Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

Hier presenteren we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de verwerking van codering (mRNA) en niet-coderende (ncRNA) globine verminderd RNA-seq bibliotheken uit een monster van één volbloed.

Abstract

De komst van innovatieve en steeds meer krachtige volgende generatie sequencing technieken heeft nieuwe wegen geopend in de mogelijkheid te onderzoeken van de onderliggende genexpressie gerelateerde biologische processen van belang. Deze innovaties kunnen niet alleen onderzoekers te observeren-expressie aan vanaf het mRNA-sequenties die voor de genen die cellulaire functie effect code, maar ook de niet-coderende (ncRNA) molecules van RNA die onvertaald, maar toch blijven hebben regelgevende taken. Hoewel onderzoekers de mogelijkheid hebben om zowel ncRNA als mRNA uitdrukking te observeren, is het gebruikelijk dat een studie te richten op de ene of de andere geweest. Als echter studies zijn zowel ncRNA als mRNA uitdrukking kochten, vele malen ze gebruiken afzonderlijke monsters te onderzoeken niet-coderende RNAs vanwege het verschil in bibliotheek preparaten of codering. Dit kan leiden tot de noodzaak van meer monsters die tijd, verbruiksartikelen en dieren stress kan verhogen. Bovendien kan het onderzoekers om te beslissen voor te bereiden op monsters slechts één analyse, meestal de mRNA, beperking van het aantal biologische vragen die kunnen worden onderzocht. Echter omspannen ncRNAs meerdere klassen met regelgevende functies die effect mRNA uitdrukking. Omdat ncRNA zijn belangrijk voor fundamentele biologische processen en wanorde van deze processen in tijdens de infectie, kunnen ze daarom aantrekkelijk dedoelenvoorde therapeutics doen. Dit manuscript toont een gewijzigd protocol voor de generatie mRNA en niet-coderende RNA expressie bibliotheken, met inbegrip van de virale RNA, van een enkel bloedmonster geheel. Optimalisatie van dit protocol, verbeterd RNA zuiverheid, verhoogd afbinding voor herstel van gemethyleerd RNAs en maat keuze, zodat de vangst van de meer RNA soorten weggelaten.

Introduction

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de veranderingen die zich op het genomisch niveau van biologische organismen voordoen. Bereiding van de monsters voor NGS methoden kan gevarieerd worden afhankelijk van het organisme, weefseltype, en wat nog belangrijker is het vragen de onderzoekers graag adres. Vele studies hebben aan NGS gedraaid als een middel van het bestuderen van de verschillen in genuitdrukking tussen staten zoals gezonde en zieke personen1,,2,,3,4. De sequencing nemen plaats op basis van de hele genoom en laat een onderzoeker te vangen de meeste, zoniet alle, genomische informatie voor een bepaalde genetische marker tegelijkertijd wijs.

De meest voorkomende markeringen van meningsuiting waargenomen zijn de messenger RNAs (mRNAs). De meest gebruikte procedures voor prepping bibliotheken voor RNA-seq zijn geoptimaliseerd voor het herstel van mRNA moleculen door middel van een reeks van zuivering, breukpatroon en ligations5,6. Echter afhankelijk het besluit over de wijze waarop een protocol worden uitgevoerd sterk van het type van de steekproef en de vragen over het genoemde monster. In de meeste gevallen wordt de totale RNA geëxtraheerd; echter niet alle RNA-moleculen zijn van belang en in gevallen zoals mRNA expressie studies al te overvloedige RNA-soorten, zoals ribosomaal RNAs (rRNA) moet worden verwijderd om het aantal detecteerbare afschriften die is gekoppeld aan de mRNAs verhogen. De meest populaire en meest gebruikte methode voor het verwijderen van de overvloedige rRNA moleculen is de vermindering van de polyadenylated RNA afschriften polyA uitputting7hierna. Deze aanpak werkt goed voor de analyse van mRNA uitdrukking zoals doet geen afbreuk aan de transcripten van mRNA. Echter in studies die geïnteresseerd zijn in niet-coderende of virale RNAs polyA uitputting verwijdert u ook deze moleculen.

Veel studies verkiezen te concentreren op de RNA reeks bibliotheek voorbereiding om te onderzoeken of mRNA uitdrukking (coderen) of een bepaalde categorie van kleine of grote niet-coderende RNA. Hoewel er andere procedures8 als de onze die het mogelijk voor de bereiding van de monsters van de dual maken, bereiden veel studies bibliotheken van afzonderlijke monsters voor afzonderlijke studies beschikbaar. Voor een studie als de onze, zou dit normaal gesproken meerdere bloedmonsters stijgende tijd, verbruiksartikelen, en dieren stress vereisen. Het doel van deze studie was om het gebruik van bloed van dieren te identificeren en kwantificeren van de verschillende klassen van beide mRNA te kunnen en niet-coderende RNA uitgesproken tussen gezonde en hoogpathogene varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus (HP-PRRSV) uitgedaagd varkens9,10 ondanks het feit dat slechts een enkele volbloed steekproef (2,5 mL) van elk varken. Om dit te doen, die we nodig hadden om de typische extractie en bibliotheek creatie protocollen voor het genereren van de juiste gegevens te voorzien van analyse van mRNA zowel niet-coderende RNA (ncRNA) expressie11 van één sample te optimaliseren.

