Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le traitement du codage (ARNm) et non-codantes (ARNnc) globine réduite RNA-seq bibliothèques auprès d’un échantillon de sang total unique.
Abstract
L’avènement de l’innovants et de plus en plus puissantes techniques de séquençage prochaines génération a ouvert de nouvelles avenues dans la possibilité d’étudier l’expression des gènes associée à des processus biologiques d’intérêt sous-jacent. Ces innovations permettent non seulement aux chercheurs d’observer l’expression à partir des séquences d’ADN messagère gènes codant cette fonction cellulaire de l’effet, mais les molécules d’ARN (ARNnc) non codantes qui restent non traduits, mais encore ont également des fonctions de réglementation. Bien que les chercheurs ont la capacité d’observer les ARNm et les ARNnc expression, il est d’usage pour une étude visant à mettre l’accent sur l’un ou l’autre. Cependant, lorsque les études sont intéressés par l’expression des ARNm et ARNnc, autant de fois qu’ils utilisent des échantillons distincts pour examiner codage ou non codantes RNAs en raison de la différence dans les préparations de la bibliothèque. Cela peut conduire à la nécessité pour d’autres exemples qui peuvent augmenter le stress animal, consommables et temps. En outre, il peut causer aux chercheurs de décider de préparer les échantillons pour seul analyse, habituellement l’ARNm, en limitant le nombre de questions biologiques qui peuvent être l’objet d’une enquête. Cependant, ncRNA couvrent plusieurs classes avec rôles régulateurs cette expression de l’ARNm effet. ARNnc étant important à des processus biologiques fondamentaux et trouble de ces processus au cours de l’infection, ils peuvent, par conséquent, faire des cibles intéressantes pour les thérapies. Ce manuscrit montre un protocole modifié pour la génération non codantes RNA expression bibliothèques, y compris l’ARN viral, d’un seul échantillon de sang total et l’ARNm. Optimisation du présent protocole, amélioré la pureté du RNA, a augmenté de ligature pour la récupération d’ARN méthylés et omis de sélection de taille, pour permettre la capture de plusieurs espèces d’ARN.
Introduction
Séquençage de la génération suivant (NGS) a émergé comme un outil puissant pour l’étude des changements qui se produisent au niveau génomique d’organismes biologiques. Préparation des échantillons pour les méthodes end peut varier selon l’organisme, le type de tissu, et surtout les questions les chercheurs tiennent à adresse. De nombreuses études se sont tournés vers la NGS comme un moyen d’étudier les différences dans l’expression des gènes entre Etats comme des individus sains et malades1,2,3,4. Le séquençage de prendre place sur une base de l’ensemble du génome et permet à un chercheur capturer la plupart, sinon tous, de l’information génomique pour un marqueur génétique particulière à la fois le point.
Les marqueurs plus courants d’expression observés sont les ARN messagers (ARNm). Les procédures plus utilisés pour préparer des bibliothèques pour RNA-seq sont optimisées pour la récupération des molécules d’ARNm au moyen d’une série de purifications, fragmentations et des trompes5,6. Toutefois, la décision sur comment un protocole doit être effectuée dépend fortement du type de l’échantillon et les questions étant posées sur ledit échantillon. Dans la plupart des cas, l’ARN total est extrait ; Pourtant, pas toutes les molécules d’ARN sont intéressants et dans des cas tels que les études d’expression ARNm trop abondantes espèces d’ARN, comme l’ARN ribosomique (ARNr) doivent être éliminés afin d’augmenter le nombre de transcriptions décelables associée à l’ARNm. La méthode la plus populaire et largement utilisée pour éliminer les molécules d’ARNr abondante est la réduction des transcriptions polyadénylé RNA dénommé polyA appauvrissement de la couche7. Cette approche fonctionne bien pour l’analyse de l’expression de l’ARNm qu’elle n’affecte pas la transcription de l’ARNm. Toutefois, dans les études qui sont intéressent à des ARN non codants ou virales, l’appauvrissement de polyA supprime également ces molécules.
De nombreuses études choisissent de se concentrer sur la préparation de bibliothèque de séquence ARN afin d’examiner l’expression de l’ARNm (codage) ou une classe particulière d’ARN non codants de petite ou grande. Bien qu’il existe d’autres procédures8 comme le nôtre qui permettent la préparation de l’échantillon double, nombreuses études préparent de bibliothèques à partir des échantillons distincts pour des études distinctes lorsqu’ils sont disponibles. Pour une étude comme la nôtre, il faudrait normalement plusieurs échantillons de sang, augmentant le stress animal, consommables et temps. L’objectif de notre étude était d’être capable d’utiliser le sang d’animaux pour identifier et quantifier les différentes classes de deux ARNm et non-codantes RNA exprimée entre sain et hautement pathogène dysgénésique et le virus du syndrome respiratoire (HP-PRRSV) contesté de porcs9,10 en dépit d’avoir seulement un échantillon simple de sang total (2,5 mL) de chaque cochon. Pour ce faire, il nous fallait optimiser l’extraction typique et les protocoles de création de bibliothèque pour générer les données appropriées permettant l’analyse des ARNm et non-codantes RNA (ARNnc) expression11 auprès d’un échantillon unique.
