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Bioengineering

वास्तविक समय दृश्य और पूरी तरह से बरकरार Murine उपास्थि Explants में यांत्रिक लदान के कारण Chondrocyte चोट का विश्लेषण

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

Summary

हम नियंत्रित यांत्रिक भार या प्रभावों के आवेदन के बाद बरकरार murine जोड़ों की जोड़दार सतह पर सेल चोट/मौत की स्थानिक सीमा का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि कैसे पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस, आनुवंशिक कारकों और/या विभिंन लोडिंग परहेजों सीटू chondrocytes में की भेद्यता को प्रभावित की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

जोड़दार उपास्थि के Homeostasis निवासी कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर निर्भर करता है (chondrocytes). दुर्भाग्य से, यांत्रिक आघात व्यापक chondrocyte मौत पैदा कर सकते हैं, संभवतः संयुक्त और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस की शुरुआत के अपरिवर्तनीय टूटने के लिए अग्रणी । इसके अतिरिक्त, chondrocyte व्यवहार्यता का रखरखाव इष्टतम शल्य परिणामों के लिए osteochondral भ्रष्टाचार प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण है । हम नियंत्रित यांत्रिक भार या प्रभावों के आवेदन के बाद बरकरार murine श्लेष जोड़ों की जोड़दार सतह पर सेल चोट/मौत की स्थानिक सीमा का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि के तुलनात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है विभिंन यांत्रिक लोडिंग परहेजों, विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों या आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव की जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में कम पर उपास्थि अध... की भेद्यता में सीटू जोड़दार chondrocytes. पांडुलिपि में पेश प्रोटोकॉल का लक्ष्य murine श्लेष जोड़ों की जोड़दार सतह पर कोशिका की चोट/मौत की स्थानिक सीमा का आकलन करने के लिए है । महत्वपूर्ण बात, इस विधि देशी सीमा शर्तों समझौता किए बिना पूरी तरह बरकरार उपास्थि पर परीक्षण सक्षम बनाता है । इसके अलावा, यह वास्तविक समय दृश्य के लिए अनुमति देता है जीवन शक्ति के दाग जोड़दार chondrocytes और एकल छवि आधारित कक्ष चोट के विश्लेषण पर नियंत्रण स्थिर और प्रभाव लोड हो रहा है परहेजों के आवेदन द्वारा प्रेरित । हमारे प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करते है कि स्वस्थ उपास्थि explants में, सेल चोट की स्थानिक सीमा लोड परिमाण और प्रभाव तीव्रता पर संवेदनशील निर्भर करता है । हमारे विधि आसानी से विभिंन यांत्रिक लोडिंग परहेजों के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों या विभिंन आनुवंशिक जोड़तोड़ के यांत्रिक भेद्यता पर सीटू जोड़दार chondrocytes में ।

Introduction

जोड़दार उपास्थि (AC) एक भार असर ऊतक है कि कवर और श्लेष जोड़ों में हड्डियों की रक्षा, चिकनी संयुक्त अभिव्यक्ति प्रदान कर रहा है. टिशू homeostasis एसी में रहने वाले एकमात्र कोशिका प्रकार chondrocytes की व्यवहार्यता पर निर्भर है । हालांकि, चरम आघात के कारण बलों को उपास्थि के जोखिम (जैसे, गिरता है, वाहन दुर्घटना या खेल चोटों) या बाद के कारण दर्दनाक संयुक्त अस्थिरता chondrocyte मौत पैदा कर सकते हैं, संयुक्त (पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस) के अपरिवर्तनीय टूटने के लिए अग्रणी 1. इसके अलावा, osteochondraling प्रक्रियाओं है कि क्षतिग्रस्त उपास्थि में स्थानीय दोषों की मरंमत के उद्देश्य के लिए, भ्रष्टाचार प्रविष्टि जुड़े यांत्रिक आघात chondrocyte व्यवहार्यता कम कर देता है और शल्य परिणाम2पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है ।