Dit leidde tot een behoefte aan een protocol dat is toegestaan voor mRNA en analyse van niet-coderende RNA omdat de beschikbare standaard kits en de methoden voor RNA-extractie en bibliotheek creëren bestemd waren voornamelijk voor mRNA en gebruik een poly-A uitputting stap12. Deze stap zou hebben gemaakt het onmogelijk om te herstellen van niet-coderende RNA of virale afschriften uit het monster. Dus, een geoptimaliseerde methode nodig was dat toegestaan voor totale RNA extractie zonder monster polyA uitputting. De methode voorgesteld in dit manuscript is geoptimaliseerd voor het gebruik van volbloed als een monster type toestaan en sequencing bibliotheken te bouwen voor zowel mRNA en ncRNAs voor kleine en grote maten. De methode is geoptimaliseerd om te voorzien in de analyse van alle aantoonbaar niet-coderende RNAs evenals virale RNAs voor later onderzoek13behouden. In alle zorgt ons geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding protocol voor het onderzoek van meerdere RNA-moleculen uit een monster van één volbloed.

Het algehele doel achter het gebruik van deze methode was een proces dat is toegestaan voor de collectie van zowel niet-coderende RNA en mRNA uit één monster van volbloed te ontwikkelen. Daardoor kunnen we in onze studie afkomstig uit een monster9mRNA, ncRNA, en virale RNA voor elk dier hebben. Dit, uiteindelijk zorgt voor meer wetenschappelijke ontdekking zonder dierlijke meerkosten en geeft een completer beeld van de expressie van elk individuele monster. De beschreven methode geschikt is voor het onderzoek van de regelgevers van genexpressie, alsook het zodat voor voltooiing van oereenstemming studies vergelijken beide mRNA en niet-coderende RNA expressie met behulp van een enkel geheel bloedmonster. Onze studie gebruikt dit protocol te onderzoeken van de wijzigingen in genexpressie en mogelijk epigenetische regelgevers in viraal geïnfecteerde 9 - weken oude mannelijke commerciële varkens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierlijke protocollen werden goedgekeurd door het National dier ziekte Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care en gebruik Comité.

1. verzameling van varkens bloed monsters

  1. Bloedmonsters in RNA buizen verzamelen. Verzamelen ~2.5 mL of meer als grotere collectie buizen beschikbaar zijn.

2. verwerking van varkens bloed monsters

  1. Centrifugeer de buisjes bloed bij 5,020 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (15-25 ° C). Als de verwerking bevroren monsters Incubeer buis bij kamertemperatuur voor een minimum van 2 h vóór centrifugeren.
  2. Bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van 8 mL RNase-vrij water aan de pellet. Sluiten en vortex de pellet totdat het zichtbaar wordt ontbonden. Centrifugeer monster buizen bij 5,020 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te herstellen van de pellet. Alle vloeistof wordt weggeworpen en het behoud van de pellet.

3. organische extractie voor totale RNA en kleine RNA (miRNA isolatie Kit)

  1. Allereerst totaal RNA extractie pipetting 300 µL van bindende lysisbuffermengsel aan de pellet uit de stap 2.2.
  2. Vortex en de overdracht het mengsel een nieuw etiket 1,5 mL centrifugebuis. Voeg 30 µL van homogenaat additief uit de kit. Vortex de buis en plaats op het ijs gedurende 10 minuten.
  3. Verwijderen van de buis en voeg 300 µL van het zuur-fenol: chloroform reagens uit de kit. Vortex de buis te mengen. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder voorzichtig de waterige fase (300-350 µL) aan een verse buis. Opmerking het volume voor de volgende stap.

4. totaal RNA isolatie Procedure

  1. Op basis van de hoeveelheid waterige herstel (300-350 µL) 1,25 x volume van 100% (~ 375 µL) ethanol toevoegen aan waterfase. Meng het monster met behulp van een precisiepipet.
  2. Set-up nieuwe collectie buizen met een filterpatroon voor elk monster. Pipetteer ~ 675 µL van het mengsel lysate/ethanol op het filterelement.
    Opmerking: Voeg geen > 700 µL aan filter cartridge in één keer. Voor grotere volumes in opvolging van toepassing.
  3. Kort centrifugeren (~ 15-20 s) 10.000 x g vloeistof passeren door het filter. Niet harder dan dit draaien.
  4. Negeren van de stroom door, en herhaal indien nodig de centrifugeren met de resterende lysate/ethanol mengsel totdat het allemaal is toegepast. Het behouden van de dezelfde filter cartridge en collectie buis voor de volgende stap.
  5. 700 µL van Wash oplossing 1 uit de kit toevoegen aan de filter cartridge en kort centrifugeren (~ 10 s) te trekken door het filter. Negeren van de stroom door en behouden van de dezelfde filter cartridge en collectie buis.
  6. Voeg 500 µL van Wash oplossing 2/3. Centrifuge te trekken van de vloeistof door de filter cartridge. Gooi de stroom door. Herhaalstap wassen.
  7. Inde hetzelfde tube, draai het filterelement een extra 60 s tot het verwijderen van alle resterende vloeistof uit de filter. Het filterelement overbrengen in een frisse collectie buis.
  8. Voeg 100 µL voorverwarmde (95 ° C) nuclease-gratis water naar het midden van het filterelement. Spin voor ongeveer 20-30 s de max snelheid van tafelblad centrifuge.
    Opmerking: RNA kan is opgenomen in het eluaat en nu worden verwerkt of opgeslagen bij-20 ° C of lager. Verrijking voor kleine RNAs werd niet uitgevoerd.