Cela a incité un besoin pour un protocole qui permettait d’ARNm et d’analyse de RNA non-codantes parce que les kits standards disponibles et méthodes d’extraction de l’ARN et bibliothèque de création étaient destinés principalement à des ARNm et utilisent une déplétion de poly-A étape12. Cette étape aurait rendu impossible de récupérer des ARN non codants ou transcriptions virales de l’échantillon. Par conséquent, il fallait une méthode optimisée qui a permis d’extraction de l’ARN totale sans appauvrissement de polyA échantillon. La méthode présentée dans ce manuscrit a été optimisée pour permettre l’utilisation de sang comme un type d’échantillon et pour construire des librairies de séquençage de l’ADN messagère et ncRNA de petites et grandes tailles. La méthode a été optimisée pour permettre l’analyse de tous les ARN de non-codage détectable mais aussi de conserver l’ARN viral pour l’enquête ultérieure13. Dans l’ensemble, notre protocole de préparation de Bibliothèque optimisée permet d’enquête sur les multiples molécules d’ARN auprès d’un échantillon de sang total unique.
L’objectif derrière l’utilisation de cette méthode était d’élaborer un processus qui a permis pour la collecte de non-codage ARN et ADN messagère dans un échantillon de sang entier. Cela nous permet d’avoir ARNm, ARNnc et l’ARN viral pour chaque animal dans notre étude proviennent d’un seul échantillon9. Ceci, en fin de compte, permet la découverte plus scientifique sans animaux surcoûts et donne une image plus complète de l’expression de chaque échantillon individuel. La méthode décrite permet l’examen des régulateurs de l’expression des gènes comme permettant à l’achèvement des études de corrélation en comparant les deux ARNm et expression de RNA non codantes en utilisant un échantillon simple de sang total. Notre étude a utilisé ce protocole pour examiner les changements dans l’expression des gènes et des régulateurs épigénétiques possibles dans virally infectés 9 - vieux semaine commerciales verrats.
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Protocol
Protocoles de l’animales ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de la National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) animalier.
1. collecte de sang de porc échantillons
- Recueillir des échantillons de sang dans des tubes de RNA. Recueillir ~2.5 mL ou plus si les plus grands tubes de prélèvement sont disponibles.
2. le traitement du sang de porc échantillons
- Centrifuger les tubes de sang à 5 020 x g pendant 10 min à température ambiante (15-25 ° C). Si des échantillons congelé de traitement Incuber les tubes à température ambiante pendant un minimum de 2 h avant la centrifugation.
- Éliminer le surnageant et ajoutez 8 mL d’eau exempte de RNase au culot. Close et vortex le culot jusqu'à ce qu’il est visiblement dissous. Centrifuger les tubes à échantillon à 5 020 x g pendant 10 min à température ambiante pour récupérer le plomb. Jetez tous les surnageant et préserver le culot.
3. organique Extraction ARN Total et les petits ARN (miRNA Kit d’Isolation)
- Commencer totale extraction de l’ARN par pipetage 300 µL de tampon de lyse liaison au culot de l’étape 2.2.
- Vortex et transfert du mélange pour une nouvelle étiquette tube à centrifuger de 1,5 mL. Ajouter 30 µL d’homogénat additif du kit. Vortex le tube et le déposer sur la glace pendant 10 min.
- Retirez le tube puis ajouter 300 µL de l’acide-phénol : réactif de chloroforme de la trousse. Vortex le tube pour mélanger. Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer délicatement la phase aqueuse (300-350 µL) d’un nouveau tube. Noter le volume pour l’étape suivante.
4. le montant total RNA procédure d’isolement
- Basé sur le montant de récupération aqueuse (300-350 µL) ajouter 1,25 x volume d’éthanol à 100 % (~ 375 µL) de phase aqueuse. Mélanger l’échantillon à l’aide d’une pipette.
- Mise en place nouveaux tubes de prélèvement contenant une cartouche de filtre pour chaque échantillon. Pipette ~ 675 µL du mélange lysat/éthanol sur la cartouche du filtre.
Remarque : N’ajoutez pas > 700 µL à cartouche filtrante en même temps. Pour les volumes plus importants s’appliquent dans la succession. - Centrifuger brièvement (~ 15-20 s) à 10 000 x g passer le liquide à travers le filtre. Ne tourne pas plus dur que cela.
- Ignorer le débit à travers et, si nécessaire, répétez la centrifugation avec le reste du mélange lysat/éthanol jusqu'à ce qu’elle a été appliquée. Conserver le même tube de collection et de la cartouche de filtre pour la prochaine étape.
- Ajouter 700 µL de Solution de lavage 1 du kit à la cartouche filtrante et centrifuger brièvement (~ 10 s) à tirer à travers le filtre. Jeter le débit à travers et conserver le même tube de cartouche et collection de filtre.
- Ajouter 500 µL de Solution de lavage 2/3. Centrifugeuse pour dessiner le liquide dans la cartouche du filtre. Jeter le débit à travers. Répétez l’étape de lavage.
- INTHE même tube, faites tourner la cartouche du filtre un supplémentaire de 60 s à enlever tout le liquide résiduel du filtre. Transférer la cartouche du filtre dans un tube de prélèvement de frais.
- Ajouter 100 µL d’eau exempte de nucléase de préchauffé (95 ° C) au centre de la cartouche filtrante. Tournez pendant environ 20-30 s à la vitesse max de centrifugeuse de table.
Remarque : RNA est contenue dans l’éluat et peut maintenant être plus préparé ou stocké à-20 ° C ou moins. Programme d’enrichissement des petits ARN n’a pas été effectuée.