उपास्थि explant मॉडल सामान्यतः जोड़दार chondrocytes की संवेदनशीलता को यांत्रिक रूप से प्रेरित कोशिका मृत्यु का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन मॉडलों को आम तौर पर बड़े जानवरों से explants का उपयोग करने के लिए लोड हो रहा है शर्तों के प्रभाव का अध्ययन, पर्यावरण की स्थिति और सेल भेद्यता पर अंय कारकों3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15। हालांकि, देशी जोड़ों के बड़े आकार के कारण, इन मॉडलों को आम तौर पर एक बरकरार संयुक्त की जोड़दार सतह से एक प्लग को हटाने की आवश्यकता है, जिससे देशी सीमा शर्तों समझौता । इसके अलावा, वे आम तौर पर सेल चोट प्रेरित करने के लिए बड़े यांत्रिक भार के आवेदन की आवश्यकता है । वैकल्पिक रूप से, murine उपास्थि explant मॉडल सीटू chondrocytes में यांत्रिक भेद्यता का अध्ययन करने में बड़े पशु मॉडलों पर कई लाभ प्रदान करते हैं. विशेष रूप से, उनके छोटे आयामों के कारण, इन मॉडलों देशी ऊतक अखंडता फेरबदल के बिना पूरी तरह बरकरार जोड़दार उपास्थि के परीक्षण की सुविधा । इसके अलावा, murine उपास्थि की लोडिंग छोटे से संपर्क क्षेत्रों पर होता है ऐसी है कि chondrocyte मृत्यु/चोट छोटे भार (< 1 N) के साथ प्रेरित किया जा सकता है । अंत में, माउस जीनोम आसानी से हेरफेर है, कैसे विशिष्ट जीन के परीक्षण को सक्षम करने के लिए यांत्रिक चोट के लिए सीटू chondrocytes में की संवेदनशीलता को प्रभावित ।

इस पांडुलिपि में शुरू की विधि का समग्र लक्ष्य है और कल्पना है-वास्तविक समय में-की स्थानिक हद तक सीटू कोशिका मृत्यु/पर लागू यांत्रिक भार के कारण पूरी तरह बरकरार माउस उपास्थि पर हड्डी explants इन विट्रो में. इस विधि chondrocyte व्यवहार्यता समझौता बिना माउस श्लेष जोड़ों के सावधान विच्छेदन की आवश्यकता है, महत्वपूर्ण रूप से सना हुआ explants के यांत्रिक परीक्षण के बाद एक माइक्रोस्कोप-घुड़सवार एक परीक्षण मंच है कि हम हाल ही में विकसित के समान डिवाइस का उपयोग murine उपास्थि यांत्रिक गुणों को बढ़ाता है16. यांत्रिक परीक्षण के दौरान, विच्छेदित हड्डी के (बरकरार) जोड़दार सतह का एक बड़ा हिस्सा एक एकल प्रतिदीप्ति micrograph पर दिखाई देता है, एक लोड लागू होने के बाद कोशिका व्यवहार्यता के तेजी से विश्लेषण को सक्षम करने. murine उपास्थि explants में सतह कोशिका व्यवहार्यता का एक समान विश्लेषण पहले किया गया है, लेकिन17लोड के एक साथ आवेदन के बिना. हमारे विधि के संभावित अनुप्रयोगों अलग नियंत्रित पर्यावरणीय और यांत्रिक स्थितियों के लिए जोड़दार chondrocytes की भेद्यता की जांच करने के लिए तुलनात्मक अध्ययन में शामिल हैं, साथ ही संवेदनशीलता को कम करने के उद्देश्य से उपचार की स्क्रीनिंग यांत्रिक लोडिंग के लिए chondrocytes ।

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Protocol

पशु संसाधनों पर विश्वविद्यालय रोचेस्टर समिति द्वारा सभी पशु कार्य स्वीकृत किए गए ।

1. समाधान

  1. तैयार है हांक संतुलित नमक समाधान (1x HBSS) युक्त कैल्शियम, मैग्नीशियम और कोई phenol लाल । एचसीएल या NaOH की छोटी मात्रा को जोड़कर पीएच को ७.४ पर एडजस्ट करें ।
  2. osmolarity को ३०३ mOsm को NaCl या जल से जोड़कर समायोजित करें । विच्छेदन, नमूना तैयारी और यांत्रिक परीक्षण के दौरान बफर का प्रयोग करें ।

2. पूरी तरह बरकरार जोड़दार उपास्थि के साथ बाहर फीमर और समीपस्थ Humerus के विच्छेदन