5. globine vermindering (gebaseerd op een protocol geoptimaliseerd voor varkens volbloed monsters)14,15

Opmerking: Globine vermindering wordt uitgevoerd zodat bibliotheken niet met overbevolkt zijn leest toewijzing aan globine genen, die het aantal leest beschikbaar verlagen zou toewijzen aan andere genen van groter belang14,15 .

  1. Kruising met globine vermindering oligos
    1. Het denatureren van de RNA (6 µg RNA monster in maximumvolume 7 µL) door het uitgepakte monster in een 0,2 mL dunwandige nuclease-vrije reactiebuis pipetteren en plaatsen in een thermische cycler bij 70 ° C gedurende 2 minuten. Het is de sleutel tot het ijs buizen onmiddellijk na de eerste stap van het denature voor optimale kwaliteit van RNA. Geen DNase behandeling nodig is.
    2. Terwijl buizen cool bereiden een 400 µL van 10 x globine vermindering oligo mix: 100 µL van twee HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA- 3 ') op 30 µM, twee HBB oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', en 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') op 120 µM per reactie, opbrengst een eindconcentratie van 7,5 µM HBA oligos en 30 µM HBB oligos. Bereiden van 10 x oligo kruising buffer: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
    3. Voorbereiden van de kruising mix: 6 µg van RNA monster (7 µL maximumvolume), 2 µL van de 400 µL van 10 x globine vermindering oligo mix (eindconcentratie 2 X), 1 µL van 10 x oligo kruising buffer (eindconcentratie 1 x). Voeg nuclease-gratis water tot een eindvolume van 10 µL.
    4. Thermocycler vastgesteldop 70 ° C gedurende 5 min. Cool onmiddellijk tot 4 ° C en overgaan tot RNase H spijsvertering.
  2. RNase H spijsvertering
    1. Verdun 10 x RNase H (10 U / µL) naar 1 x RNase H met 1 x RNase H buffer.
      Opmerking: De RNase buffer komt op 10 x en zullen moeten worden verdund met 1 x RNase H buffer tot 1 x voorafgaand aan gebruik.
    2. RNase H reactie mix voorbereiden door te combineren: 2 µL van 10 x RNase buffer 1 µL van RNase remmer in 2 µL 1 x RNase H en 5 µL nuclease-gratis water tot een totaal volume 10 µL.
    3. Meng de monsters van de kruising globine vermindering met 10 µL van de RNase H reactie mix en digest bij 37 ° C gedurende 10 minuten afkoelen tot 4 ° C.
    4. Spijsvertering stoppen door toevoeging van 1,0 µL van het EDTA 0.5 M aan elk monster en ga onmiddellijk naar de stap opruimen.
  3. RNase H-behandelde totaal RNA Cleanup.
    1. Zuiveren de RNase H behandeld RNA met behulp van een op basis van silica-membraan elutie zuivering opruimen kit volgens de instructies van de fabrikant. Meng buffers: voor de milde wassen buffer, voeg 44 mL ethanol 100%.
    2. Het monster niet overdragen aan een nieuwe buis. Voeg 80 µL van RNase-gratis water en 350 µL van lysis buffer. 250 µL ethanol 100% aan de verdunde RNA en meng goed door pipetteren toevoegen.
      Opmerking: Niet centrifugeren. Ga onmiddellijk naar stap 5.3.3.
    3. Nu overbrengen in het 700 µL monster een elutie filterpatroon geplaatst in een tube 2 mL-collectie voor het verzamelen van de stroom door. Centrifugeer gedurende 15 s ≥ 8.000 x g. Gooi de doorstroming.
    4. Herhaal deze procedure door het plaatsen van de elutie filter cartridge in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. 500 µL van de milde wassen buffer toevoegen aan de filter cartridge en centrifuge voor 15 s ≥ 8.000 x g om te wassen van de filter cartridge membraan. Gooi de doorstroming. Hergebruik van de buis van de collectie in stap 5.3.5.
    5. Nu met behulp van de dezelfde monsterbuisje, voeg een ander 500 µL van 80% ethanol aan het filterelement. Ditmaal Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij ≥ 8.000 x g. Verzamelen van de elutie spin kolom voor de volgende stap en zich ontdoen van zowel de doorstroming en collectie buis.
    6. Zet de elutie filter cartridge uit de laatste stap in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Laat het deksel open op filter cartridge en centrifugeer bij volledige snelheid voor 5 minuten drogen de spin kolom membraan en voorkomen van ethanol worden overgedragen. Gooi de doorstroming en collectie buis.
      Opmerking: Om te voorkomen dat schade hoek de deksels erop in een richting tegengesteld aan die van de rotor.
    7. Nemen de gedroogde filterelement en leg in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Voeg 14 µL RNase-gratis water filteren cartridge membraan om ervoor te zorgen om toe te voegen het RNase-gratis water rechtstreeks naar het centrum. Centrifugeer gedurende 60 s op volle snelheid te elueren RNA.
  4. Beoordeling van kwaliteit van globine verminderde RNA monsters (stap 6). Ga verder met de bereiding van de monsters van mRNA (stap 7) en kleine RNA bibliotheek voorbereiding (stap 8)16,17.
    Opmerking: Globine verminderde RNA monsters kunnen nu worden opgeslagen bij-20 ° C, maar opslag bij-80 ° C wordt aangeraden voor behoud op lange termijn.