5. globine réduction (basée sur un protocole optimisé pour les échantillons de sang total porcin)14,15
Remarque : La globine réduction est réalisée afin que les bibliothèques ne sont pas surpeuplées avec lit cartographie de gènes de la globine, qui permettrait de réduire le nombre de lectures disponibles pour mapper d’autres gènes du plus grand intérêt14,15 .
- Hybridation avec la globine réduction oligos
- Dénaturer l’ARN (6 µg RNA sample en volume µL 7 maximum) en pipettant également, l’échantillon prélevé dans un tube à parois minces de réaction exempte de nucléase de 0,2 mL et en plaçant dans un thermocycleur à 70 ° C pendant 2 min. Il est essentiel de tubes de glace immédiatement après la première étape prévoit pour une qualité optimale RNA. Aucun traitement de DNase est nécessaire.
- Alors que les cool tubes préparer un 400 µL de 10 x mix de globine réduction oligo : 100 µL de chaque des deux HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3' et 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') à 30 µM, deux HBB oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', et 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') à 120 µM par réaction, ce qui donne une concentration finale d’oligos HBA 7,5 µM et 30 µM HBB oligos. Préparer un tampon d’hybridation x oligo 10 : 100 mM Tris-HCL, pH 7,6 ; 200 mM KCl.
- Préparer le mélange d’hybridation : 6 µg d’échantillon de RNA (7 µL volume maximum) 2 µL de la 400 µL de 10 x mélange d’oligo globine réduction (la concentration finale de 2 X), 1 µL de tampon d’hybridation x oligo 10 (concentration finale de 1 x). Ajouter l’eau exempte de nucléase pour un volume final de 10 µL.
- Régler thermocycleur à 70 ° C pendant 5 min. refroidir immédiatement à 4 ° C et procéder à la digestion de la RNase H.
- Digestion de la RNase H
- Diluer 10 x RNase H (10 U / µL) et 1 x RNase H 1 x tampon de RNase H.
Remarque : La RNase tampon vient à 10 x et devront être dilué avec 1 x tampon de RNase H 1 x avant de les utiliser. - Préparer le mélange de réaction de RNase H en combinant : 2 µL de 10 x RNase tampon 1 µL d’inhibiteur de RNase dans 2 µL de 1 x RNase H et 5 µL d’eau exempte de nucléase pour un volume total 10 µL.
- Bien mélanger les échantillons de l’hybridation de globine réduction à 10 µL du mélange réactionnel RNase H et digérer à 37 ° C pendant 10 min. refroidir à 4 ° C.
- Arrêter la digestion par l’addition de 1,0 µL d’EDTA 0,5 M dans chaque échantillon et procéder immédiatement à l’étape de nettoyage.
- Diluer 10 x RNase H (10 U / µL) et 1 x RNase H 1 x tampon de RNase H.
- RNase H traités Total RNA Cleanup.
- Purifier la RNase H traités ARN utilisant un kit de nettoyage de purification en silice-membrane d’élution conformément aux instructions du fabricant. Mélangez les tampons : pour le tampon de lavage doux, ajouter 44 mL d’éthanol à 100 %.
- Ne transférez pas l’échantillon dans un nouveau tube. Ajouter 80 µL d’eau exempte de RNase et 350 µL de tampon de lyse. Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % au RNA dilué et mélanger bien en pipettant également.
Remarque : Ne pas centrifuger. Passer immédiatement au point 5.3.3. - Maintenant transférer la 700 µL d’échantillon dans une cartouche de filtre d’élution placée dans un tube de prélèvement de 2 mL à prélever le débit à travers. Centrifuger pendant 15 s à ≥ 8 000 x g. Jeter le cheminement.
- Répétez cette opération en plaçant la cartouche du filtre d’élution dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Ajouter 500 µL de la mémoire tampon de lavage doux à la cartouche filtrante et centrifuger pendant 15 s à ≥ 8 000 x g afin de laver le filtre membrane de cartouche. Jeter le cheminement. Réutiliser le tube de prélèvement à l’étape 5.3.5.
- Maintenant en utilisant le même tube à essais, ajouter un autre 500 µL d’éthanol à 80 % de la cartouche filtrante. Cette fois, centrifuger le tube pendant 2 min à ≥ 8 000 x g. Recueillir la colonne élution pour l’étape suivante et jeter le cheminement et collection de tube.
- Mettre la cartouche de filtre d’élution de la dernière étape dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Laissez le couvercle ouvert sur la cartouche du filtre et centrifuger à pleine vitesse pendant 5 min sécher la membrane de colonne de spin et de prévenir l’éthanol reportés. Jeter le tube intermédiaire et collection.
Remarque : Pour éviter des dommages d’angle les couvercles pour pointer dans une direction opposée à celle du rotor. - Sortir la cartouche de filtre séché puis placer dans un nouveau tube de prélèvement de 1,5 mL. Ajouter 14 µL d’eau exempte de RNase pour filtrer la membrane cartouche en veillant à ajouter de l’eau exempte de RNase directement au centre. Centrifuger pendant 60 s à pleine vitesse pour Éluer la RNA.
- Évaluer la qualité des échantillons d’ARN globine réduite (étape 6). Procéder à la préparation des échantillons ADN messagère (étape 7) et préparation (étape 8) de la bibliothèque de RNA petit16,17.
Remarque : Échantillons d’ARN globine réduite peuvent maintenant être stockés à-20 ° C, stockage à-80 ° C est recommandé pour la préservation à long terme.