  1. Euthanize एक सह2 साँस लेना चैंबर ग्रीवा विस्थापन के बाद का उपयोग संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार माउस । भर अपूतित तकनीक का पालन करें ।
    नोट: 8 और ८१ के बीच चूहों किसी भी तनाव और सेक्स के पुराने सप्ताह इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. विच्छेदन के लिए निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों का प्रयोग करें: सूक्ष्म कैंची (चीरा बनाने के लिए इस्तेमाल किया), मानक विदारक कैंची (हड्डी काटने के लिए इस्तेमाल किया), #11 स्केलपेल ब्लेड के साथ स्केलपेल (नरम ऊतक काटने के लिए इस्तेमाल किया), जौहरी संदंश (मुलायम को हटाने के लिए इस्तेमाल किया ऊतक) और मानक संदंश (कोमल ऊतक और त्वचा छीलने के लिए इस्तेमाल किया) ।
  3. बाहर फीमर के विच्छेदन के लिए नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
    1. एक लापरवाह स्थिति में माउस की स्थिति ।
    2. एक छोटे (~ 5 मिमी) घुटने के पूर्वकाल हिस्से पर त्वचा में चीरा बनाओ ।
    3. चीरा घुटने के आसपास सभी तरह का विस्तार और वापस त्वचा घुटने संयुक्त और पैर की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए खींच ।
    4. फीमर के समीपस्थ अंत से शुरू, बाहर की दिशा के साथ कटौती करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड (#11) का उपयोग करें । quadriceps मांसपेशी-पट्टा इकाई और ऊरु शाफ्ट के पूर्वकाल पक्ष के बीच ब्लेड स्थिति । की ओर और patellar पट्टा के बीच के माध्यम से काटने के द्वारा वुटने और खत्म अतीत की कटौती का विस्तार, जिससे quadriceps मांसपेशी-पट्टा इकाई को हटाने ।
    5. फीमर के समीपस्थ अंत से शुरू, बाहर की दिशा के साथ कटौती करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड (#11) का उपयोग करें । स्थिति काटना मांसपेशियों के बीच ब्लेड-पट्टा इकाई और ऊरु शाफ्ट के पीछे की ओर । एक बार कटौती घुटने संयुक्त दृष्टिकोण, नरम ऊतक के माध्यम से काटने शुरू, स्केलपेल और फीमर के बाहर condyles पर जोड़दार सतह के बीच संपर्क से परहेज । घुटने संयुक्त पिछले कटौती खत्म करो ।
    6. वापस quadriceps और दौडऩे की मांसपेशियों को फीमर बेनकाब खींचो । दूर फीमर के पार्श्व और औसत दर्जे का पक्षों पर किसी भी अतिरिक्त मांसपेशी काट ।
    7. समीपस्थ टिबिया के पीछे की ओर बछड़ा मांसपेशियों में कटौती और पैर फ्लिप फीमर के पीछे की ओर कल्पना ।
    8. घुटने के जोड़ के आसपास अतिरिक्त ऊतक को हटाने के द्वारा समीपस्थ टिबिया के फीमर और पीछे की सतह के बाहर condyles बेनकाब ।
    9. पूर्वकाल और पीछे cruciate एक स्केलपेल का उपयोग कर बंधन कट, ऊरु condyles से दूर काटना । टिबिया को फीमर से दूर खींचो और फीमर से निचले पैर को अलग करने के लिए सभी बंधनों को काट लें ।
    10. मानक विदारक कैंची का प्रयोग, हड्डी के समीपस्थ अंत में फीमर के माध्यम से कट (8 tibio-ऊरु संयुक्त के ऊपर मिमी) पार्श्व पक्ष से । हड्डी काटने के बाद, दूर अस्थि मज्जा कोशिकाओं से संभावित संक्रमण से बचने के लिए हड्डी के बाहर पर किसी भी दिखाई मज्जा पोंछ ।
      नोट: पार्श्व की ओर से काटना हड्डी के साथ दरार प्रसार के जोखिम को कम कर देता है ।
    11. फीमर से जौहरी संदंश का उपयोग कर और फीमर के बाहर के छोर पर दोनों condyles पर उपास्थि बेनकाब नरम ऊतकों (यानी, बंधन और अतिरिक्त मांसपेशी) आसपास निकालें । उपास्थि और संदंश के बीच संपर्क से बचें ।
  4. humerus के विच्छेदन के लिए नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
    1. एक लापरवाह स्थिति में माउस की स्थिति ।
    2. कोहनी के पीछे की ओर पर त्वचा में एक चीरा (~ 5 मिमी) बनाओ माइक्रो कैंची का उपयोग, कोहनी के आसपास चीरा का विस्तार और वापस त्वचा हाथ और कंधे की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए खींच.
    3. humerus के समीपस्थ अंत से शुरू, बाहर की दिशा के साथ कटौती करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड (#11) का उपयोग करें । स्थिति triceps मांसपेशी-पट्टा इकाई और humerus के पीछे की ओर के बीच ब्लेड । humerus के बाहर के अंत की ओर कटौती का विस्तार और triceps पट्टा के माध्यम से काटने के द्वारा समाप्त ।
    4. तब तक humerus के समीपस्थ छोर की ओर triceps वापस खींच जब तक humeral सिर उजागर है ।
    5. जोड़दार सतह को छूने और शरीर से अंग (हाथ और कंधे) को हटाने के बिना एक स्केलपेल ब्लेड (#11) का उपयोग कर humeral सिर के आसपास संयोजी ऊतक काटें । HBSS के साथ humeral सिर की जोड़दार सतह को समय पर हाइड्रेट करे ।
    6. संदंश का उपयोग कर बांह के पीछे की ओर ulna के समीपस्थ अंत को तोड़ने और फिर humerus के बाहर के छोर के आसपास संयोजी ऊतक काटने से पहले हाथ से humerus डिस्कनेक्ट । humerus पर किसी भी अतिरिक्त ऊतक निकालें ।
    7. मानक विदारक कैंची का उपयोग कर humerus के पीछे की ओर तिकोना tuberosity कट ।
  5. HBSS बफर युक्त एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में विच्छेदित नमूना (ओं) रखें ।