6. beoordeling van RNA

  1. Kwantificeren van RNA concentratie met een spectrofotometer. Onderzoeken van de verhouding van de golflengte van 260 en 280 nm. Ratio's van ~ 2 of meer worden beschouwd als pure voor RNA en lagere waarden duiden op een besmetting. Het instrument maakt gebruik van deze verhouding te bepalen van RNA concentratie als ng/µL.
  2. Beoordeling van RNA kwaliteit met behulp van 1 µL (100 ng) van het monster op een passende chip. Eindproduct moet een RIN van ~ 2 of hoger en een piek bij ~ 280 nt voor één mRNA lezen bibliotheken; kleine pieken van de bibliotheken van de RNA bij 143 overeen met miRNAs.

7. strandde totaal RNA bereiding van de monsters voor de mRNA en lange ncRNA bibliotheken. 16

  1. Opmerking: Breng elutie buffer en rRNA verwijdering kralen op kamertemperatuur. Vooraf label 0,2 ml dunwandige PCR buizen (platen kunnen ook worden gebruikt). Protocol stappen op basis van16instructies van de fabrikant.
    1. Beginnen met 4 µL van RNA globine-verminderd. 6 µL van nuclease-gratis water, 5 µL van rRNA bindende buffer en 5 µL van rRNA verwijdering mix per buis (1st buis) toevoegen. Pipetteer Re-cap te mengen. Breng in thermocycler met 100 ° C verwarmd-deksel voor 5 min op 68° C. verwijderen en laat op kamertemperatuur voor 60 s.
    2. Resuspendeer rRNA verwijdering kralen door vortex; 35 µL van kralen toevoegen aan nieuwe (2nd) PCR buis en Pipetteer van de monster uit de 1st buizen op kralen in de 2nd -buizen. Incubeer 2nd PCR buis bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Plaats op de magnetische stand gedurende 7 minuten.
      Opmerking: Meng elk monster door pipetteren voor optimale rRNA uitputting. Verhogen/Verlaag buis in de stand kan helpen versnellen scheidingsproces.
    3. Overdracht het supernatant van de 2nd PCR buis naar overeenkomende 3rd PCR buis en plaats op de magnetische staan voor een minimum van 60 s. herhalen de overdracht in een nieuwe PCR-buis alleen als de kralen worden niet verplaatst naar de zijkanten van de buis.
    4. Mix monster zuivering kralen door vortex; Voeg 99 µL aan elke 3rd PCR buis. Laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten plaats op magnetische stand voor 5 min. Controleer kralen verhuist naar zijden. Pipetteer aan Verwijder het supernatant.
    5. Houd 3rd buis instellen op magnetische voet. Voeg 200 µL van 70% ethanol terwijl dat evenwel niet tot de kralen drummen. Laat het zitten voor ten minste 30 s en Pipetteer aan Verwijder het supernatant. Herhaal stap.
    6. Toestaan dat monster drogen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op de magnetische stand. Centrifugeer de kit elutie buffer voor 5 s bij 600 x g. Verwijderen van de buis en voeg 11 µL van elutie buffer grondig mengen. Incubeer gedurende 2 min op de Bank dan minstens 5 min op de magnetische stand op kamertemperatuur.
    7. Breng 8,5 µL van supernatant van de 3rd aan een nieuwe (4th) PCR buis. Voeg 8,5 µL van hoge Elute/Prime/Fragment mix uit de kit. Meng goed. GLB en breng dit in een thermocycler met voorverwarmde deksel voor 8 min bij 94 ° C, houdt bij 4 ° C. Verwijder en kort centrifugeren.
  2. Synthetiseren van eerste actiegebied cDNA
    1. Eerste onderdeel synthese mix uit kit om te komen tot kamertemperatuur en centrifugeer bij 600 × g voor 5 s. Transfer 50 µL van reverse-transcriptase in het eerste onderdeel synthese mix toestaan. Reverse-transcriptase kunnen worden toegevoegd aan het eerste onderdeel synthese bij een verhouding van 1:9.
    2. Pipetteer 8 µL van de gecombineerde reverse-transcriptase/eerste onderdeel synthese mix in de 4e buis met monster. Cap en centrifugeer 600 x g gedurende 5 s. plaats in thermocycler met voorverwarmde deksel ingesteld bij 100 ° C. Uitgevoerd voor: 10 min bij 25 ° C, 15 min op 42 ° C, 15 min bij 70 ° C, dan rest bij 4 ° C. Eindvolume is ~ 25 µL per putje. Verplaats onmiddellijk naar de volgende stap.
  3. Tweede onderdeel cDNA synthetiseren
    1. Breng einde reparatie reagens (ERR) en tweede Strand Mix (SSM) op kamertemperatuur, en centrifugeer bij 600 x g voor 5 s. Mix ERR met resuspensie buffer bij 1:50 verdunning. Open 4th buis en 5 µL van verdunde ERR en 20 µL van SSM toevoegen aan elk; Pipetteer aan meng goed. Eindvolume ~ 50 µL ds cDNA.
    2. Cap en in thermocycler Incubeer gedurende 1 uur bij 16 ° C. Wanneer de cyclus voltooid is, verwijdert u caps en toestaan om te komen tot kamertemperatuur op de top van de Bank.
  4. DS cDNA opschonen stap
    1. Begin door het mengen van de vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) paramagnetisch kralen door vortex. Breng 90 µL van de parels aan het monster in de 4th-buis (ds cDNA) en meng. Eindvolume is 140 µL. toestaan buizen te zitten bij kamertemperatuur voor 15 min. Incubeer op magnetische voet voor ~ 5 min. ~ 135 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen uit elk putje. Er moet 5 µL verliet in elk putje.
    2. Laat de buis op de magnetische stand en wassen door 200 µL van 80% ethanol toe te voegen. Laat het zitten voor 30 s dan verwijderen en weggooien bezinken. Herhaalstap wassen. Laat buizen op de magnetische stand gedurende 15 minuten te laten drogen.
