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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verarbeitung der Codierung (mRNA) optimiert und nicht-kodierenden (NcRNA) Globin reduziert RNA-Seq-Bibliotheken von einer einzigen Vollblut-Probe.

Abstract

Das Aufkommen von innovativer und leistungsfähiger nächste Generation Sequenzierung Techniken eröffnet neue Wege in der Fähigkeit, die zugrunde liegenden Genexpression im Zusammenhang mit biologischen Prozesse von Interesse zu untersuchen. Diese Innovationen ermöglichen nicht nur Forscher, Ausdruck aus der mRNA-Sequenzen zu beobachten, die diesen Effekt zelluläre Funktion für Gene kodieren, aber auch die nicht-kodierende RNA (NcRNA) Moleküle, die nicht übersetzten, aber dennoch bleiben regulatorische Funktionen. Obwohl Forscher die Fähigkeit haben, mRNA und NcRNA Ausdruck zu beobachten, wurde es üblich, dass eine Studie, die auf eine oder die andere zu konzentrieren. Jedoch wenn Studien an mRNA und NcRNA Ausdruck interessiert sind, verwenden viele Male sie separate Proben, um Codierung oder nicht-kodierende RNAs aufgrund der Differenz in Bibliothek Vorbereitungen zu untersuchen. Das führt zu der Notwendigkeit mehr Proben die Zeit, Verbrauchsmaterialien und tierischen Stress erhöhen können. Darüber hinaus kann es kommen Forscher zu entscheiden, zur Vorbereitung von Proben für nur eine Analyse, in der Regel die mRNA, Begrenzung der Zahl der biologischen Fragestellungen, die untersucht werden können. Allerdings umfassen NcRNAs mehrere Klassen mit regulatorischen Rollen diesen Effekt mRNA Ausdruck. Da NcRNA sind wichtig, grundlegende biologische Prozesse und Störung dieser Prozesse in während der Infektion, können sie daher attraktive Ziele für Therapeutika vornehmen. Diese Handschrift zeigt eine geänderte Protokoll für die Generation mRNA und nicht-kodierende RNA Ausdruck Bibliotheken, einschließlich der viralen RNA aus einer einzigen Stichprobe von Vollblut. Optimierung dieses Protokolls RNA Reinheit verbessert, erhöht Ligatur für die Wiederherstellung der methylierten RNAs und ausgelassen Größenauswahl, um Erfassung von mehr RNA-Spezies zu ermöglichen.

Introduction

Sequenzierung der nächsten Generation entstanden (NGS) als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Veränderungen, die auf Genomebene von biologischen Organismen auftreten. Probenvorbereitung für die NGS Methoden variiert werden, je nach Organismus, Gewebetyp, und vor allem die Fragen die Forscher wollen Adresse. Viele Studien haben NGS als Mittel zur Untersuchung der Unterschiede in der Genexpression zwischen Staaten wie gesunde und kranke Personen1,2,3,4geworden. Die Sequenzierung legen Sie auf ein ganzes Genom-Basis und ermöglicht ein Forscher, der meisten zu erfassen, wenn nicht alle, die genomische Informationen für einen bestimmten genetischen Marker zu einem Zeitpunkt zeigen.

Die am häufigsten verwendeten Marker des Ausdrucks beobachtet sind der Messenger-RNAs (mRNAs). Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur prepping Bibliotheken für RNA-Seq sind optimiert für die Erholung der mRNA-Moleküle durch den Einsatz einer Reihe von Reinigungen, Fragmentierungen und grundsätzlich5,6. Die Entscheidung darüber, wie ein Protokoll durchgeführt werden stützt sich jedoch auf Probentyp und die Fragen über diese Probe. In den meisten Fällen wird die Gesamt-RNS extrahiert; Doch nicht alle RNA-Moleküle sind von Interesse und in Fällen wie mRNA Ausdruck Studien allzu reichlich RNA-Spezies, wie ribosomale RNA (rRNA) müssen entfernt werden, um die Zahl der nachweisbaren Abschriften der mRNAs zugeordnet. Die beliebtesten und am weitesten verbreitete Methode zur Entfernung der reichlich rRNA Moleküle ist die Reduzierung von Polyadenylated RNA-Transkripte als PolyA Erschöpfung7bezeichnet. Dieser Ansatz funktioniert gut für die Analyse der mRNA Ausdruck, da es die mRNA Transkripte nicht beeinträchtigt wird. In Studien, die in nicht-kodierenden oder viralen RNAs interessiert sind, entfernt jedoch auch PolyA Erschöpfung dieser Moleküle.

Viele Studien wählen, um auf die RNA-Sequenz Bibliothek Vorbereitung mRNA Expression (Codierung) zu untersuchen oder eine bestimmte Klasse von kleinen oder großen nicht-kodierender RNA zu konzentrieren. Zwar gibt es andere Verfahren8 wie der unsrigen, die für die duale Probenvorbereitung ermöglichen, bereiten viele Studien Bibliotheken aus gesonderten Proben für separate Studien wenn verfügbar. Für eine Studie wie der unsrigen erfordert dies normalerweise mehrere Blutproben, die Erhöhung der Zeit, Verbrauchsmaterialien und Tier Stress. Ziel unserer Studie war es, möglicherweise verwenden Vollblut von Tieren zu identifizieren und quantifizieren die verschiedenen Klassen der beiden mRNA und nicht-kodierender RNA ausgedrückt zwischen gesunden und hochpathogenen Porcines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus (HP-PRRSV) Schweine-9,-10 trotz des Habens von nur einer einzigen Vollblut-Probe (2,5 mL) von jedem Schwein in Frage gestellt. Um dies zu tun, mussten wir zur Optimierung der typischen Extraktion und Bibliothek erstellen Protokolle, die richtigen Daten für die Analyse von mRNA und nicht-kodierende RNA (NcRNA) Ausdruck11 aus einer einzigen Probe ermöglichen zu generieren.