3. Live (Calcein AM)/डेड (Propidium आयोडाइड) दाग प्रोटोकॉल

  1. calcein का उपयोग दाग के रूप में इस प्रकार हूं ।
    1. calcein के एक शेयर समाधान बनाओ १२.५ DMSO के ५० µ जी की एक शीशी में dimethyl sulfoxide (calcein) के µ एल जोड़कर हूं, 4 मिलीग्राम/एमएल (४.०२ मिमी) के एक शेयर एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप ।
    2. HBSS में शेयर calcein समाधान 1:400 कैल्शियम की 10 µ जी/एमएल (१०.०५ µ एम) की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए (उदाहरण के लिए, शेयर समाधान के १.२५ µ एल जोड़ने के लिए ५०० µ एल के HBSS) ।
    3. 5 एस के लिए पतला धुंधला समाधान २,००० x g पर सुनिश्चित करने के लिए कि डाई, जो कभी ट्यूब की दीवारों से चिपके रहते हैं, बफर के साथ घोला जा सकता है के सभी । supernatant को न निकालें । भंवर उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए समाधान ।
    4. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में विच्छेदित नमूना रखो ५०० पतला धुंधला समाधान के µ l युक्त । ८०० rpm पर आंदोलन करते हुए एक thermomixer में 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन । सुनिश्चित करें कि ट्यूबों एल्यूमीनियम पंनी में प्रकाश को जोखिम से बचाने के लिए कवर कर रहे हैं ।
    5. calcein AM मुक्त HBSS बफर में नमूना हस्तांतरण. इस बिंदु पर, नमूना यांत्रिक परीक्षण के लिए तैयार है ।
  2. propidium आयोडाइड (PI) धुंधला समाधान निम्नानुसार तैयार करें ।
    1. कमजोर खरीदे गए स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल, १.५ मिमी) 1:25 HBSS में pi के ४० µ g/एमएल (६० µ m) तक पहुंचने के लिए pi धुंधला समाधान तैयार करें । उदाहरण के लिए, स्टॉक समाधान के ४० µ l को HBSS के १००० µ l में जोड़ें.
    2. PI धुंधला एल्यूमीनियम पंनी में शामिल समाधान प्रकाश करने के लिए जोखिम से बचाने के लिए रखें । घायल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए यांत्रिक परीक्षण के तुरंत बाद धुंधला समाधान का उपयोग करें (अनुभाग 4 देखें).
      नोट: एक के रूप में अच्छी तरह से अधिक कड़ाई से विच्छेदन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए लोड करने से पहले PI धुंधला प्रदर्शन कर सकते हैं ।