    3. Centrifugeer de resuspensie buffer bij 600 x g gedurende 5 s nadat hij naar kamertemperatuur. Verwijder buizen uit stand. Breng 17,5 µL van resuspensie buffer over de buis en meng. Laat buizen broeden op de top van de Bank voor 2 min dan beweging gedurende 5 min magnetische staan.
    4. Pipetteer 15 µL van het supernatans dat met de nieuwe reeks (5th) 0,2 mL dunwandige buizen ds cDNA monsters. Verplaatsen naar volgende stap snel of zegel en opslaan bij-15 ° C tot-25 ° C niet langer dan 7 dagen.
  5. Adenylaat 3' einden.
    1. Pipetteer 2.5 µL van kamertemperatuur resuspensie buffer in het monsterbuisje dan 12,5 µL van ontdooide A-Tailing mix toevoegen. Meng volledig door pipetteren.
      Opmerking: Geen A-tailing besturingselement dat wordt gebruikt.
    2. Cap en broeden in een thermocycler met 100 ° C voorverwarmde deksel. Voer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, dan bij 70 ° C gedurende 5 minuten met verwarmde deksel. Toestaan dat de thermocycler om uit te rusten bij 4 ° C.
  6. Afbinden index adapters
    1. Breng de RNA adapter buizen en de Stop afbinding Buffer mix op kamertemperatuur. Voor elk, centrifugeer bij 600 x g voor 5 s. verlof afbinding mix in de vriezer tot klaar voor gebruik. Monster bundeling regeling voor indexering moet bekend zijn.
    2. 2.5 µL van resuspensie buffer en 2.5 µL van afbinding mix toevoegen aan elke monsterbuisje. Nu Pipetteer in 2.5 µL van de juiste adapter voor RNA in elke monsterbuisje. Adapter selectie moet worden uitgevoerd door de instructies van de fabrikant voor de gekozen kit.
    3. Recap en meng door centrifugeren voor 1 min bij 280 x g. Incubeer in een thermische cycler gedurende 10 minuten staan bij 30 ° C. Voeg 5 µL van stoppen afbinding Buffer aan monster te stoppen de reactie en meng goed.
    4. Begin-opschonen door het mengen van SPRI paramagnetisch kralen door vortex voor 60 s. Transfer 42 µL van parels aan elke buis. Mix thoroughlythen Incubeer gedurende 15 minuten op de top van de Bank.
    5. Verplaatsen van de buizen aan magnetische standaard en verlaten tot vloeibare blijkt duidelijk (~ 5 min). Eenmaal duidelijk verwijderen en 79.5 µL van supernatans negeren. Buizen op de magnetische voet verlaten en wassen door 200 µL van 80% ethanol toe te voegen. Laat het zitten voor ten minste 30 s dan verwijderen en weggooien bezinken. Herhaalstap wassen. Laat op magnetische stand voor extra ~ 15 min te laat voor het drogen. Kralen tijdens wassen stappen niet verstoren.
    6. 52.5 µL van resuspensie buffer toevoegen aan het monsterbuisje en meng tot de kralen volledig opnieuw geschorst zijn. Incubeer gedurende 2 minuten op de top van de Bank. Verhuizing monsterbuisje terug naar magnetische stand tot vloeistof is duidelijk (~ 5 min).
    7. Laat op stand en zachtjes Pipeteer 50 µL van supernatans aan nieuwe (6th) buizen. Voeg 50 µL van vortexed SPRI parels. Incubeer gedurende 15 minuten bovenop Bank laat.
    8. Ga naar magnetische stand en laat de plaat blijven tot vloeibare blijkt duidelijk (~ 5 min). Discard 95 µL van supernatant verlaten 5 µL in elke buis.
    9. Buizen op magnetische voet verlaten en wassen door 200 µL van 80% ethanol toe te voegen. Toestaan van de buis te zitten voor 30 s dan verwijderen en weggeworpen. Herhaal wassen. Buizen drogen op magnetische voet voor 15 min te laat.
    10. Voeg in 22.5 µL van resuspensie buffer en meng tot kralen zijn opgeschort. Incubeer op bankje voor 2 min en vervolgens verplaatsen naar magnetische stand tot vloeibare blijkt duidelijk (~ 5 min). Pipetteer 20 µL van monster in nieuwe PCR buizen (7th).
  7. Breng de benodigde kit onderdelen op kamertemperatuur. 5 µL van het PCR primer mix en 25 µL van het PCR master mix uit kit overbrengen naar monster (7th PCR tube) met geïndexeerde monsters. Meng monster en cap buis.
    1. Buizen in thermische cycler met voorverwarmde deksel plaatsen. Programma: 98 ° C gedurende 30 s, dan 15 cycli van 98 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 5 min. Hold bij 4 ° C.
  8. Clean-up monsters door toevoeging van 50 µL van voldoende gemengde SPRI parels om te proeven van de buis en Pipetteer te combineren. Toestaan dat de reactie op het broeden op de top van de Bank voor 15 min.
    1. De buis naar een magnetische standaard en incubeer tot vloeibare blijkt duidelijk (~ 5 min). Discard 95 µL van supernatant verlaten 5 µL in elke buis.
    2. Buis laat op magnetische stand en wassen door 200 µL van 80% ethanol toe te voegen. Laat het zitten voor ten minste 30 s en dan verwijderen en negeren de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap wassen. Laat op magnetische voet voor 15 min te laten drogen.
    3. Voeg in 32.5 µL van resuspensie buffer en meng tot kralen volledig opnieuw geschorst. Incubeer op bankje voor 2 min en vervolgens verplaatsen naar magnetische stand tot vloeibare blijkt duidelijk (~ 5 min). Pipetteer 30 µL van monster uit elke buis in een nieuwe PCR-buis.
    4. Beoordelen DNA kwantiteit en kwaliteit herhaalt u stap 6.1 en 6.2 met de juiste chip. Overgaan tot het bundelen van stap (stap 9).