6. Evaluation de l’ARN
- Quantifier la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre. Examiner le rapport entre la longueur d’onde 260 et 280 nm. Les ratios de ~ 2 ou plus sont considérés comme purs pour l’ARN et des valeurs inférieures indiquent une contamination. L’instrument utilise ce ratio pour déterminer la concentration d’ARN comme ng/µL.
- Évaluer la qualité de RNA en utilisant 1 µL (100 ng) de l’échantillon sur une puce appropriée. Produit final devrait être un RIN ~ 2 ou supérieur et un pic à 280 ~ nt d’ARNm unique lire bibliothèques ; petits pics de bibliothèques de RNA à 143 correspondent aux miARN.
7. échoués Total RNA préparation des échantillons pour les ARNm et les bibliothèques ARNnc long. 16
- Remarque : Porter de tampon d’élution et ARNr perles enlèvement à température ambiante. Avant l’étiquette 0,2 ml à parois minces tubes PCR (plaques peuvent aussi être utilisées). Étapes du protocole issus instructions16 du fabricant.
- Commencer avec 4 µL d’ARN globine réduite. Ajouter 6 µL d’eau exempte de nucléase et 5 µL de tampon de liaison ARNr 5 µL du mélange de suppression de rRNA par tube de (1st ). Pipette pour mélanger et re-cap. Placer dans le thermocycleur avec 100 ° C chauffé-couvercle pendant 5 min à 68° c. enlever et laisser à température ambiante pendant 60 s.
- Remettre en suspension les perles enlèvement ARNr de vortex ; Ajouter 35 µL de perles à nouveau tube PCR (2nd) et Pipeter échantillon provenant des tubes de 1st sur des perles dans les 2 tubes dend . Incuber 2nd PCR tube à température ambiante pendant 3 min. Placer sur le support magnétique pendant 7 min.
Remarque : Bien mélanger chaque échantillon de pipetage pour épuisement d’ARNr optimale. Lever/baisser tube dans le stand peut aider à accélérer le processus de séparation. - Transfert le surnageant du tube PCR 2nd correspondant 3 tube PCR derd et font sur le magnétique stand pendant au moins 60 s. répéter le transfert dans un nouveau tube PCR que si les billes ne sont pas déplacés vers les parois du tube.
- Perles mélange échantillon Purification par vortex ; Ajouter 99 µL dans chaque tube PCR 3rd . Laisser pour reposer à température ambiante pendant 15 min. Place sur support magnétique pendant 5 min. Assurez-vous que perles se déplace à côtés. Pipette pour éliminer le liquide surnageant.
- Garder 3rd tubulure sur support magnétique. Ajouter 200 µL d’éthanol à 70 % tout en faisant attention à ne pas bousculer les perles. Laisser pour reposer pendant au moins 30 s et pipette pour éliminer le liquide surnageant. Répétez l’étape.
- Laisser sécher à température ambiante pendant 15 minutes sur le stand magnétique échantillon. Centrifuger le tampon d’élution kit de 5 s à 600 g. Retirez le tube et ajouter 11 µL de tampon d’élution mélangeant bien. Incuber pendant 2 min sur le banc puis au moins 5 min sur le support magnétique à température ambiante.
- Transférer 8,5 µL de surnageant de la 3rd à une nouvelle (4th) tube PCR. Ajouter 8,5 µL du mélange élution/premier/Fragment haut de la trousse. Bien mélanger. Cap et le placer dans un thermocycleur avec préchauffé couvercle pendant 8 min à 94 ° C, tenir à 4 ° C. Retirez et centrifuger brièvement.
- Faire la synthèse de cDNA de premier brin
- Permettent le premier fil synthèse mix du kit à venir à température ambiante et centrifuger à 600 × g pendant 5 s. transférer 50 µL de la transcriptase inverse dans le premier mélange de synthèse strand. Transcriptase inverse peut être ajoutée à la première de brin synthèse selon un ratio de 1:9.
- Distribuer 8 µL de la transcriptase inverse combinée/première synthèse mix dans le 4ème tube échantillon de brin. Cap et centrifuger 600 x g pendant 5 s. Place dans thermocycleur avec couvercle préchauffé à 100 ° C. Courir pour : 10 min à 25 ° C, 15 min à 42 ° C, 15 min à 70 ° C, puis reposer à 4 ° C. Le volume final est ~ 25 µL / puits. Passer immédiatement à l’étape suivante.
- Synthèse de cDNA de deuxième brin
- Ramener l’extrémité réparation réactif (ERR) et deuxième brin Mix (SSM) à température ambiante et centrifuger à 600 g pour 5 art. Mix ERR avec tampon de resuspension à 01:50 dilution. Déboucher 4ème tube et ajouter 5 µL de ERR dilué et 20 µL de SSM à chacun ; Pipette pour bien mélanger. Le volume final ~ 50 µL ds cDNA.
- Cap et incuber dans le thermocycleur pendant 1 heure à 16 ° C. Lorsque le cycle est terminé, retirer les capuchons et laisser revenir à température ambiante sur le dessus du banc.
- étape de nettoyage ARNC DS
- Commencez par mélanger les billes paramagnétiques Solid Phase réversible immobilisation (SPRI) par vortex. Transférer 90 µL des perles dans l’échantillon dans le tube deth4 (ARNC ds) et mélanger. Le volume final est 140 µL. Allow tubes à reposer à température ambiante pendant 15 min. Incuber sur support magnétique pendant environ 5 min. Retirez ~ 135 µL de surnageant de chaque puit. Il devrait y 5 µL dans chaque puits.