4. यांत्रिक परीक्षण प्रोटोकॉल

  1. एक कस्टम माइक्रोस्कोप के गिलास स्लाइड पर नमूना (फीमर या humerus) प्लेस-यांत्रिक परीक्षण डिवाइस घुड़सवार इस तरह कि पीछे ऊरु condyles या humeral सिर पर जोड़दार सतह कांच पर बैठा है (चित्रा 1) ।
    नोट: फ्लैट सतह पर नमूना को स्थिर करने के लिए डिवाइस पर यह रखने से पहले cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर humerus के बाहर की ओर करने के लिए एक 10 मिमी लंबे लकड़ी applicator (व्यास = 2 मिमी) जकड़ना. यांत्रिक परीक्षण मंच के एक विस्तृत वर्णन के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1देखें: अनुभाग 1 ।
  2. HBSS के साथ नमूना हाइड्रेट और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर नमूना के साथ डिवाइस जगह है.
  3. छवि जोड़दार chondrocytes calcein AM के साथ सना हुआ (उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य = 495/515 एनएम) से पहले (आधारभूत) एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत लोड के आवेदन के साथ एक 4x सूखी लेंस (NA = ०.१३) । छवि गुणवत्ता ऑप्टिमाइज़ करने के लिए प्राप्ति सेटिंग्स समायोजित करें ।
  4. इस तरह के नमूने के शीर्ष पर यांत्रिक लदान लागू करें कि जोड़दार उपास्थि कवर ग्लास के खिलाफ संकुचित है.
    1. स्थैतिक लोड हो रहाहै के लिए, एक निर्धारित स्थैतिक लोड (उदा, ०.५ N) के शीर्ष पर (फीमर या humerus) नमूना लागू होते हैं । 5 मिनट के लिए लोड पकड़ो और फिर इसे हटा दें ।
    2. प्रभावके लिए, एक निर्धारित ऊंचाई (जैसे, 1 सेमी) से ज्ञात वजन का एक बेलनाकार प्रभाव (जैसे, ०.१ N) छोड़ने केद्वारा नमूना पर एक निर्दिष्ट प्रभाव ऊर्जा (जैसे, 1एम.ए.) लागू होते हैं । प्रभाव के बाद लोड 5 एस छोड़ें ।
      नोट: प्रभाव का वजन (mg) और निर्धारित ऊंचाई (h) प्रभाव ऊर्जा में परिवर्तित किया जा सकता (e) निम्न समीकरण का उपयोग कर: e = mgh.
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए PI धुंधला समाधान में नमूना मशीन ।
  6. छवि जोड़दार chondrocytes calcein AM और PI के साथ सना हुआ (उत्तेजना/उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य = 535/617 एनएम) एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत (चित्रा 2) ।

5. डेटा विश्लेषण

  1. एप्लाइड यांत्रिक लोडिंग आहार के कारण घायल/मृत कोशिकाओं के क्षेत्र को बढ़ाता है ।
    1. ImageJ18में यांत्रिक भार के आवेदन के पहले और बाद में प्राप्त जोड़दार सतह के माइक्रोग्राफ को खोलें ।
    2. एक ढेर में छवियों का मिश्रण ।
    3. छवि संकल्प के आधार पर छवियों के पैमाने पर सेट करें ।
    4. उस क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करें जहां कक्ष calcein-ऋणात्मक (ग्रीन प्रतिदीप्ति की हानि) और PI-धनात्मक (red प्रतिदीप्ति का लाभ) बने । इन कोशिकाओं को घायल या मृत माना जाता है ।
    5. माप उपकरण का उपयोग करके घायल/मृत कोशिकाओं के क्षेत्र का निर्धारण ।

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Representative Results

छह अलग लागू लोड प्रोटोकॉल (स्थैतिक लोड हो रहा है: ०.१ n, ०.५ n और 1 n 5 मिनट के लिए, और प्रभाव लोड हो रहा है: 1 एम एम, 2 एम एम और 4 एम एम) reproducibly प्रेरित quantifiable कोशिका चोट के स्थानीयकृत क्षेत्रों में ऊरु और humeral उपास्थि से प्राप्त 8-10-सप्ताह पुराने बालब/ चित्रा 2) । महत्वपूर्ण बात, जोड़दार सतह पर chondrocyte चोट की स्थानिक सीमा ImageJ में जल्दी और आसानी से मापा गया था । प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि जोड़दार chondrocytes के यांत्रिक भेद्यता लोड परिमाण और प्रभाव तीव्रता से प्रभावित था । विशेष रूप से, उच्च लोड परिमाणों और उच्च प्रभाव तीव्रता काफी दोनों femurs और humeri (चित्रा 3) में सेल चोट की स्थानिक सीमा बढ़ाई ।