Dies veranlasste eine Notwendigkeit für ein Protokoll, das für mRNA und nicht-kodierende RNA Analyse zulässig, da die verfügbaren standard-Kits und Methoden für die Erstellung RNA-Extraktion und Bibliothek hauptsächlich für mRNA bestimmt wurden und ein Poly-A Erschöpfung Schritt12 verwenden. Dieser Schritt würde es wieder nicht-kodierender RNA oder viralen Transkripte aus der Probe unmöglich gemacht haben. Daher bedurfte es eine optimierte Methode, die für insgesamt RNA-Extraktion ohne Probe PolyA Erschöpfung zulässig. In diesem Manuskript vorgestellte Methode wurde für den Einsatz von Vollblut als Probentyp ermöglichen und Sequenzierung Bibliotheken für mRNA und NcRNAs von kleinen und großen Größen zu bauen optimiert. Die Methode wurde optimiert, um für die Analyse von allen nachweisbar nicht-kodierende RNAs sowie virale RNA für spätere Untersuchung13zu behalten. Alles in allem ermöglicht unsere optimierte Bibliothek-Vorbereitung-Protokoll für die Untersuchung mehrere RNA-Moleküle aus einer einzigen Blutprobe ganz.

Das übergeordnete Ziel hinter der Verwendung dieser Methode war, ein Verfahren zu entwickeln, die für die Sammlung von nicht-kodierende RNA und mRNA aus einer Stichprobe von Vollblut zulässig. Dies ermöglicht es uns, mRNA, NcRNA und virale RNA für jedes Tier in unserer Studie, die aus einer einzigen Probe9bezogen haben. Dies, letztlich ermöglicht weitere wissenschaftliche Entdeckung ohne Zusatzkosten Tier und gibt ein vollständigeres Bild des Ausdrucks von jeder einzelnen Probe. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Regulierungsbehörden der gen-Expression als auch für den Abschluss der korrelative Studien zum Vergleich beide mRNA und nicht-kodierende RNA-Ausdruck mit Hilfe einer einzigen Vollblut-Stichprobe. Unserer Studie dieses Protokoll verwendet, um die Änderungen in der Genexpression zu untersuchen und mögliche epigenetische Regulatoren in Viral infiziert 9 - Wochen alten männlichen kommerzielle Schweine.

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Protocol

Tier-Protokolle wurden vom National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Sammlung von Schweine Blut Proben

  1. Sammeln Sie Blutproben in RNA Röhrchen. Sammeln Sie ~2.5 mL oder mehr, wenn größere Röhrchen zur Verfügung stehen.

2. Verarbeitung von Schweinen Blut Proben

  1. Zentrifugieren Sie die Blut-Röhrchen 5.020 x g für 10 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C). Wenn Verarbeitung gefrorene Proben Rohr bei Raumtemperatur für ein minimum von 2 h vor der Zentrifugation inkubieren.
  2. Das Pellet fügen Sie 8 mL RNase-freies Wasser hinzu und entfernen Sie überstand. Nähe und Wirbel das Pellet bis es sichtlich aufgelöst ist. Zentrifugieren Sie Probenröhrchen 5.020 x g für 10 min bei Raumtemperatur das Pellet zu erholen. Verwerfen Sie alle überstand und bewahren Sie das Pellet.

3. organische Extraktion für Gesamt-RNS und kleine RNA (MiRNA Isolierungskit)

  1. Zunächst insgesamt RNA-Extraktion Pipettieren 300 µL der Lyse Bindung Puffer zum Pellet aus dem Schritt 2.2.
  2. Wirbel und Übertragung der Mischung zu einer neuen 1,5 mL Zentrifugenröhrchen gekennzeichnet. Fügen Sie 30 µL Homogenat Additiv aus dem Kit. Wirbel der Röhre und Platz auf dem Eis für 10 Minuten.
  3. Das Rohr zu entfernen und fügen Sie 300 µL der Säure-Phenol: Chloroform Reagenz aus dem Kit. Wirbel der Röhre zu mischen. Zentrifugieren Sie bei 10.000 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase (300-350 µL) zu einem neuen Schlauch. Beachten Sie die Lautstärke für den nächsten Schritt.

4. total RNA Isolierung Verfahren

  1. Bezogen auf die Menge der wässrigen Erholung (300-350 µL) 1,25 X Volumen von 100 % (~ 375 µL) Ethanol zu wässrigen Phase hinzufügen. Mischen Sie die Probe mit einer Pipette.
  2. Aufbau neuer Primärgefäßen enthält eine Filterpatrone für jede Probe. Pipette ~ 675 µL lysate/Ethanol-Gemisch auf die Filterpatrone.
    Hinweis: Keine hinzu > 700 µL Filterpatrone auf einmal. Für größere Mengen hintereinander anwenden.
  3. Zentrifugieren Sie kurz (~ 15-20 s) bei 10.000 X g Flüssigkeit durch den Filter passieren. Nicht schleudern Sie schwieriger als das.
  4. Verwerfen Sie die Durchströmung zu, und wiederholen Sie ggf. die Zentrifugation mit den restlichen lysate/Ethanol-Gemisch bis es alle angewendet wurde. Behalten Sie das gleiche Filter Patrone und Sammlung Rohr für den nächsten Schritt.
  5. Die Filterpatrone 700 µL Wash Lösung 1 aus dem Kit hinzufügen und kurz Zentrifugieren (ca. 10 s), durch den Filter zu ziehen. Verwerfen der Durchströmung und behalten das gleiche Filter Patrone und Sammlung Rohr.
  6. Fügen Sie 500 µL der Waschlösung 2/3. Zentrifuge, die Flüssigkeit durch die Filterpatrone zu ziehen. Die Durchströmung zu verwerfen. Wiederholen Sie Waschschritt.
  7. Inder gleichen Rohr, drehen Sie der Filterpatrone eine zusätzliche 60 s Restflüssigkeit aus Filter entfernen. Übertragen Sie die Filterpatrone auf eine frische Kollektion-Röhre.
  8. Das Zentrum der Filterkartusche 100 µL vorgewärmten (95 ° C) Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Für ca. 20-30 s mit der Tischplatte Zentrifuge max Geschwindigkeit drehen.
    Hinweis: RNA kann bei-20 ° C oder darunter in das Eluat enthalten ist und nun weiter verarbeitet oder gespeichert werden. Bereicherung für kleine RNAs wurde nicht durchgeführt.