- Maintenir le tube sur le support magnétique et laver en ajoutant 200 µL d’éthanol à 80 %. Laisser pour reposer pendant 30 s puis les retirer et les jeter surnageant. Répétez l’étape de lavage. Laisser les tubes sur le support magnétique pendant 15 min à faire pour sécher.
- Centrifuger le tampon de resuspension à 600 x g pendant 5 s après son arrivée à la température ambiante. Retirer les tubes de support. Transférer 17,5 µL de tampon de resuspension dans le tube et mélanger. Laisser les tubes à incuber sur la paillasse pendant 2 min puis passage à socle magnétique pendant 5 min.
- Pipetter 15 µL de surnageant contenant les échantillons d’ARNC ds dans de nouveaux tubes de (5ème) 0,2 mL à parois minces. Passer à l’étape suivante sans tarder ou sceller et conserver à-15 ° C à-25 ° C pour pas plus de 7 jours.
- L’adénylate 3' extrémités.
- Pipetter 2,5 µL de tampon de resuspension température ambiante dans le tube à essais puis ajouter 12,5 µL du mélange de A-Tailing décongelé. Mélangez complètement en pipettant également.
Remarque : Aucun contrôle de A-tailing utilisé. - Cap et incuber dans un thermocycleur avec couvercle préchauffé 100 ° C. Courir à 37 ° C pendant 30 min, puis à 70 ° C pendant 5 min avec couvercle chauffée. Permettre le thermocycleur pour se reposer à 4 ° C.
- Pipetter 2,5 µL de tampon de resuspension température ambiante dans le tube à essais puis ajouter 12,5 µL du mélange de A-Tailing décongelé. Mélangez complètement en pipettant également.
- Ligaturer les adaptateurs index
- Amener les tubes ARN adaptateur et le mélange de tampon de ligature arrêter à température ambiante. Pour chacun, centrifuger à 600 x g pendant 5 s. mélange de ligation de congé au congélateur jusqu’au moment de l’utilisation. Exemple de mise en commun de l’arrangement pour l’indexation doit être connue.
- Ajouter 2,5 µL de tampon de resuspension et 2,5 µL du mélange de ligation dans chaque tube d’échantillon. Maintenant Pipetter dans 2,5 µL de l’adaptateur adéquat de RNA dans chaque tube à essais. Sélection de l’adaptateur doit être effectuée par les instructions du fabricant pour le kit choisi.
- Reboucher et mélanger par centrifugation pendant 1 min à 280 x g. Incuber dans un thermocycleur pendant 10 min à 30 ° C. Ajouter 5 µL de tampon de ligature arrêter à échantillon de stopper la réaction et bien mélanger.
- BEGIN nettoyage en mélangeant beads paramagnétiques SPRI Vortexer pendant 60 s. 42 transférer µL de billes dans chaque tube. Mix thoroughlythen incuber pendant 15 minutes sur la paillasse.
- Déplacer les tubes de support magnétique et laisser jusqu'à ce que les tours de liquides clairement (~ 5 min). Une fois clairement retirer et jeter 79,5 µL de liquide surnageant. Laisser les tubes sur le support magnétique et laver en ajoutant 200 µL d’éthanol à 80 %. Laisser pour reposer pendant au moins 30 s puis les retirer et les jeter surnageant. Répétez l’étape de lavage. Laisser sur support magnétique supplémentaire ~ 15 min permettre au séchage. Ne perturbent pas les perles au cours des étapes de lavage.
- Ajouter 52,5 µL de tampon de resuspension dans le tube échantillon et mélanger jusqu'à ce que les perles soient complètement remises en suspension. Incuber pendant 2 min sur la paillasse. Tube échantillon déménagement retour à socle magnétique jusqu'à ce que liquide est clair (~ 5 min).
- Laisser sur le stand et doucement distribuer 50 µL de liquide surnageant à nouveau (6ème) tubes. Ajouter 50 µL de perles SPRI mixés. Laisser pour incuber sur la paillasse pendant 15 min.
- Se déplacer à pied magnétique et laisser la plaque rester jusqu'à ce que les tours de liquides clairement (~ 5 min). Défausse 95 µL du surnageant laissant 5 µL dans chaque tube.
- Laisser les tubes sur support magnétique et laver en ajoutant 200 µL d’éthanol à 80 %. Permettre le tube pendant 30 s puis retirer et jeter le surnageant. Répéter le lavage. Laisser les tubes à sécher sur support magnétique pendant 15 min.
- Ajouter à 22,5 µL de tampon de resuspension et mélanger jusqu'à ce que les perles sont suspendues. Incuber le banc pendant 2 min, puis passer sur support magnétique jusqu'à tours liquides clair (~ 5 min). Pipeter 20 µL de l’échantillon dans nouveaux tubes PCR (7ème).
- Ramener les réactifs nécessaires à température ambiante. Transférer 5 µL du mélange amorces PCR et 25 µL du mélange maître PCR de trousse d’échantillon (tube de PCR 7th ) contenant les échantillons indexées. Mélanger le tube échantillon et cap.
- Placer les tubes dans le thermocycleur avec couvercle préchauffé. Exécutez le programme : 98 ° C pendant 30 s, puis 15 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 5 min. cale à 4 ° C.
- Nettoyage des échantillons en ajoutant 50 µL de suffisamment mixtes perles SPRI à échantillonner tube et pipette à combiner. Permettre la réaction d’incubation sur la paillasse pendant 15 min.