Figure 1
चित्रा 1 : कस्टम यांत्रिक परीक्षण उपकरण के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (क) एक नमूना के लिए निर्धारित यांत्रिक भार और/या प्रभाव ऊर्जा लागू करने के लिए इस्तेमाल किया बेलनाकार प्रभाव के साथ इकट्ठे डिवाइस । डिवाइस एक नमूना के बिना दिखाया गया है । (ख) प्रयोग के योजनाबद्ध निरूपण । स्थैतिक नियंत्रित (उदा., ०.१ N) और/या प्रभाव (जैसे, 1 एम एम) लोड हो रहा है कि जोड़दार उपास्थि कवर ग्लास के खिलाफ संकुचित है विच्छेदित नमूना के शीर्ष पर लागू किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : हानिकारक यांत्रिक लदान के बाद जोड़दार सतह के प्रतिनिधि micrograph । प्रतिनिधि micrograph पर जोड़दार सतह के (क) बाहर ऊरु condyles और (ख) humeral यांत्रिक लदान के बाद हानिकारक सिर (प्रभाव [1 माइकल] और स्थैतिक लोडहोरहा है [1 N], क्रमशः) । लाल नाभिक permeabilized कोशिका झिल्ली के साथ घायल कोशिकाओं का संकेत है, जबकि हरी कोशिकाओं बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ महत्वपूर्ण रूप से सना हुआ chondrocytes हैं । (ग) humeral सिर के जोड़दार सतह पर घायल/मृत कोशिकाओं (पीले रंग की आकृति) के क्षेत्र को देखते हुए ज़ूम-इन करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : घायलों/मृत कोशिकाओं के क्षेत्र । बाहर ऊरु condyles की जोड़दार सतह पर घायल/मृत कोशिकाओं के क्षेत्र (a, b) और humeral head (c, d) के बाद (a, c) स्थैतिक (०.१ n, ०.५ n और 1 n; n = 6 प्रति समूह) और (b, d) प्रभाव (1 एम. ए., 2 एम एम और 4 एम एम; n = 6 प्रति समूह) लोड हो रहा है । सभी उपास्थि पर अस्थि नमूनों महिला बालब से प्राप्त किया गया था/8-10 सप्ताह पुराने चूहों । डेटा का अर्थ है + मानक विचलन; कोष्ठक α पर सांख्यिकीय महत्व निरूपित = 0.05 Tukey पोस्ट हॉक तुलना के साथ प्रसरण (ANOVA) परीक्षण के विश्लेषण द्वारा निर्धारित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 1. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

उपरोक्त विधियों को सफलतापूर्वक निर्धारित यांत्रिक भार या प्रभावों के बाद माउस जोड़ों से सीटू जोड़दार chondrocytes में व्यवहार्य और घायल/मृत कल्पना करने के लिए कार्यरत थे । विशेष रूप से, हम दो अलग श्लेष जोड़ों से पूरी तरह से बरकरार जोड़दार उपास्थि के भीतर chondrocytes के यांत्रिक भेद्यता का विश्लेषण करने में सक्षम थे: घुटने संयुक्त (बाहर femurs) और कंधे (humeri). हमारे प्रतिनिधि परिणाम बताते है कि जोड़दार सतह पर सेल की चोट की स्थानिक सीमा लोड परिमाण और प्रभाव तीव्रता (चित्रा 3) पर संवेदनशील निर्भर करता है । महत्वपूर्ण बात, इस विधि का उपयोग शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत यांत्रिक लदान के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की जांच की सुविधा । यही है, यह शारीरिक और supraphysiological भार के तहत एक बरकरार संयुक्त पर जोड़दार उपास्थि के परीक्षण में सक्षम बनाता है ( अनुपूरक फ़ाइल 1: खंड 2 देखें) ।

murine श्लेष जोड़ों और आधारभूत पर सीटू chondrocytes में सक्षम बनाए रखने में चुनौतियों का प्रदर्शन करने में खड़ी सीखने की अवस्था को देखते हुए, कुछ प्रोटोकॉल संशोधन और समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है । विच्छेदन के दौरान हानिकारक जोड़दार chondrocytes का सबसे बड़ा जोखिम 2.3.10 और 2.4.5 के माध्यम से 2.4.7 के माध्यम से चरण -6 के दौरान होता है । विच्छेदन के दौरान कोशिका की चोट को कम करने के लिए, शोधकर्ता शल्य चिकित्सा उपकरण के बीच किसी भी संपर्क से बचना चाहिए (जैसे, स्केलपेल जब ऊतक या जौहरी के संदंश काटने जब नरम ऊतक हटाने) और नमूना की जोड़दार सतह . हालांकि, एक दस्ताने के साथ जोड़दार सतह को छूने थोड़ा सेल चोट लाती/ क्रम में आधारभूत कोशिका व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए, यह भी कोमल ऊतक की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है संयुक्त से हटा दिया । इसके अतिरिक्त, महीन उपकरण का उपयोग आम तौर पर विच्छेदन-प्रेरित कोशिका मृत्यु को कम करेगा । अंत में, कड़ाई से विच्छेदन के अभाव की पुष्टि करने के लिए, आधारभूत पर जोड़दार chondrocytes के जुड़े नुकसान, यह सलाह दी जाती है दोनों पारगम्यता रंजक (calcein AM और PI, लदान से पहले) के साथ नमूनों दाग विशेष रूप से जबकि शोधकर्ता है विच्छेदन प्रक्रिया से परिचित होना ( पूरक फ़ाइल 1: अनुभाग 3 देखें) ।

