit der mechanischen Anfälligkeit der Chondrozyten zu befragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Dr. Richard Waugh und Luis Delgadillo danken für die großzügige Verwendung von ihre pH-Meter und XR. Darüber hinaus möchte die Autoren Andrea Lee danken für Ihren Beitrag an die anfängliche Entwicklung der mechanischen Testsystem. Diese Studie wurde von NIH P30 AR069655 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg , Eugene, OR, USA |
| Propidium Iodide | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA |
| HBSS (calcium, magnesium, no phenol red) | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA |
| Feather surgical blade (#11) | VWR | 102097-822 | Hatfield, PA, USA |
| Vapor pressure osmometer, VAPRO | ELITechGroup | Model 5520 | Puteaux, France |
| pH meter | Beckman | Model Phi 32 | Brea, CA, USA |
| Eppendorf thermomixer | Eppendorf AG | Model 5350 | Hamburg, Germany |
| Motorized inverted research microscope | Olypmus | Model IX-81 | Center Valley, PA, USA |
| Wooden applicator | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100, Guilford, ME, USA |
| 1.5 Glass coverslips | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA |
References
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211 (2010).
- Pallante, A. L., et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. American Journal of Sports Medicine. 40 (8), 1814-1823 (2012).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Ewers, B. J., Dvoracek-Driksna, D., Orth, M. W., Haut, R. C. The extent of matrix damage and chondrocyte death in mechanically traumatized articular cartilage explants depends on rate of loading. Journal of Orthopaedic Research. 19 (5), 779-784 (2001).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Issa, R., Boeving, M., Kinter, M., Griffin, T. M. Effect of biomechanical stress on endogenous antioxidant networks in bovine articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 760-769 (2018).
- Bartell, L. R., Fortier, L. A., Bonassar, L. J., Cohen, I. Measuring microscale strain fields in articular cartilage during rapid impact reveals thresholds for chondrocyte death and a protective role for the superficial layer. Journal of Biomechanics. 48 (12), 3440-3446 (2015).
- Levin, A. S., Chen, C. T., Torzilli, P. A. Effect of tissue maturity on cell viability in load-injured articular cartilage explants. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (6), 488-496 (2005).
- Lee, W., et al. Synergy between Piezo1 and Piezo2 channels confers high-strain mechanosensitivity to articular cartilage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jeffrey, J. E., Gregory, D. W., Aspden, R. M. Matrix damage and chondrocyte viability following a single impact load on articular cartilage. Archives of Biochemistry and Biophysics. 322 (1), 87-96 (1995).
- Chen, C. T., Bhargava, M., Lin, P. M., Torzilli, P. A. Time, stress, and location dependent chondrocyte death and collagen damage in cyclically loaded articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 21 (5), 888-898 (2003).
- Morel, V., Mercay, A., Quinn, T. M. Prestrain decreases cartilage susceptibility to injury by ramp compression in vitro. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (11), 964-970 (2005).
- Sauter, E., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O., Martin, J. A. Cytoskeletal dissolution blocks oxidant release and cell death in injured cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 30 (4), 593-598 (2012).
- Martin, J. A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of stress induced chondrocyte damage. Biorheology. 43 (3,4), 517-521 (2006).
- Martin, J. A., Brown, T., Heiner, A., Buckwalter, J. A. Post-traumatic osteoarthritis: the role of accelerated chondrocyte senescence. Biorheology. 41 (3-4), 479-491 (2004).
- Kotelsky, A., Woo, C. W., Delgadillo, L. F., Richards, M. S., Buckley, M. R. An Alternative Method to Characterize the Quasi-Static, Nonlinear Material Properties of Murine Articular Cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (1), (2018).
- Zhang, M., et al. Induced superficial chondrocyte death reduces catabolic cartilage damage in murine posttraumatic osteoarthritis. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2893-2902 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Habouri, L., et al. Deletion of 12/15-lipoxygenase accelerates the development of aging-associated and instability-induced osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (10), 1719-1728 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Conditional knockdown of hyaluronidase 2 in articular cartilage stimulates osteoarthritic progression in a mice model. Scientific Reports. 7 (1), 7028 (2017).
- Zhu, M., et al. Activation of beta-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult beta-catenin conditional activation mice. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (1), 12-21 (2009).
- Hu, K., et al. Pathogenesis of osteoarthritis-like changes in the joints of mice deficient in type IX collagen. Arthritis & Rheumatology. 54 (9), 2891-2900 (2006).
- Mooney, R. A., Sampson, E. R., Lerea, J., Rosier, R. N., Zuscik, M. J. High-fat diet accelerates progression of osteoarthritis after meniscal/Ligamentous injury. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), R198 (2011).
- Griffin, T. M., Huebner, J. L., Kraus, V. B., Yan, Z., Guilak, F. Induction of osteoarthritis and metabolic inflammation by a very high-fat diet in mice: effects of short-term exercise. Arthritis & Rheumatology. 64 (2), 443-453 (2012).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Huang, H., Skelly, J. D., Ayers, D. C., Song, J. Age-dependent Changes in the Articular Cartilage and Subchondral Bone of C57BL/6 Mice after Surgical Destabilization of Medial Meniscus. Scientific Reports. 7, 42294 (2017).
- Hamada, D., Sampson, E. R., Maynard, R. D., Zuscik, M. J. Surgical induction of posttraumatic osteoarthritis in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1130, 61-72 (2014).
- Wilhelmi, G., Faust, R. Suitability of the C57 black mouse as an experimental animal for the study of skeletal changes due to ageing, with special reference to osteo-arthrosis and its response to tribenoside. Pharmacology. 14 (4), 289-296 (1976).
- Stoop, R., et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57Bl/6 and BALB/c mice. Arthritis & Rheumatism. 42 (11), 2381-2389 (1999).
- McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (6), 499-505 (2005).
- Adebayo, O. O., et al. Kinematics of meniscal- and ACL-transected mouse knees during controlled tibial compressive loading captured using roentgen stereophotogrammetry. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 353-360 (2017).
- Vahedipour, A., et al. Uncovering the structure of the mouse gait controller: Mice respond to substrate perturbations with adaptations in gait on a continuum between trot and bound. Journal of Biomechanics. , (2018).