- Déplacer le tube sur un support magnétique et incuber jusqu'à tours liquides clairement (~ 5 min). Défausse 95 µL du surnageant laissant 5 µL dans chaque tube.
- Maintenir le tube sur support magnétique et laver en ajoutant 200 µL d’éthanol à 80 %. Laisser pour reposer pendant au moins 30 s puis retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape de lavage. Laisser sur support magnétique pendant 15 min à faire pour sécher.
- Ajouter à 32,5 µL de tampon de resuspension et mélanger jusqu'à ce que les perles sont complètement remises en suspension. Incuber le banc pendant 2 min, puis passer sur support magnétique jusqu'à tours liquides clair (~ 5 min). Pipetter 30 µL de l’échantillon de chaque éprouvette dans un nouveau tube PCR.
- Évaluer la qualité et la quantité d’ADN en répétant les étapes 6.1 et 6.2 avec la puce appropriée. Passer à la mise en commun d’étape (étape 9).
8. les petits ARN bibliothèque préparation pour le sncRNAs. 17
NOTE : Étapes en protocole fondés d’instructions du fabricant17.
- Commencez petite préparation de bibliothèque d’ARN par ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL d’ARN globine réduite échantillons (4 µL).
- Ligature de l’adaptateur
- Ligaturer l’adaptateur 3' en mélangeant soigneusement 1 µL d’adaptateur, 2 µL d’eau exempte de nucléase et 4 µL de l’échantillon de RNA globine réduite. Incuber à 70 ° C pendant 2 min et ensuite placer immédiatement sur la glace.
- Ajouter 10 µL de 2 x tampon ligature et 3 µL du mélange enzymatique de la ligature, mélanger et laisser incuber 16 ° C pour 18 h.
NOTE : Augmentez le temps d’incubation échantillon à 18 heures à une température inférieure de 16 ° C est recommandé pour les études intéressés méthylés espèces d’ARN, comme piwi RNAs. Le temps d’incubation plus longs permet une plus grande efficacité de la ligature en raison de la classe de modifications pendant la phase de ligature 3' adaptateur. - Ajouter 1 µL d’amorce de la transcriptase inverse dans 4,5 µL d’eau exempte de nucléase au mélange de ligature pour empêcher la formation de dimères adaptateur d’excès 3' adaptateur.
- Incuber dans un thermocycleur préchauffé programmé pendant 5 min à 75 ° C, 15 min à 37 ° C, 15 min à 25 ° C et de tenir à 4° C.
- Dénaturer 1 µL de préalablement dilué 5'-adaptateur par échantillon dans un thermocycleur à 70 ° C pendant 2 min et ensuite placer immédiatement sur la glace.
- Ajouter 1 µL de dénaturé 5'-adaptateur, 1 µL de tampon de ligature 10 x 5' et 2,5 µL de 5' enzyme de ligature. Mélanger et laisser incuber à 25 ° C pendant 1 h.
- amplification et synthèse de cDNA
- Bien mélanger en pipettant : 30 l de 5′/3′-adaptateur-ligaturé RNA, 8 µL de tampon de premier-brin, 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL de la transcriptase inverse. Incuber le mélange à 50 ° C pendant 60 min. procéder immédiatement à l’amplification par PCR ou chaleur inactiver la réaction à 70 ° C pendant 15 min et conserver à-20 ° C.
- PCR amplifier les 40 µL de réaction de la Transcriptase inverse en ajoutant 50 µL du mélange maître de PCR, 2,5 µL d’amorces de PCR de l’ARN, ajouter 2,5 µL de désigné RNA PCR Primer Index d’échantillon et exempte de nucléase eau pour un volume total de 100 µL. mélanger en pipettant également. Exécuter PCR dans le thermocycleur à l’aide de cyclisme conditions suivantes : une dénaturation initiale à 94 ° C pendant 30 s ; 11 cycles de 94 ° C pendant 15 s, recuit à 62 ° C pour 30 s et l’extension à 70 ° C pendant 15 s ; suivi d’une extension finale à 70 ° C pendant 5 min ; des échantillons peuvent tenir à 4 ° C dans le cycleur.
- Remarque : Les index sont ajoutés aux fins de la mise en commun par exemple.
- Échantillon nettoyage
- De la trousse de nettoyage ADN ajouter 500 µL de tampon de liaison (5 M Gu-HCl, alcool isopropylique 30 %) pour le 100 µL de l’échantillon amplification PCR pour activer la liaison efficace à la membrane colonne.
Remarque : Si le tampon de liaison a indicateur de pH compris vérifier que la couleur du mélange est jaune. - Pipette mélange de 600 µL de l’échantillon et le tampon de liaison dans une cartouche de filtre à l’intérieur d’un tube de prélèvement de 2 mL, spin pour 30 à 60 s à 17 900 x g dans une centrifugeuse de table. Jeter les intermédiaires.
- Laver la cartouche filtrante dans le même tube de prélèvement avec 0,75 mL de tampon de lavage kit fourni (10 mM Tris-HCl pH 7.5, éthanol à 80 %) en filature pour 30 à 60 s à 17 900 g dans une centrifugeuse de table et en jetant le flux-à travers. Tourner la cartouche du filtre sec pour un supplémentaire de 60 s.
- Placez la cartouche de filtre dans un tube de prélèvement propre de 1,5 mL. Ajouter 30 µL d’un tampon d’élution (10 mM Tris-HCl pH 8,5), laissez la colonne reposer pendant 60 s et puis essorage pendant 60 s à 17 900 x g dans une centrifugeuse de table.