8. kleine RNA bibliotheek voorbereiding voor de sncRNAs. 17

Opmerking: Protocol stappen op basis van17instructies van de fabrikant.

  1. Kleine RNA bibliotheek prep start met ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL van globine verminderde RNA samples (4 µL).
  2. Adapter afbinding
    1. De 3'-adapter afbinden door het mengen van grondig 1 µL van adapter, 2 µL van nuclease-gratis water en 4 µL van RNA-monster globine-verminderd. Incubeer bij 70 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
    2. Voeg 10 µL van 2 x afbinding buffer en 3 µL van afbinding enzym mix, meng en incubeer 16 ° C gedurende 18 h.
      Opmerking: Verhoging monster incubatietijd tot 18 uur bij een lagere temperatuur 16 ° c wordt aanbevolen voor studies kochten gemethyleerd RNA soorten, zoals de piwi RNAs. De langere incubatietijd zorgt voor grotere efficiëntie van de afbinding als gevolg van de klasse van wijzigingen tijdens de 3' adapter afbinding fase.
    3. Voeg 1 µL van omgekeerde transcriptie primer in 4.5 µL van nuclease-vrij water aan de afbinding mengsel adapter-dimeer vorming van overtollige 3' adapter te voorkomen.
    4. Incubeer in een voorverwarmde thermische cycler geprogrammeerd voor 5 min op 75 ° C, 15 min bij 37 ° C, 15 min bij 25 ° C, en houd bij 4° C.
    5. Denatureren 1 µL van vooraf verdunde 5'-adapter per monster in een thermische cycler bij 70 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
    6. Voeg 1 µL van gedenatureerde 5'-adapter, 1 µL van 10 x 5' afbinding buffer en 2.5 µL van afbinding enzym 5'. Meng en 25 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.
  3. cDNA synthese en versterking
    1. Meng door pipetting 30 µL van 5 ' / 3 '-adapter-afgebonden RNA, 8 µL van eerste-onderdeel buffer, 1 µL van RNase remmer en 1 µL van reverse-transcriptase. Incubeer het mengsel bij 50 ° C gedurende 60 minuten gaan onmiddellijk aan PCR versterking of warmte inactivering van de reactie bij 70 ° C gedurende 15 minuten en opgeslagen bij-20 ° C.
    2. PCR de 40 µL van Reverse-Transcriptase reactie door toevoeging van 50 µL van PCR master mix, 2.5 µL van RNA PCR Inleiding, voeg 2.5 µL van aangewezen RNA PCR Primer Index aan monster, versterken en nuclease-gratis water tot een totaal volume van 100 µL. Meng door pipetteren. Uitvoeren van PCR in de thermische cycler met behulp van de volgende fietsen voorwaarden: eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 s; 11 cycli van 94 ° C voor 15 s, gloeien bij 62 ° C gedurende 30 s, en uitbreiding bij 70 ° C gedurende 15 s; gevolgd door een laatste extensie bij 70 ° C gedurende 5 minuten; monsters kunnen gehouden worden bij 4 ° C in de cycler.
    3. Opmerking: Indexen worden toegevoegd ten behoeve van het monster bundelen.
  4. Monster-opschonen
    1. Uit het DNA opruimen kit Voeg 500 µL van bindende buffer (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) naar de 100 µL van het PCR versterkte monster om efficiënte binding aan het membraan van de spin-kolom.
      Opmerking: Als de bindende buffer heeft pH-indicator opgenomen Controleer de kleur van het mengsel is geel.
    2. Pipetteer 600 µL mengsel van monster en bindende buffer in een cartridge filter binnen een tube van de collectie van 2 mL, spin voor 30-60 s bij 17,900 x g in een tafelblad centrifuge. Gooi doorstroming.
    3. Wassen van het filterelement in de dezelfde collectie buis met 0,75 mL kit geleverd was buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, van 80% ethanol) door spinnen voor 30-60 s bij 17,900 x g in een tafelblad centrifuge en de stroom te verwijderen-door. Draai het filterelement droog voor een extra 60 s.
    4. Plaats de cartridge filter in een schone 1,5 mL collectie buis. Voeg toe 30 µL van elutie buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5), laat de kolom staan voor 60 s en klik spin voor 60 s bij 17,900 x g in een tafelblad centrifuge.
  5. Monster kwaliteit beoordelen herhaalt u stap 6.1 en 6.2 met de juiste DNA-chip. Verplaats naar bundeling stap (stap 9).