5. Globin Reduktion (basierend auf ein Protokoll optimiert für Schweine Vollblut-Proben)14,15

Hinweis: Globin Reduktion durchgeführt wird, so dass Bibliotheken mit nicht überbevölkert sind liest Zuordnung zum Globin-Gene, die die Anzahl der Lesevorgänge zur Verfügung, um mit anderen Genen mehr Interesse14,15 Karte senken würde.

  1. Hybridisierung mit Globin Reduktion oligos
    1. Denaturieren Sie die RNA (6 µg RNA-Probe in maximal 7 µL Volumen) die entnommene Probe in ein 0,2 mL Nuklease-freie Reaktion dünnwandigen Röhrchen pipettieren und in einem Thermocycler bei 70 ° C für 2 min. Es ist der Schlüssel zu Röhren sofort nach dem ersten Denature für eine optimale Qualität der RNA Eis. Kein DNase-Behandlung erforderlich ist.
    2. Während Röhren Cool vorbereiten eine 400 µL 10 x Globin Reduktion Oligo Mischung: 100 µL der zwei HBA Oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', und 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') auf 30 µM, zwei HBB Oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3 ", und 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3 ") bei 120 µM pro Reaktion, eine Endkonzentration von 7,5 µM HBA Oligos und 30 µM HBB Oligos nachgeben. 10 X oligo Hybridisierung Puffer vorzubereiten: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
    3. Vorbereiten den Hybridisierung-Mix: 6 µg RNA-Probe (maximal 7 µL Volumen), 2 µL 400 µL 10 x Globin Reduktion Oligo Mischung (Endkonzentration 2 X), 1 µL 10 X oligo Hybridisierung Puffer (Endkonzentration 1 X). Ein finales Volumen von 10 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen.
    4. Thermocycler bei 70 ° C für 5 min. abkühlen sofort auf 4 ° C eingestellt, und fahren Sie mit RNase H Verdauung.
  2. RNase H Verdauung
    1. Verdünnen Sie 10 x RNase H (10 U / µL), 1 x RNase H mit 1 x RNase H Puffer.
      Hinweis: Die RNase Puffer kommt bei 10 X und 1 x verdünnt werden müssen RNase H Puffer auf 1 X vor dem Gebrauch.
    2. Vorbereiten der RNase H Reaktion Mischung durch die Kombination: 2 µL 10-fach Puffer, 1 µL RNase-Inhibitor in 2 µL 1 x RNase H und 5 µL Nuklease-freies Wasser zu einem Gesamtvolumen 10 µL RNase.
    3. Mischen Sie die Globin Reduktion Hybridisierung Proben mit 10 µL RNase H Reaktion Mischung und verdauen bei 37 ° C für 10 min. abkühlen bis 4 ° C.
    4. Stoppen Sie Verdauung durch Zugabe von 1,0 µL 0,5 M EDTA zu jeder Probe zu und gehen Sie sofort zum Aufräumsegment.
  3. RNase H behandelt allgemeine RNA Bereinigung.
    1. Reinigen der RNase H behandelt RNA mit einem Silikon-Membran-basierten Elution Reinigung Bereinigung-Kit nach Herstellerangaben. Premix Puffer: für den milden waschen Puffer hinzufügen 44 mL 100 % Ethanol.
    2. Übertragen Sie die Probe nicht an einen neuen Schlauch. Fügen Sie 80 µL RNase-freies Wasser und 350 µL Lyse Puffer. Hinzu kommen 250 µL 100 % Ethanol die verdünnte RNA und Mischung gut durch pipettieren.
      Hinweis: Zentrifugieren Sie nicht. 5.3.3 Schritt sofort fortfahren.
    3. Jetzt übertragen Sie 700 µL Probe auf eine Elution Filtereinsatz platziert in einer 2 mL-Sammelrohr die Durchströmung zu sammeln. Zentrifuge für 15 s ≥ 8.000 x g. Entsorgen Sie den Durchfluss.
    4. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem man die Elution Filterpatrone in eine neue 2 mL Sammelröhrchen. Die Filterpatrone und Zentrifuge für 15 500 µL des Puffers mild waschen hinzufügen s ≥ 8.000 x g um die Filtermembran Patrone zu waschen. Entsorgen Sie den Durchfluss. Wiederverwenden Sie das Sammelröhrchen in Schritt 5.3.5.
    5. Jetzt mit der gleichen Probenröhrchen, eine weitere 500 µL Ethanol 80 % hinzufügen, die Filterpatrone. Diesmal Zentrifugieren der Röhre für 2 min bei ≥ 8.000 X g. Sammeln Sie die Elution Spin-Spalte für den nächsten Schritt zu und entsorgen Sie durchströmten sowohl die Sammlung Rohr.
    6. Eine neue 2 mL Sammelrohr die Elution Filterpatrone aus dem letzten Schritt umgesetzt. Lassen Sie der Deckel öffnen am Filtereinsatz und Zentrifugieren bei voller Geschwindigkeit für 5 min trocknen die Spin-Spalte-Membran und verhindern, dass Ethanol übernommen. Verwerfen Sie das Durchfluss und Sammlung Rohr.
      Hinweis: Zur Vermeidung von Schäden Winkel die Deckel darauf entgegen, dass der Rotor.
    7. Die getrockneten Filterpatrone und schreiben Sie in eine neue 1,5 mL Sammelröhrchen. Fügen Sie 14 µL RNase-freies Wasser Filter Patrone Membran und achten Sie auf die RNase-freies Wasser direkt zum Center hinzufügen. Zentrifuge für 60 s mit voller Geschwindigkeit auf die RNA eluieren.
  4. Qualität des Globin-reduzierte RNA-Proben (Schritt 6) zu bewerten. Fahren Sie mit mRNA Probenvorbereitung (Schritt 7) und kleine RNA Bibliothek Vorbereitung (Schritt 8)16,17.
    Hinweis: Globin-reduzierte RNA Proben können jetzt bei-20 ° C gelagert werden, aber Speicher bei-80 ° C zur Langzeitarchivierung empfohlen.