- De la trousse de nettoyage ADN ajouter 500 µL de tampon de liaison (5 M Gu-HCl, alcool isopropylique 30 %) pour le 100 µL de l’échantillon amplification PCR pour activer la liaison efficace à la membrane colonne.
- Évaluer la qualité de l’échantillon en répétant les étapes 6.1 et 6.2 avec la puce ADN appropriée. Passer à la mise en commun d’étape (étape 9).
9. exemple de mise en commun pour le séquençage
- Piscine avec code à barres et des échantillons de QC'ed par la mise en place et l’étiquetage des tubes neufs (ou une plaque de PCR 96 puits) pour contenir des échantillons de l’ARNm ou ARNnc. Transfert 13 µL de chaque bibliothèque de 10 nm avec code à barres à tubes correspondants (ou le puits de la plaque de nouveau) par instructions16,17 du fabricant. Soumettre des échantillons pour le séquençage, assurez-vous de choisir des longueurs de lecture similaires si les échantillons doivent être exécutés sur le même circuit.
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Representative Results
Les échantillons représentatifs dans notre étude sont la globine et les échantillons de sang appauvri en ribo. Les résultats représentatifs du protocole est constitué d’un échantillon de bibliothèque appauvri globine avec un nombre de l’intégrité du RNA (RIN) au-dessus de 7 (Figure 1a) et des ratios de concentration 260/280 nm égale ou supérieure à 2 (Figure 1b et 1c). Valider le résultat de l’échantillon a été réalisée à l’aide du spectrophotomètre pour donner la concentration finale de chaque bibliothèque et électrophorèse puce pour donner le nombre RIN avec un graphique de pics qui montrent quelles molécules (ARNm ou ARNnc) ont été capturés basé sur taille d’insertion dans l’échantillon de bibliothèque avant la mise en commun et de séquençage. Pour la présente étude était l’accent sur l’ARNm et la petite ncRNA seulement. Pour les bibliothèques de mRNA le résultat représentatif est un pic électrophorégramme ~ 280 bp (Figure 1d). Pour le représentant de petites ncRNA résultats consistent en une série de pics de ~ 100-400 bp (Figure 1e), avec des pointes à bp 143 ~ et ~ 153 correspondent respectivement aux miARN et piRNAs. Nos résultats de l’échantillon montrent que notre technique optimisée dans les bibliothèques dont les numéros RIN variaient entre 6,3 (sous-optimal) et 9.2 (ci-dessus optimale). Cela s’est avéré pour être une amélioration par rapport à d’autres études qui globine épuisement des méthodes utilisées et n’ont pu obtenir les numéros de RIN à ou près de 6. L’électrophorèse sur puce résultats ont également montré que d’un seul sang, il est possible de réaliser la capture de molécule RNA de pics représentant ARNnc (1e et Figures 1 d) et l’ARNm et insert échantillons couvertes de petites et grandes molécules d’ARN non codants. Ces résultats sont représentatifs des scores RIN optimales et insérer des tailles nécessaires afin d’assurer la transcription de qualité lit peut séquencés à partir des bibliothèques de prêts pour presque toutes les plateformes NGS RNA-seq.
Figure 1 : S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 1 b : S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 1c : S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 1 d : S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 1e : Représentant résultants des ARNm et bibliothèques d’expression RNA non-codantes de simples échantillons de sang total porcin. a l’électrophorèse fichier exécuté une représentation Sommaire de RIN numéros réduction de globine pré et post-globine. La réduction de globine pre représentant électrophérogrammes (b) et réduction post-globine (c) d’un échantillon de sang porcin unique. (d) représentant électrophérogrammes de globine et exemples de bibliothèque de mRNA de sang appauvri en ribo avant la mise en commun et de séquençage. (e) représentant électrophérogrammes de globine appauvri sncRNA sang total bibliothèques des mêmes échantillons présentés dans le panneau d avant la mise en commun et le séquençage s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La première étape critique dans le protocole qui fait optimisé inclus les étapes de l’appauvrissement globine ajouté, qui ont permis d’obtenir des lectures de qualité provenant d’échantillons de sang entier. L’une des plus grandes limites sur l’utilisation de sang dans les études de séquençage sont le grand nombre de lectures dans l’échantillon qui seront correspondent à des molécules de globine et réduire les lectures qui pourraient mappent à d’autres molécules d’intérêt18. Par conséquent, en optimisant le protocole pour notre type d’échantillon, il nous fallait comporte une phase de déplétion de globine étape afin d’assurer que le plus élevé possible ARNm et l’ARN non codants capturent par séquençage. Tous les échantillons ont été épuisée pour tenir compte des niveaux élevés de transcriptions de globine utilisant hémoglobine spécifique porcins A et B (HBA et HBB) basé sur la procédure de Choi et al., 201414la globine. Une autre étape cruciale a été l’utilisation d’un kit d’extraction de ribo-appauvrissement de la couche qui a permis à la capacité supprimera les molécules d’ARN non désirés de nos échantillons tout en conservant simultanément polyadénylé molécules d’ARN non codants et virales d’intérêt expérimental au sein nos librairies pour le séquençage19. En outre, nous avons pu travailler avec des échantillons individuels création de codage (ARNm) et bibliothèques de non-codantes (petits et longs) de RNA en enlevant les petits RNA enrichissement et taille sélection pas. En faisant cela, nous avons pu afin de maximiser les aliquotes de RNA pour mettre en commun et de garantir que nous avons envoyé un volume suffisant pour permettre le séquençage. Optimisation de l’ensemble des protocoles du constructeur ont été effectués afin d’augmenter la récupération de RNA non codants pour la création de la bibliothèque en aval et de l’ARNm. Nous avons également optimisé la préparation bibliothèque d’ARN non codant pour la petite portion de RNA non-codantes de notre analyse en aval en ajoutant un délai supplémentaire à l’incubation de PCR par les instructions du fabricant pour accroître l’efficacité de la ligature d’ARN méthylés et la probabilité de récupération piwi-ARN.