माउस संयुक्त और माउस जीनोम के आनुवंशिक manipulability के छोटे आकार को देखते हुए, murine मॉडल यांत्रिक लदान के लिए जोड़दार chondrocytes के जोखिम का अध्ययन करने के लिए बड़े पशु मॉडलों पर कई लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि, ' लेखकों के ज्ञान के लिए, कोई अध्ययन पहले से चोट यों तो नहीं किया गया है/सीटू जोड़दार बरकरार murine उपास्थि के यांत्रिक लदान के कारण chondrocytes में की मौत । जांचकर्ताओं आम तौर पर बड़े पशु मॉडल के जोड़ों से हटा explants का उपयोग करने के लिए यांत्रिक चोट3,4,5,6,7के कारण कोशिका मौत की सीमा की जांच, 8 , 9 , 10 , 11 , 12. इसके विपरीत, माउस मॉडल की सुविधा 1) एक दिया हड्डी पर लगभग पूरे जोड़दार सतह के दृश्य; और 2) देशी सीमा शर्तों समझौता किए बिना बरकरार जोड़ों में पोस्ट लोडिंग या पोस्ट प्रभाव chondrocyte व्यवहार्यता का विश्लेषण करती है । इसके अलावा, जबकि संकुचित, माउस नमूनों बड़े पशु मॉडलों की तुलना में काफी छोटे संपर्क क्षेत्रों उत्पन्न; इसलिए, तनाव नाटकीय रूप से एक दिया लोड परिमाण के लिए बड़े पशु मॉडलों की तुलना में अधिक हैं । इसलिए, कोशिका चोट छोटे भार से प्रेरित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, murine मॉडल उपास्थि अध... पर अनुसंधान की सुविधा और, विशेष रूप से, पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस, के रूप में इस रोग आसानी से आनुवंशिक के माध्यम से चूहों में प्रेरित किया जा सकता है19,20,21, २२, पथ्य२३,२४ या शल्य जोड़तोड़२५,२६,२७,२८. इसके अलावा, सहज पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस बालब/सी और C57BL सहित कई माउस उपभेदों में होता है/

हमारे प्रतिनिधि डेटा में, हम व्यवहार्यता का इस्तेमाल किया (जी/मृत) दाग के लिए सेल चोट मात्रा/ हम स्वीकार करते है कि इन प्रयोगों से घायल कोशिकाओं (अस्थायी रूप से उठी झिल्ली के साथ कोशिकाओं) मृत कोशिकाओं से (स्थायी रूप से झिल्ली टूटना के साथ कोशिकाओं) भेदभाव नहीं कर सकते. कि है, कोशिकाओं है कि calcein नकारात्मक और PI सकारात्मक संकेत है कि झिल्ली पहले permeabilized था-समय कई मिनट के लिए सेकंड से लेकर तराजू पर उनकी झिल्ली की मरंमत कर सकते है31। वास्तव में, प्रयोगों के एक अलग सेट में, हमने निर्धारित किया है कि यांत्रिक आघात से बच "घायल" कोशिकाओं के अंश छोटा है (~ 5%) लेकिन महत्वपूर्ण ( अनुपूरक फ़ाइल देखें 1: अनुभाग 4) । इसलिए, जीवित/मृत धुंधला झिल्ली अखंडता का एक सीधा उपाय है कि हमेशा कोशिका व्यवहार्यता का संकेत नहीं है । विशेष रूप से, PI-धनात्मक और calcein-ऋणात्मक कक्षों को "घायल" के रूप में सबसे उचित रूप से परिभाषित किया गया है, जहां यांत्रिक आघात के कारण प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के एक (संभावित रूप से अस्थायी) हानि के रूप में चोट को परिभाषित किया गया है । हम यह भी स्वीकार करते है कि हमारे प्रतिनिधि डेटा की संभावना केवल तत्काल (गल) कोशिका मृत्यु को दर्शाता है । बाद में समय अंक पर इमेजिंग नमूनों (जैसे, ४८ लोड हटाने के बाद ज) दोनों गल और अपोप्तोटिक कोशिका मौत के ठहराव सक्षम होना चाहिए ।