6. Würdigung der RNA

  1. RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren. Prüfen Sie das Verhältnis der Wellenlänge von 260 und 280 nm. Verhältnis von ~ 2 oder mehr gelten als reine für RNA und niedrigere Werte zeigen einige Belastung. Das Gerät anhand dieses Verhältnis RNA-Konzentration wie ng/µL.
  2. Bewerten Sie RNS-Qualität mit 1 µL (100 ng) der Probe auf einen entsprechenden Chip. Endprodukt soll eine RIN von ~ 2 oder höher und ein Peak bei ~ 280 nt für einzelne mRNA lesen Bibliotheken; kleine RNA-Bibliotheken-Peaks bei 143 entsprechen MiRNAs.

7. Total RNA-Probenvorbereitung für die mRNA und lange NcRNA Bibliotheken gestrandet. 16

  1. Hinweis: Bringen Sie Elution Buffer und rRNA Entfernung Perlen auf Raumtemperatur. Pre-label 0,2 ml dünnwandiger PCR Tubes (Platten können auch verwendet werden). Protokoll-Schritte anhand des Herstellers Anweisungen16.
    1. Beginnen Sie mit 4 µL RNA Globin reduziert. 6 µL Nuklease-freies Wasser, 5 µL der rRNA Bindung Puffer und 5 µL rRNA-Entfernung-Mix pro Röhrchen (1St Rohr) hinzufügen. Pipette zu mischen und wieder verschließen. In Thermocycler mit 100 ° C erhitzt-Deckel für 5 min bei 68° C. entfernen und lassen bei Raumtemperatur für 60 s.
    2. Aufschwemmen Sie rRNA Entfernung Perlen durch Wirbel; neue (2Nd) PCR Rohr 35 µL Perlen hinzu und pipette Probe aus der 1St Rohre auf Perlen in den 2Nd -Schläuchen. Inkubieren Sie 2Nd -PCR-Rohr bei Raumtemperatur 3 min. Setzen Sie auf die magnetische Halterung für 7 min.
      Hinweis: Mischen Sie jede Probe durch Pipettieren für optimale rRNA Abbau gründlich. Rohr im Ständer Anhebung/Absenkung kann helfen, Trennung zu beschleunigen.
    3. Übertragung der Überstand aus dem 2Nd -PCR-Röhrchen passenden 3rd PCR Tube und Platz auf den magnetischen stehen für ein Minimum von 60 S. wiederholen die Überführung in eine neue PCR-Röhre nur dann, wenn die Perlen nicht Rohr seitlich verschoben werden.
    4. Probereinigung Mix Perlen durch Wirbel; jedes 3rd -PCR-Röhrchen 99 µL hinzufügen. Bei Raumtemperatur für 15 min. Platz auf Magnetstativ für 5 min. sorgen Perlen wechselt zum Seiten sitzen lassen. Pipette, den Überstand zu verwerfen.
    5. Halten Sie 3rd -Schlauchsatz auf Magnetstativ. Fügen Sie 200 µL 70 % Ethanol zwar aufpassen, nicht zu drängeln sich die Perlen. Für mindestens 30 s und Pipette überstand verwerfen sitzen lassen. Wiederholen Sie Schritt.
    6. Lassen Sie Probe bei Raumtemperatur für 15 min auf die Magnetstativ trocknen. Zentrifugieren Sie Kit Elution Buffer für 5 s bei 600 X g. Entfernen Sie Rohr zu, und fügen Sie 11 µL Elution Buffer gründlich mischen. 2 min auf der Bank dann mindestens 5 min auf dem magnetischen Stand bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Übertragen Sie 8,5 µL Überstand von 3rd auf eine neue (4th) PCR-Röhrchen. 8.5 µL Elute/Prime/Fragment High-Mix aus dem Kit hinzufügen. Mischen Sie gut. Kappe und Ort in einem Thermocycler mit vorgewärmten Deckel für 8 min bei 94 ° C, bei 4 ° c zu halten Entfernen und kurz zentrifugieren.
  2. Ersten Strang cDNA Synthese
    1. Ersten Strang Synthese Mix aus Kit auf Raumtemperatur kommen und Zentrifugieren bei 600 × g für 5 s. übertragen 50 µL Reverse Transkriptase in den ersten Strang Synthese Mix zu ermöglichen. Reverse Transkriptase kann zuerst Synthese in einem Verhältnis von 1:9 Strang hinzugefügt werden.
    2. Pipette 8 µL der kombinierten Reverse Transkriptase/erster Strang Synthese-Mischung in die 4. Röhre mit Probe. Kappe und Zentrifugieren 600 X g 5 S. Platz in Thermocycler mit vorgewärmten Deckel gesetzt bei 100 ° C. Laufen: 10 min bei 25 ° C, 15 min bei 42 ° C, 15 min bei 70 ° C, ruhen Sie sich anschließend bei 4 ° C. Endvolumen ist ~ 25 µL pro Bohrloch. Begeben Sie sich sofort zum nächsten Schritt.
  3. Zweiter Strang cDNA Synthese
    1. Ende Reparatur Reagenz (ERR) und zweiten Strang Mix (SSM) auf Raumtemperatur bringen und Zentrifugieren bei 600 X g für 5 Mix ERR mit Wiederfreisetzung Puffer bei 01:50 s. Verdünnung. Entdeckeln 4th Rohr und jeweils 5 µL verdünnter ERR und 20 µL des SSM hinzugefügt; Pipette gut mischen. Endvolumen ~ 50 µL ds cDNA.
    2. Verschließen und 1 Stunde bei 16 ° c im Thermocycler inkubieren Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, entfernen Sie Kappen und an der Spitze der Bank auf Zimmertemperatur kommen lassen.
  4. DS cDNA Aufräum Schritt
    1. Durch die feste Phase Reversible Immobilisierung (SPRI) paramagnetischen Perlen von Vortex mischen beginnen. Übertragen Sie 90 µL der Perlen zu, zum Beispiel in der 4th-Röhre (ds cDNA) und mischen. Endvolumen ist 140 µL. zulassen Rohre für 15 min. bei Zimmertemperatur sitzen auf Magnetstativ für ~ 5 min inkubieren. Jedes gut entnehmen Sie ~ 135 µL des Überstandes. Es sollten 5 µL in jede Vertiefung gelassen.
    2. Lassen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und waschen durch Zugabe von 200 µL von 80 % Ethanol. Für 30 s dann entfernen und entsorgen überstand sitzen lassen. Wiederholen Sie Waschschritt. Lassen Sie Rohre auf Magnetstativ für 15 Minuten trocknen.
    3. Zentrifugieren den Wiederfreisetzung Puffer 600 X g für 5 s nach seiner Ankunft in Raumtemperatur. Rohre vom Stand zu entfernen. 17.5 µL Wiederfreisetzung Puffer auf das Rohr übertragen und mischen. Lassen Sie die Rohre auf der Bank-Oberseite für 2 min dann Umzug nach Magnetstativ für 5 min inkubieren.
    4. Pipette 15 µL des Überstands mit ds cDNA Proben neuer Satz (5th) 0,2 mL dünnwandige Rohre. Fahren Sie mit nächsten Schritt sofort oder versiegeln Sie und nicht mehr als 7 Tage bei-15 ° C bis-25 ° C lagern.
  5. Adenylat 3' enden.
    1. Pipette 2,5 µL Raumtemperatur Wiederfreisetzung Puffer in das Probenröhrchen und fügen Sie dann 12,5 µL aufgetauten A-Tailing-Mix. Mischen Sie vollständig durch pipettieren.
      Hinweis: Keine A-Tailing Kontrolle verwendet.
    2. Kappe und in einem Thermocycler mit 100 ° C vorgewärmt Deckel inkubieren. Führen Sie bei 37 ° C für 30 min, dann bei 70 ° C für 5 min mit beheizten Deckel. Lassen Sie Thermocycler, bei 4 ° c ruhen
  6. Index-Adapter verbinden
    1. Bringen Sie die RNA-Adapter-Rohre und stoppen Ligation Puffer-Mix auf Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie für jeden bei 600 X g für 5 S. lassen Ligatur Mix im Gefrierschrank bis einsatzbereit. Probe Bündelung Anordnung für die Indizierung sollte bekannt sein.
    2. Jede Probenröhrchen 2,5 µL Wiederfreisetzung Puffer und 2,5 µL Ligatur-Mix hinzufügen. Jetzt pipette in 2,5 µL des richtigen RNA-Adapters in jeder Probenröhrchen. Adapter-Auswahl sollte durch die Anweisungen des Herstellers für das gewählte Kit durchgeführt werden.
    3. Zusammenzufassen und durch Zentrifugation für 1 min bei 280 X gmischen. in einem Thermocycler für 10 min bei 30 ° c inkubieren Fügen Sie 5 µL stoppen Ligation Puffer hinzu, Probe, um die Reaktion zu stoppen und gut mischen.
    4. Begin Bereinigung durch das Mischen von SPRI paramagnetischer Perlen durch Wirbel für 60 S. übertragen 42 µL Perlen für jedes Rohr. Mix Thoroughlythen inkubieren 15 min an der Spitze der Bank.
    5. Magnetstativ Rohre nach und verlassen Sie bis flüssigen Kurven (~ 5 min) löschen. Einmal klar entfernen und entsorgen von 79,5 µL überstand. Rohre auf die Magnetstativ verlassen und waschen durch Zugabe von 200 µL von 80 % Ethanol. Für mindestens 30 s dann entfernen und entsorgen überstand sitzen lassen. Wiederholen Sie Waschschritt. Lassen Sie auf Magnetstativ für zusätzliche ~ 15 min, um die Trocknung zu ermöglichen. Stören Sie Perlen nicht beim Waschen Schritte.
    6. Das Probenröhrchen 52,5 µL Wiederfreisetzung Puffer hinzu und mischen Sie, bis die Perlen komplett neu ausgesetzt sind. 2 min zu Benchtop inkubieren. Umzug-Probenröhrchen zurück zu Magnetstativ bis Flüssigkeit ist klar (~ 5 min).
    7. Lassen Sie auf Stand und sanft pipette 50 µL des Überstands um neue (6th) Röhren. Fügen Sie 50 µL verwirbelt SPRI Perlen. Erlauben Sie, an der Spitze der Bank für 15 min inkubieren.
    8. Umzug nach Magnetstativ und Platte bleiben bis flüssigen Kurven (~ 5 min) löschen zu lassen. Ablagestapel 95 µL des Überstandes verlassen 5 µL in jedem Röhrchen.
    9. Rohre auf Magnetstativ verlassen und waschen durch Zugabe von 200 µL von 80 % Ethanol. Rohr für 30 sitzen lassen s dann entfernen und entsorgen Sie überstand. Wiederholen Sie waschen. Lassen Sie Rohre auf Magnetstativ für 15 min trocknen.
    10. In 22,5 µL Wiederfreisetzung Puffer und verrühren Sie bis Perlen suspendiert sind. Auf Bank 2 min inkubieren, dann weiter nach Magnetstativ bis flüssigen Kurven klar (~ 5 min). Pipette 20 µL der Probe in neue PCR-Röhrchen (7th).
  7. Bringen Sie benötigte Kit-Komponenten auf Raumtemperatur. 5 µL des PCR-Primer-Mix und 25 µL des PCR-master-Mix aus Kit auf Probe übertragen (7th PCR tube) mit indizierten Proben. Mischen Sie Probe und Cap Tube.
    1. Thermocycler mit vorgewärmten Deckel setzen Sie Rohre. Programm ausführen: 98 ° C für 30 s, dann 15 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s, 72 ° C für 5 min. Halt bei 4 ° C.
  8. Bereinigen Sie Proben durch Zugabe von 50 µL ausreichend gemischt SPRI Perlen Rohr und pipette zu kombinieren. Lassen Sie die Reaktion auf die Bank-Oberseite für 15 min inkubieren.
    1. Verschieben Sie das Rohr in einem Magnetstativ und inkubieren Sie bis flüssigen Kurven (~ 5 min) löschen. Ablagestapel 95 µL des Überstandes verlassen 5 µL in jedem Röhrchen.
    2. Rohr auf Magnetstativ verlassen und waschen durch Zugabe von 200 µL von 80 % Ethanol. Für mindestens 30 s und dann entfernen und entsorgen des Überstands sitzen lassen. Wiederholen Sie dies waschen. Magnetstativ für 15 Minuten trocknen lassen.
    3. 32.5 µL Wiederfreisetzung Puffer dazugeben Sie und mischen Sie, bis die Perlen komplett neu ausgesetzt sind. Auf Bank 2 min inkubieren, dann weiter nach Magnetstativ bis flüssigen Kurven klar (~ 5 min). Pipette 30 µL Probe von jedem Röhrchen in eine neue PCR-Röhrchen.
    4. Bewerten Sie DNA-Menge und Qualität durch Wiederholen der Schritte 6.1 und 6.2 mit dem entsprechenden Chip. Fahren Sie mit Schritt (Schritt 9) bündeln.