Les limitations du protocole optimisé sont enracinées dans le manque de spécificité qui rend également idéal pour des analyses multiples d’un seul échantillon. En supprimant l’enrichissement et les portions de sélection de taille de la préparation de bibliothèque des ARN non codants, nous limitons les nouveaux petits RNA découverte20 pour l’équilibrer contre l’acquisition de petites et longues non codantes des molécules d’ARN. Par conséquent, le protocole optimisé donne un bon aperçu des types d’expression non codantes mais, nécessite un traitement supplémentaire au cours de la phase analytique de mappage pour obtenir des informations plus spécifiques sur les classes et tailles d’expression de RNA non-codantes capturés dans la échantillon. Une autre limitation à la méthode est due à l’intégration des étapes appauvrissement globine, qui fera baisser le nombre total de RIN. Nous avons pu résoudre cela en premier en examinant les numéros RIN avant et après l’épuisement de la globine pour comprendre combien grand d’une réduction de l’intégrité de la RNA nous connaîtrait. Cela a donné des résultats qui montrent que nous pourrions éprouver une baisse d’environ 1-2 points. Pour tenir compte de cette baisse, nous avons optimalisé le protocole de l’appauvrissement de globine à 6 µg d’échantillon au lieu des recommandée de 10 µg. Cela a contribué à améliorer nos numéros de RIN, ainsi, conserver l’échantillon. En outre, nous aussi utilisé les tubes de réaction microamp minces et glacé les tubes immédiatement après la première étape de dénaturation. Cela nous a permis d’étancher la réaction plus rapide, permettant à des numéros de RIN améliorée sur la globine appauvri des échantillons.
Mis à jour le protocole utilisé dans cette étude présente plusieurs avantages sur les méthodes de préparation de base bibliothèque utilisées dans d’autres études où seul ARNm ou ARN non codants sont étudiés séparément. Les changements que nous avons fait pour l’optimisation autorisée pour un usage efficace de sang comme notre type d’échantillon. C’est avantageux pour les études à venir parce que le sang comme un type d’échantillon a moins pas pour la collecte et le traitement que la portion de leucocytes du sang. En outre, sang entier aussi a l’avantage supplémentaire de permettre aux chercheurs d’examiner les réponses systémiques et peuvent être prélevé à plusieurs reprises de l’animal. Cependant, il y a une opposition à l’utilisation des échantillons de sang total que la quantité de sang prélevé dépend de l’âge et la taille de l’organisme en question. Petites quantités de sang conduira à abaisser les rendements de RNA, cependant la méthode présentée ici permettra la création de la bibliothèque double d’au moins 2,5 mL de sang total. Ceci a permis pour nous d’utiliser un échantillon d’enquêter sur les ARNm et expression non codantes et correspondent tous deux à un individu à un instantané dans le temps, effectivement ce qui nous permet de recueillir davantage d’informations que les méthodes de préparation de bibliothèque traditionnelles. Aussi, en effectuant la ribo-appauvrissement nous a permis réduire les transcriptions qui pourraient épuiser lectures de séquençage, tout en conservant les transcriptions non codantes et virales qui peuvent être perdues lors de la création de la bibliothèque traditionnelle pour étudier des ARNm. De cette façon, notre protocole optimisé triple la quantité d’informations qui peuvent être obtenues à partir d’un seul échantillon. Autres changements importants, nous avons fait à la méthode pour faciliter la saisie de l’information sur l’espèce plus RNA étaient : modification du type de plaque PCR d’arrêter rapidement la réaction, qui a amélioré le rendement de RNA de pureté ; une incubation thermocycleur plus longue pour augmenter la ligature pour récupération possible des ARN méthylés ; et n’utilisant ne pas une sélection taille gel, permettant toutes les ncRNA détectable identifiés indépendamment de la longueur. Pour l’analyse en aval, cela a permis pour la capture de plusieurs ARN non codants entre 18nt-200nt en longueur.
En employant cette méthode optimisée, notre groupe a été en mesure de proposer un protocole qui peut être appliqué à des analyses transcriptomiques sang entier et permettant l’ARNm et l’ARN non codants auprès d’un échantillon unique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le U.S. Department of Agriculture. USDA est un fournisseur de l’égalité des chances et l’employeur.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu principalement par le par le USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 et en partie par l’USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Cette étude a été financée en partie par une nomination Agricultural Research Service Participation programme de recherche administré par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation (Siero) grâce à un accord interinstitutions entre le US Department of Energy ( DOE) et le département américain de l’Agriculture. ORISE est géré par Oak Ridge Associated universités sous contrat DOE pas. DE-AC05-06OR2310.
Nous tenons à remercier le Dr Kay Faaberg pour les clones infectieux HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier pour son aide avec les animaux impliqués dans l’expérience et Sue Ohlendorf pour l’assistance administrative dans la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase - free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase - free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
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