9. monster bundelen voor het rangschikken

  1. Zwembad barcoded en QC'ed monsters door instellen en labelen van nieuwe buizen (of een 96 goed PCR plaat) om de mRNA of ncRNA monsters bevatten. Breng 13 µL van elke barcoded 10nM bibliotheek naar overeenkomstige buizen (of putten in de nieuwe plaat) per16,17van de instructies van de fabrikant. Indienen van samengevoegde monsters voor het rangschikken, er zeker van zijn om te kiezen van soortgelijke Lees lengtes als monsters moeten worden uitgevoerd op dezelfde chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve monsters als in onze studie zijn de globine en geheel bloedmonsters ribo-uitgeput. De representatieve resultaten van het protocol bestaat uit een globine verarmd bibliotheek monster met een RNA integriteit nummer (RIN) boven 7 (Figuur 1een) en 260/280 nm concentratie ratio's op of boven 2 (Figuur 1b en 1 c). Validatie van de resultaten van de steekproef is uitgevoerd met behulp van de spectrofotometer te geven van de uiteindelijke concentratie van elke bibliotheek en chip gebaseerde elektroforese RIN samen met een grafiek aantal pieken die laten welke moleculen (mRNA of ncRNA zien) werden gevangen genomen op basis van grootte in de steekproef bibliotheek vóór de bundeling en de sequencing invoegen Voor de huidige studie werd aandacht besteed aan de mRNA en kleine ncRNAs alleen. Voor de bibliotheken van mRNA het representatief resultaat is een electropherogram piek bij ~ 280 bp (Figuur 1d). Voor de kleine ncRNAs representatieve resultaten bestaan uit een reeks van pieken van ~ 100-400 bp (Figuur 1e), met pieken bij ~ 143 en 153 ~ bp komen overeen met miRNAs en piRNAs, respectievelijk. Onze monster resultaten toonden aan dat onze geoptimaliseerde techniek resulteerde in bibliotheken met RIN nummers die van 6.3 (suboptimaal) tot 9.2 (boven optimaal varieerden). Dit bleek een verbetering ten opzichte van andere studies die globine uitputting methoden gebruikt en waren alleen in staat om RIN nummers op of in de buurt van 6. De chip gebaseerde elektroforese resultaten toonden ook aan dat vanaf een enkel bloedmonster is het mogelijk om RNA molecuul verovering van pieken die zowel mRNA als ncRNA (figuren 1 d en 1e), en de omvang van de steekproeven invoegen waarop zowel de grote als de kleine niet-coderende molecules van RNA. Deze resultaten representatief zijn voor de optimale RIN scores en Voeg maten nodig om kwaliteit afschrift leest kan sequenced uit de bereid bibliotheken voor bijna alle NGS RNA-seq platformen.

Figure 1
Figuur 1 : Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 1b
Figuur 1b : Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 1c
Figuur 1 c : Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 1d
Figuur 1 d : Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 1e
Figuur 1e : Vertegenwoordiger resultaten voor mRNA en niet-coderende RNA expressie bibliotheken van enkele monsters van varkens volbloed. (a) elektroforese bestand uitgevoerd samenvatting vertegenwoordiging van RIN nummers pre globine vermindering en na globine. Vermindering van de pre globine van de vertegenwoordiger electropherograms (b) en (c) na globine vermindering van een steekproef van enkele varkens volbloed. (d) vertegenwoordiger electropherograms van globine en volbloed ribo-verarmd mRNA bibliotheek monsters vóór de bundeling en de sequencing. (e) vertegenwoordiger electropherograms van globine sncRNA volbloed bibliotheken van de dezelfde monsters featured in deelvenster d voorafgaand aan bundeling en sequencing uitgeput Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De eerste kritieke stap in het protocol dat het geoptimaliseerd maakte opgenomen de toegevoegde globine uitputting stappen, waardoor het mogelijk is om kwaliteit leest van volbloed monsters. Een van de grootste beperkingen op het gebruik van volbloed in sequencing studies zijn het hoge aantal leest in de steekproef die zal toewijzen aan globine moleculen en verminderen de leest die naar andere moleculen van belang18 verwijzen kunnen. Daarom, in het optimaliseren van het protocol voor onze steekproef type, we moesten nemen van een globine uitputting stap om ervoor te zorgen dat de hoogste mogelijke mRNA en niet-coderende RNA vangen door sequentiebepaling. Alle van de monsters waren globine verarmd aan account voor hoge niveaus van globine afschriften met behulp van varkens specifieke hemoglobine A en B (HBA en HBB) oligonucleotides op basis van de procedure van Choi et al., 201414. Een andere belangrijke stap was het gebruik van een ribo-uitputting extractie kit, waardoor voor de mogelijkheid verwijderen ongewenste molecules van RNA van onze stalen gelijktijdig behoud van polyadenylated-niet-coderende en virale RNA-moleculen van experimentele belang binnen onze bibliotheken voor sequencing19. Bovendien konden we om te werken met monsters codering (mRNA) en niet-coderende (klein en lange) RNA bibliotheken maken door het verwijderen van de kleine RNA verrijking en grootte selectiestadia als. Door dit te doen, konden we om te maximaliseren van het RNA aliquots voor pooling en garanderen dat we verzonden genoeg volume toe voor het rangschikken. Optimalisatie van alle van de fabrikant protocollen werden gedaan om mRNA en niet-coderende RNA herstel voor downstream bibliotheek creatie te verhogen. Wij ook de niet-coderende RNA bibliotheek voorbereiding voor de kleine niet-coderende RNA gedeelte van onze downstream analyse geoptimaliseerd door extra tijd toe te voegen aan de PCR-incubatie per de fabrikanten instructies voor het verhogen van de efficiëntie van de afbinding van gemethyleerd RNAs en de waarschijnlijkheid van het herstellen van piwi-RNAs.