8. kleine RNA-Bibliothek-Vorbereitung für die SncRNAs. 17

Hinweis: Protokoll Schritte anhand des Herstellers Anweisungen17.

  1. Starten Sie kleine RNA-Bibliothek-Prep mit ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL Globin-reduzierte RNA samples (4 µL).
  2. Adapter-Ligatur
    1. Verbinden Sie den Adapter 3' durch mischen gründlich 1 µL Adapter, 2 µL Nuklease-freies Wasser und 4 µL RNA-Probe Globin reduziert. Bei 70 ° C für 2 min inkubieren Sie und dann sofort auf Eis.
    2. Fügen Sie 10 µL 2 x Ligatur Puffer und 3 µL Ligatur-Enzym-Mix, mix und 16 ° C für 18 h inkubieren.
      Hinweis: Erhöhung der Probe Inkubationszeit bis zu 18 Stunden bei einer niedrigeren Temperatur von 16 ° C empfiehlt sich für Studien methylierte RNA-Spezies, wie z. B. Piwi RNAs interessiert. Die längere Inkubationszeit ermöglicht Ligatur Effizienz aufgrund der Klasse von Modifikationen der Phase 3' Adapter Ligatur.
    3. Die Ligatur Mischung Adapter-Dimer-Bildung von überschüssigen 3'-Adapter fügen Sie 1 µL reverse Transkription Grundierung in 4,5 µL Nuklease-freies Wasser hinzu.
    4. In einem vorgeheizten Thermocycler programmiert für 5 min bei 75 ° C, 15 min bei 37 ° C, 15 min bei 25 ° C inkubieren und bei 4° c zu halten
    5. Denaturieren Sie 1 µL vorverdünnt 5'-Adapter pro Probe in einem Thermocycler bei 70 ° C für 2 min und dann sofort auf Eis legen.
    6. 1 µL der denaturierten 5'-Adapter, 1 µL 10 x 5' Ligatur Puffer und 2,5 µL Ligatur Enzyms 5' hinzufügen. Mischen und 25 ° C für 1 h inkubieren.
  3. cDNA Synthese und Verstärkung
    1. Mischen von Pipettieren 30 µL RNA 5′/3′-Adapter-ligiert, 8 µL der erste Strang Puffer, 1 µL RNase-Inhibitor und 1 µL Reverse Transkriptase. Inkubieren Sie die Mischung bei 50 ° C für 60 min. gehen Sie sofort zum PCR Verstärkung oder Hitze inaktivieren die Reaktion bei 70 ° C für 15 min und Lagerung bei-20 ° C.
    2. PCR verstärkt die 40 µL Reverse Transkriptase Reaktion durch Zugabe von 50 µL des PCR-master-Mix, 2,5 µL RNA PCR Primer, fügen 2,5 µL benannten RNA PCR Primer Index zu probieren, und Nuklease-freies Wasser zu einem Gesamtvolumen von 100 µL. durch Pipettieren mischen. PCR in den Thermocycler mit folgenden Radsport Bedingungen ausgeführt: erste Denaturierung bei 94 ° C für 30 s; 11 Zyklen von 94 ° C für 15 s, Glühen auf 62 ° C für 30 s und Erweiterung bei 70 ° C für 15 s; gefolgt von eine letzte Verlängerung bei 70 ° C für 5 min; Proben können bei 4 ° C in der Cycler stattfinden.
    3. Hinweis: Indizes werden zum Zweck der Bündelung der Probe hinzugefügt.
  4. Probe-Bereinigung
    1. Aus dem DNA-Bereinigung Kit hinzufügen 500 µL Puffer Bindung (5 M Gu-HCl, 30 % Isopropanol) um die 100 µL des PCR amplifizierten Probe um effiziente Bindung an die Spin-Spalte-Membran zu ermöglichen.
      Hinweis: Wenn die Bindung Puffer pH-Indikator enthalten zu überprüfen hat ist die Farbe der Mischung gelb.
    2. Pipette 600 µL Mischung von Probe und Bindung Puffer in eine Filterpatrone innerhalb einer 2 mL Sammelröhrchen Spin für 30-60 s bei 17.900 X g in einer Tischplatte Zentrifuge. Entsorgen Sie durchströmten.
    3. Waschen Sie die Filterpatrone in dem gleichen Sammelrohr mit 0,75 mL Set Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 80 % Ethanol) von spinning für 30-60 s bei 17.900 X g in einer Tischplatte Zentrifuge und verwerfen den Fluss-durch. Drehen Sie die Filterpatrone trocken für eine zusätzliche 60 s.
    4. Legen Sie den Filtereinsatz in eine saubere 1,5 mL Sammelröhrchen. Fügen Sie 30 µL Elution Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5), lassen Sie die Spalte stehen für 60 s und dann Spin für 60 s bei 17.900 X g in einer Tischplatte Zentrifuge.
  5. Bewerten Sie Probenqualität durch Wiederholen der Schritte 6.1 und 6.2 mit dem entsprechenden DNA-Chip. Bewegen Sie zur Zusammenlegung Schritt (Schritt 9).

9. Beispiel pooling für die Sequenzierung

  1. Pool-Barcodes und QC'ed Proben von einrichten und Beschriftung neue Rohre (oder ein 96 well PCR-Platte), um die mRNA oder NcRNA Proben enthalten. Übertragen Sie 13 µL jeder Barcode 10nM Bibliothek auf entsprechende Rohre (oder Brunnen in die neue Platte) pro des Herstellers Anweisungen16,17. Reichen Sie Mischproben für die Sequenzierung ein, stellen Sie sicher, ähnliche lesen Sie Längen zu wählen, wenn Proben auf dem gleichen Chip ausgeführt werden sollen.

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Representative Results

Die repräsentativen Proben in unserer Studie sind die Globin und Ribo-abgereicherte Vollblut-Proben. Das repräsentative Ergebnis des Protokolls besteht aus einer Globin abgereichertem Bibliothek Probe mit einer RNA-Integrität-Anzahl (RIN) über 7 (Abbildung 1(ein) und 260/280 nm Konzentrationsverhältnis bei oder über 2 (Abbildung 1b und 1 c). Validierung der Probe Ergebnisse erfolgte mittels Spektralphotometer, um die letztendliche Konzentration an jede Bibliothek zu geben und anhand der Chip-basierten Elektrophorese RIN-Nummer zusammen mit einer Grafik der Gipfel geben, die zeigen, welche Moleküle (mRNA oder NcRNA) erfasst wurden Plattengröße in der Bibliothek-Probe vor der Zusammenlegung und Sequenzierung. Für die aktuelle Studie wurde der Fokus auf der mRNA und kleine NcRNAs nur gelegt. Für die mRNA-Bibliotheken ist das repräsentative Ergebnis ein Electropherogram Peak bei ~ 280 bp (Abbildung 1-d). Für die kleinen NcRNAs repräsentative Ergebnisse bestehen aus eine Reihe von Gipfeln von ~ 100-400 bp (Abbildung 1e), mit Spitzenwerten bei 143 ~ und ~ 153 bp entsprechen MiRNAs und PiRNAs, beziehungsweise. Unsere Ergebnisse zeigten, dass unsere optimierte Technik Bibliotheken mit RIN Zahlen ergeben, die von 6,3 (suboptimale) bis 9,2 (über optimale) reichte. Dies erwies sich als eine Verbesserung im Vergleich zu anderen Studien, die Globin-Abbau-Methoden verwendet und konnten nur RIN Nummern an oder in der Nähe von 6 zu erreichen. Die Chip-basierte Elektrophorese, die Ergebnisse zeigten auch, dass aus einer einzigen Blutprobe RNA-Molekül Erfassung von Gipfeln Vertretung mRNA und NcRNA (Figuren 1D und 1e) erreichen kann und Stichprobengrößen einfügen, die sowohl großen als auch kleinen abgedeckt nicht-kodierende RNA-Moleküle. Diese Ergebnisse sind repräsentativ für die optimale RIN Noten und fügen Sie Größen um sicherzustellen, dass Qualität Abschrift liest können benötigt aus den vorbereiteten Bibliotheken für fast alle NGS RNA-Seq-Plattformen sequenziert.

Figure 1
Abbildung 1 : Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 1b
Abbildung 1 b : Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 1c
Abbildung 1 c : Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 1d
Abbildung 1 d : Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 1e
Abbildung 1e : Vertreter ergibt sich für die mRNA und nicht-kodierende RNA Ausdruck Bibliotheken aus Einzelproben von porcinen Vollblut. (a) Elektrophorese Datei ausführen zusammenfassende Darstellung der RIN Zahlen Pre-Globin und Post-Globin-Reduzierung. Vertreter Electropherograms (b) Pre-Globin Reduzierung und (c) Post-Globin Reduzierung einer einzigen porcinen Vollblut-Probe. (d) Vertreter Electropherograms Globin und Ribo-abgereicherte Vollblut mRNA Bibliothek Proben vor der Zusammenlegung und Sequenzierung. (e) Electropherograms Vertreter der Globin erschöpft SncRNA Vollblut-Bibliotheken der gleichen Proben im Bedienfeld "d vor der Zusammenlegung und Sequenzierung vorgestellten Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der erste wichtige Schritt in das Protokoll, das es optimiert gemacht enthalten die zusätzlichen Globin Erschöpfung Schritte, die es möglich gemacht, Qualität liest aus Vollblut-Proben zu erhalten. Eine der größten Einschränkungen zur Verwendung von Vollblut in Sequenzierung Studien sind die hohe Anzahl der Lesevorgänge in der Probe, die Globin Moleküle ordnen und reduziert das liest, die andere Moleküle Interesse18zuordnen könnte. Daher mussten wir bei der Optimierung des Protokolls für unsere Probentyp, einen Globin Erschöpfung Schritt um sicherzustellen, dass die höchste mögliche mRNA und nicht-kodierender RNA durch Sequenzierung erfassen zu integrieren. Alle Beispiele wurden Globin entfallen hohe Globin Transkripte mit Schweinen spezifischen Hämoglobin A und B (HBA und HBB) Oligonukleotide basierend auf den Vorgang von Choi Et Al., 201414erschöpft. Ein weiterer wichtiger Schritt war die Verwendung eines Ribo-Erschöpfung Extraktion Kit ermöglichte für die Fähigkeit zu entfernen unerwünschte RNA-Moleküle aus unseren Proben gleichzeitig Beibehaltung Polyadenylated nicht-kodierende und virale RNA-Moleküle experimentelle Sehenswürdigkeiten Unsere Bibliotheken für Sequenzierung19. Darüber hinaus konnten wir gemeinsam mit Einzelproben Codierung (mRNA) und nicht-kodierenden (klein und lange) RNA Bibliotheken erstellen, indem die kleinen RNA Bereicherung und Größe Auswahl Schritte entfernen. Auf diese Weise konnten wir die RNA Aliquote zur Bündelung zu maximieren und zu garantieren, dass wir genügend Volumen für die Sequenzierung ermöglichen geschickt. Optimierung aller des Herstellers Protokolle wurden durchgeführt, um mRNA und nicht-kodierende RNA Recovery für nachgeschaltete Bibliothek-Einrichtung zu erhöhen. Wir auch nicht-kodierende RNA Bibliothek Vorbereitung für kleine nicht-kodierende RNA Teil unserer nachgelagerte Analyse durch das Hinzufügen von zusätzliche Zeit für die PCR-Inkubation pro Anweisungen des Herstellers zur Unterbindung der methylierten RNAs Effizienzsteigerung optimiert und die Wahrscheinlichkeit der Wiederherstellung Piwi-RNAs.

Die Grenzen des optimierten Protokolls wurzelt in der mangelnden Spezifität, die macht es auch ideal für mehrere Analysen aus einer einzigen Probe. Durch das Entfernen der Anreicherung und Auswahl Portionen der nicht-kodierende RNA Bibliothek Vorbereitung, schränken wir neuartige kleine RNA Entdeckung20 um es abwägen gegen kleine und lange nicht-kodierende RNA-Moleküle zu erwerben. Daher das optimierte Protokoll gibt einen guten Überblick über die Arten von nicht-kodierenden Ausdruck, sondern erfordert zusätzliche Verarbeitung während der analytischen Phase der Zuordnung spezifischere Informationen über die Klassen zu gewinnen und Größen von nicht-kodierende RNA Ausdruck erfasst den Probe. Eine weitere Einschränkung der Methode ist durch die Einbeziehung der Globin Erschöpfung Schritte, die die Gesamtzahl der RIN senken wird. Wir waren in der Lage, dies zu beheben, durch die erste Untersuchung die RIN Zahlen vor und nach dem Globin Erschöpfung zu verstehen, wie groß eine Verringerung der RNA Integrität Wir erleben würde. Diese Ergebnisse, die zeigten, wir konnten erleben, einen Tropfen ~ 1-2 Punkte. Um für diesen Rückgang berücksichtigen optimiert wir weiter das Globin Erschöpfung Protokoll 6 µg Probe statt der empfohlenen 10 µg. Dies half, verbessern unsere RIN zahlen, sowie, Probe zu sparen. Darüber hinaus wir auch dünnwandige Microamp Reaktionsgefäßen benutzt und Eistee Röhren sofort nach dem ersten denaturierenden Schritt. Dies erlaubt uns die Reaktion schneller zu stillen, zulassend verbesserten RIN Zahlen auf die Globin Proben aufgebraucht.

Das geänderte Protokoll in dieser Studie verwendeten hat mehrere Vorteile gegenüber der Basisbibliothek Zubereitungsmethoden in anderen Studien verwendet, wo nur mRNA oder nicht-kodierender RNA werden getrennt untersucht. Die Änderungen, die wir für die Optimierung für effizienten Einsatz von Vollblut als unsere Probentyp erlaubt. Dies ist vorteilhaft, Zukunftsforschung, weil Vollblut als eine Probenart weniger Schritte zur Erfassung und Verarbeitung als die Leukozyten Portion des Blutes hat. Darüber hinaus wird Vollblut hat die zusätzlichen Vorteile erlauben Forschern, systemische Reaktionen zu untersuchen und wiederholt vom Tier gesammelt werden können. Allerdings gibt es eine Einschränkung der Verwendung von Vollblut-Proben, dass die Menge an Blut gesammelt für Alter und Größe des betreffenden Organismus abhängt. Kleinere Mengen von Blut führt um zu geringeren Erträgen RNA, aber die Methode hier vorgestellt wird dual Bibliothek Schaffung von mindestens 2,5 mL Vollblut. Dies erlaubt uns, eine Probe zu untersuchen, mRNA und nicht-kodierenden Ausdruck und korrelieren sowohl für eine Einzelperson einen Snapshot in der Zeit, effektiv ermöglicht es uns, mehr Informationen als die traditionelle Bibliothek Zubereitungsmethoden zu sammeln. Auch, durch Ausführen der Ribo-Erschöpfung haben wir es möglich Transkripte zu reduzieren, die zu einem Sequenzierung liest Abbau könnte, Beibehaltung der nicht-kodierenden und viralen Transkripte, die verloren gehen können, während traditionelle Bibliothek Erstellung mRNA zu studieren. Auf diese Weise verdreifacht Unser optimiertes Protokoll die Menge an Informationen, die aus einer einzigen Probe gewonnen werden können. Weitere wesentlichen Änderungen, die wir gemacht, um die Methode zur Erfassung von mehr RNA-Spezies-Informationen zu erleichtern wurden: das Ändern des PCR-Platte, schnell die Reaktion zu stoppen, die RNA Reinheit Ausbeute; verbessert eine längere Thermocycler Inkubation Ligatur für mögliche Erholung der methylierten RNAs zu erhöhen; und nicht mit einer Größenauswahl gel, um alle nachweisbaren NcRNAs zu ermöglichen, unabhängig von Länge identifiziert. Für die nachgelagerte Analyse erlaubt dies für den Fang von mehreren nicht-kodierende RNAs zwischen 18nt-200nt in der Länge.

Unsere Gruppe konnte durch den Einsatz dieser Methode optimiert, ein Protokoll vorgelegt, die auf Vollblut-transkriptomischen-Analysen angewendet werden können und ermöglichen mRNA und nicht-kodierender RNA aus einer einzigen Probe.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Erwähnung von Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in diesem Artikel wird ausschließlich zum Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vor allem von unterstützt die von der USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 und zum Teil durch USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Diese Studie wurde zum Teil durch einen Termin, um die landwirtschaftliche Forschung Service Teilnahme Forschungsprogramm verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung (ORISE) durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem US-Department of Energy (unterstützt DOE) und das US-Landwirtschaftsministerium. ORISE wird von Oak Ridge verbundene Universitäten DOE vertraglich nicht verwaltet. DE-AC05-06OR2310.

Wir möchten Dr. Kay Faaberg für die HP-PRRSV infektiöse Klone, Dr. Susan Brockmeier für ihre Hilfe mit Tieren an dem Experiment beteiligt und Sue Ohlendorf für Sekretariatsaufgaben in der Manuskripterstellung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 141 mRNA nicht-kodierender RNA RNA-Seq Vollblut epigenetische Globin Reduktion
Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut
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Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

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