इन विधियों का उपयोग करते समय कई सीमाएं मानी जानी चाहिए । इस पांडुलिपि के लिए हमारे परीक्षण प्रयोगों में, हम परीक्षण मंच (चित्रा 3) की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए 8-10 सप्ताह पुरानी महिला बालब/ हालांकि, पुराने चूहों के femurs में कोशिका घनत्व में उल्लेखनीय परिवर्तन के कारण, लोड प्रेरित सेल चोट का आकलन अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है (हालांकि व्यवहार्य) पुराने femurs में (सफलता दर = ४०%) । इसके विपरीत, humeri पर सेल घनत्व में कोई ध्यान देने योग्य परिवर्तन 61-81 में मनाया गया सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों ( अनुपूरक फ़ाइल 1: धारा 5 देखें), जिससे उंर के लिए उपयोगी परीक्षण मंच बना 8-81 सप्ताह । एक और सीमा यह है कि विधि केवल ऊरु condyles और humeral सिर की जोड़दार सतह पर सेल चोट की स्थानिक सीमा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, विधि आगे लेजर फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के उपयोग के माध्यम से सेल चोट के गहराई पर निर्भर स्थानिक सीमा का विश्लेषण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । ध्यान दें कि बाद विधि और अधिक महंगा उपकरण के उपयोग की आवश्यकता होगी, अब छवि अधिग्रहण समय, और अधिक शामिल है और समय लेने वाली विश्लेषण । अंत में, यद्यपि जोड़दार उपास्थि और आवरण कांच के बीच संपर्क स्थान चूहों३२,३३के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक था, इस स्थान विविध नहीं था । हालांकि, हमारे परीक्षण मंच संपर्क स्थान की भिन्नता के लिए अनुमति देता है अगर फीमर या humerus एक घूर्णन कवच के साथ जकड़ लिया है ।

अंत में, हम इन विट्रो murine चोट मॉडल है कि नियंत्रित यांत्रिक भार और/या बरकरार जोड़दार उपास्थि के जोड़दार सतह पर प्रभावों के आवेदन सक्षम बनाता है में एक विकसित किया है । इस मॉडल में फ्लोरोसेंट लेबल जोड़दार chondrocytes का दृश्य सक्षम बनाता है वास्तविक समय और तेजी से एकल छवि सेल चोट के विश्लेषण आधारित/ महत्वपूर्ण बात, विभिंन यांत्रिक लोडिंग परहेजों के प्रभाव, विभिंन पर्यावरणीय स्थितियों या लघु पर विभिंन आनुवंशिक जोड़तोड़ और/या दीर्घकालिक chondrocyte व्यवहार्यता इस पद्धति का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है । इस प्रकार, हमारे मंच chondrocytes के यांत्रिक भेद्यता से संबंधित बुनियादी विज्ञान के सवालों और स्क्रीन चिकित्सकीय लक्ष्यों से पूछताछ करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ रिचर्ड वॉ और लुइस Delgadillo उनके पीएच मीटर और osmometer के उदार उपयोग के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अतिरिक्त, लेखक यांत्रिक परीक्षण प्रणाली के प्रारंभिक विकास में योगदान के लिए Andrea ली शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस अध्ययन NIH P30 AR069655 द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein, AM  Invitrogen by Thermo Fisher Scientific C3100MP 20x50mg , Eugene, OR, USA
Propidium Iodide Invitrogen by Thermo Fisher Scientific P3566 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)  Gibco by Thermo Fisher Scientific 14025-092 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Feather surgical blade (#11) VWR 102097-822 Hatfield, PA, USA
Vapor pressure osmometer, VAPRO ELITechGroup Model 5520 Puteaux, France
pH meter  Beckman Model Phi 32  Brea, CA, USA
Eppendorf thermomixer  Eppendorf AG  Model 5350 Hamburg, Germany
Motorized inverted research microscope Olypmus Model IX-81 Center Valley, PA, USA
Wooden applicator Puritan Medical Products Company, LLC 807 6"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Glass coverslips Warner Instruments, LLC 64-1696 #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA

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समस्या १४३ कोशिका मृत्यु chondrocytes उपास्थि माउस मॉडल स्थिर लोड हो रहा है प्रभाव आघात
वास्तविक समय दृश्य और पूरी तरह से बरकरार Murine उपास्थि Explants में यांत्रिक लदान के कारण Chondrocyte चोट का विश्लेषण
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Kotelsky, A., Carrier, J. S.,… More

Kotelsky, A., Carrier, J. S., Buckley, M. R. Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (143), e58487, doi:10.3791/58487 (2019).

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