De beperkingen van de geoptimaliseerde protocol zijn geworteld in het gebrek aan specificiteit die ook het ideaal voor meerdere analyses van één sample maakt. Door het verwijderen van de verrijking en grootte selectie gedeelten van de niet-coderende RNA bibliotheek voorbereiding, beperken wij nieuwe kleine RNA ontdekking20 als tegenwicht voor het tegen het verwerven van zowel kleine als lang niet-coderende molecules van RNA. Vandaar het geoptimaliseerde protocol geeft een goed overzicht van de soorten niet-coderende expressie echter vereist extra verwerking tijdens de analytische fase van toewijzing aan de meer specifieke informatie over de klassen krijgen en maten van niet-coderende RNA meningsuiting gevangen in de monster. Een andere beperking aan de methode is te wijten aan de opneming van het globine uitputting stappen, die de totale aantallen RIN verlaagt. We konden dit oplossen door het eerste onderzoek de RIN nummers voor en na globine uitputting te begrijpen hoe groot van een vermindering van RNA integriteit wij zouden ervaren. Dit leverde resultaten waaruit bleek dat we kunnen ervaren een druppel ~ 1-2 punten. Om deze daling te verklaren we verder het globine uitputting protocol bij 6 µg van monster in plaats van de aanbevolen 10 µg geoptimaliseerd. Dit hielp verbeteren onze RIN nummers, evenals, instandhouding van monster. Bovendien, we ook dunwandige microamp reactie buizen gebruikt en de buizen iced onmiddellijk na de eerste denatureren stap. Hierdoor konden wij de reactie sneller doven, waardoor verbeterde RIN nummers op de globine uitgeput monsters.

Het gewijzigde protocol dat wordt gebruikt in deze studie heeft verscheidene voordelen over de bereidingswijzen van de base bibliotheek gebruikt in andere studies waar alleen mRNA of RNA dat niet-coderende afzonderlijk worden bestudeerd. De veranderingen die we voor optimalisatie toegestaan voor efficiënt gebruik van volbloed als onze steekproef type gemaakt. Dit is voordelig voor toekomstige studies omdat volbloed als een monster-type minder stappen voor het verzamelen en verwerken dan het deel van de leukocyten van bloed heeft. Bovendien, kan volbloed ook heeft de extra voordelen van het toestaan van onderzoekers te onderzoeken van systemische reacties en herhaaldelijk verzameld van het dier. Er is echter een waarschuwing voor het gebruik van volledig bloedmonsters in dat de hoeveelheid bloed die verzameld afhankelijk van de leeftijd en de grootte van het organisme in kwestie is. Kleinere hoeveelheden bloed zal leiden tot lagere opbrengsten van RNA, maar de methode die hier gepresenteerd zal toestaan dubbele bibliotheek creatie van ten minste 2,5 mL van volbloed. Hierdoor konden voor ons met één monster te onderzoeken zowel mRNA en niet-coderende expressie en correleren zowel aan een individu op een momentopname in de tijd, effectief het toestaan van ons om meer informatie dan traditionele bibliotheek bereidingswijzen te verzamelen. Ook door de ribo-uitputting te voeren we het mogelijk gemaakt om afschriften afbrekende sequencing leest, met behoud van de niet-coderende en virale afschriften die verloren tijdens het maken van de traditionele bibliotheek worden kunnen te bestuderen van mRNA. Op deze manier verdrievoudigt onze geoptimaliseerde protocol de hoeveelheid informatie die kan worden verkregen uit een enkele monster. Andere belangrijke veranderingen die we gemaakt met de methode om de vangst van meer RNA soorten informatie zijn: veranderen van het type van PCR plaat te snel stoppen met de reactie, die verbeterd RNA zuiverheid opbrengst; een langere thermocycler incubatie toe afbinding voor eventuele terugwinning van gemethyleerd RNAs; en niet in dienst een maat keuze gel, dat voor alle detecteerbare ncRNAs geïdentificeerd ongeacht de lengte. De downstream analyse dat is toegestaan voor de vangst van meerdere niet-coderende RNAs tussen 18nt-200nt in lengte.

Door gebruik te maken van deze geoptimaliseerde methode, kon onze fractie naar voren gebracht van een protocol dat kan worden toegepast op volbloed transcriptomic analyses en mRNA en niet-coderende RNA van één sample mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het U.S. Department of Agriculture. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.

Acknowledgments

Dit werk werd vooral ondersteund door de door USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, en gedeeltelijk door NIFA AFRI 2015-67015-23216 van de USDA. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een afspraak aan de landbouw onderzoek onderzoek deelname serviceprogramma beheerd door het Oak Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs (ORISE) door een interdepartementale overeenkomst tussen de ons Department of Energy ( DOE) en het Amerikaanse ministerie van landbouw. ORISE wordt beheerd door Oak Ridge Associated Universities DOE arbeidsovereenkomst niet. DE-AC05-06OR2310.

We zouden graag bedanken Dr Kay Faaberg voor de besmettelijke klonen van HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier voor haar hulp bij dieren die betrokken zijn bij het experiment, en Sue Ohlendorf voor secretariële assistentie ter voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Tags

Immunologie en infecties probleem 141 mRNA vermindering van de niet-coderende RNA RNA-Seq volbloed epigenetische,-globine
Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, D. S., Anderson, S. J.,… More

Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter