Summary
本文介绍了通过对亚临界co2流体的降压, 将传统的二维电纺纳米纤维垫扩展为三维 (3d) 支架的技术。这些增强型支架是3d 的, 紧密地模仿细胞纳米粒子的线索, 并保留包存在纳米纤维中的生物分子的功能。
Abstract
电纺已成为生产合成的, 功能性支架的首选技术, 由于仿生细胞外基质和易于控制的组成, 结构和直径的纤维。然而, 尽管有这些优点, 传统的电纺纳米纤维支架还是存在着不组织的纳米纤维取向、低孔隙率、小孔径和主要是二维垫子等局限性。因此, 非常需要开发一种新的工艺来制造能够克服上述限制的电纺纳米纤维支架。在此, 概述了一种新颖而简单的方法。传统的二维纳米纤维垫被转化为具有所需厚度、间隙距离、孔隙率和纳米粒子的三维支架, 以便通过次临界co2流体的降压, 实现细胞播种和增殖。除了为组织再生提供支架外, 这种方法还提供了封装生物活性分子 (如用于局部药物输送的抗菌肽) 的机会。co2膨胀纳米纤维支架在组织再生、伤口愈合、三维组织建模和外用药物输送方面具有巨大的潜力。
Introduction
开发一种可植入患者体内的合成支架, 以帮助组织修复和再生的概念, 已经渗透了几十年的再生医学领域。理想的合成支架用于诱导细胞从周围的健康组织迁移, 提供了细胞播种, 粘附, 信号转导, 增殖和分化的架构, 支持血管化, 允许充分的氧合和营养传递, 并促进宿主免疫活动, 以确保植入后成功1。此外, 它还可作为嵌入抗菌分子的载体, 以帮助伤口愈合1,3,6,7, 8,9.控制合成支架中这些生物分子的时间释放的能力是工程支架1时考虑的另一个理想属性。
电纺已成为生产纳米纤维支架1、2、3、4、5、6的一种应用。以前试图创建一个纳米纤维脚手架, 如这里讨论的, 已经做了不同程度的成功。然而, 传统的纳米纤维支架实现这些目标的能力有限。传统的纳米纤维支架大多是二维垫1,3。这些非膨胀支架密集地与小毛孔大小;这限制了细胞的浸润、迁移和分化, 因为它没有促进与体内1、7、8、9相似的环境。为此, 建立了新的3d 电纺纳米纤维支架制备技术, 以修正二维纳米纤维垫固有的缺陷。这些技术导致3d 脚手架;然而, 由于生产方法需要水溶液和冷冻干燥程序, 它们的适用性有限。这种处理导致纳米纤维的随机分布, 没有受限制的组织, 适当的厚度, 或所需的孔隙率, 以提供足够的纳米粒子线索, 细胞迁移和增殖所需的。这些因素导致以前的3d 电纺纳米纤维支架缺乏足够的模仿活组织 1,7,8, 9.
最近, 利用硼氢化钠 (nabh4) 水溶液处理和预先设计的模具, 开发了一种具有更好的细胞外基质 (ecm) 仿生的扩展三维支架,以帮助更好地控制所产生的脚手架的形状7,8。然而, 这种方法并不理想, 因为它需要使用水溶液, 化学反应, 和冷冻干燥, 可能会干扰聚合物和任何封装的生物分子是水溶性的。使用的添加剂也可能在组织再生过程中引起副作用 8,9。本文概述的 co2 膨胀方法大大减少了加工时间, 消除了对水溶液的需求, 并在比以前更大程度上保留了生物活性分子的数量和功能已建立的方法9。
在以前的研究中, 抗生素、银、1α、25二羟基维生素 d3和抗菌肽 ll-37 分别加载到纳米纤维支架中, 并结合起来研究这些支架释放剂的潜力。进一步帮助伤口愈合9,10,12,13。为了演示这种纳米纤维支架膨胀的方法, 将将荧光染料 coumarine 6 加载到支架中, 以证明将支架嵌入各种所需化合物的潜力。这种膨胀纳米纤维支架与包封的生物活性分子结合在组织再生、伤口愈合、三维组织模型的创建和药物局部传递方面具有巨大的潜力。
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Protocol
下文概述的所有体内程序都得到了内布拉斯加州大学医学中心 iacuc 委员会的批准。
1. 准备标准电纺解决方案
- 在一个20毫升的玻璃管里在二氯甲烷 (dcm) 和 n, n-二甲基甲酰胺 (dmf) 的溶剂混合物中溶解2克聚 (-己内酯), 浓度为 10% (w/v), 浓度为 4: 1 (w/v)。
注意: 将 dcm 和 dmf 放在通风良好的引擎盖中, 以避免暴露在烟雾中。不要将 dcm 暴露在塑料材料中。 - 将玻璃管放入实验室旋转器中, 直到溶液变得清晰。解决方案可能会在一夜之间混合。
- 如果打算将肽或药物等生物活性物质嵌入脚手架, 请创建一个单独的溶液, 并储存在 4°c, 直到准备使用。
- 用20毫升的 pcl 溶液制备荧光染料溶液 (50 mg/ml)。
2. 设置电纺设备 (图 1 a)
- 将 pcl 溶液添加到连接21规格钝针的20毫升注射器中。确保注射器和相关的注射器中没有空气。
- 将旋转钢桶与离针尖12厘米的地面收集器放在一起。
- 使用鳄鱼夹, 将直流电 (dc) 高压电源连接到针头, 并确保集电极接地。
注意: 在处理任何连接的材料之前, 请务必关闭电源。
3. 电纺
- 对于 pcl 溶液的20毫升, 将注射器泵的参数设置为: 直径 = 20.27 mm, 流速 = 0.5 mll h. 检查针头尖端是否形成液滴。
- 如果需要加入生物活性分子, 请设置该装置, 以便同轴电纺(图 1 b)。使用皮下注射针创建定制的同轴喷嘴。
注: 此类喷嘴也可在商业上使用。请注意, 染料溶液是用来模拟添加这种分子的。- 在水中制备1% 的荧光染料香豆素6溶液。在小注射器中加入3% 染料的3毫升。将注射器连接到与 pcl 溶液相同的同轴喷嘴。再次, 确保没有气泡。
- 对于这个3毫升溶液, 设置注射器泵的参数如下: 直径 = 9.49 mm, 流速 = 0.02 mlh. 检查液滴是否在针尖形成。
- 在主轴 (22 规格针) 和距离纺丝机20厘米的接地收集器之间施加20千伏的电势。收集对齐的纳米纤维垫在一个鼓旋转在 2, 000 转/分。一旦 pcl 纳米纤维垫的厚度达到 ~ 1 毫米, 就会收集到它们。
4. 采用带阵列孔的 pcl 纳米纤维垫。
- 制备 pcl 纳米纤维垫。
- 将 pcl 珠溶解在由 dcm 和 dmf 组成的溶剂混合物中, 其浓度为 4:1(v/v), 浓度为 10% (pcl) (w/v)。使用注射器泵以 0.7 mlh 的流量泵送 pcl 溶液, 而在主轴 (22 克针) 和距离纺丝器12厘米的接地收集器之间, 可能会施加20千伏的电位。
- 使用转速大于500转/分的旋转鼓收集纳米纤维膜。
- 将 pcl 纳米纤维垫浸入液体 n2 中 5分钟 (即变硬)。将 pcl 纳米纤维垫保存在液体n2中, 并使用 0.5 mm 直径的冲床打孔 pcl 纳米纤维垫。
5. 通过亚临界 co2 液体,在无 araych 孔的情况下扩增二维纳米纤维垫 (图 2)。
- 将 pcl 纳米纤维垫放入液氮中 5分钟, 并在浸入液氮的情况下, 使用锋利的手术剪刀切割成1厘米 x 1 厘米的正方形, 以避免边缘变形。
- 将切割垫放入一个30毫升的离心管中, 其中含有 ~ 1 克的干冰。紧盖盖子, 让干冰变成液体二氧化碳.
- 一旦液体在管内形成, 通过打开瓶盖迅速释放压力。
注意: 使用液氮和干冰时使用适当的热防护装备。不要向面部打开加压管。离心机管不应反复使用。 - 取出并观察管内的膨化脚手架。将脚手架放入带有干冰的新离心管中, 重复, 直到达到所需的厚度。在与细胞孵育之前, 在环氧乙烷中对膨胀的纳米纤维支架进行灭菌。
6. 膨胀纳米纤维支架的表征
- 利用扫描电镜 (sem) 表征膨胀纳米纤维支架的形态和结构。
- 使用 40 ma 的溅射涂布机将样品用双面导电胶带放在金属螺柱上, 并使用铂金涂层40秒。
- 根据先前的研究 9, 使用 sem 检查纤维。在15千伏的加速电压下采集图像。
- 表征释放肽的体外释放谱和生物活性。
- 重量10毫克的纳米纤维膜之前和之后的膨胀在二氧化碳.
- 将样品浸泡在 pbs 缓冲液中, 并在不同时间点 (0-28) 收集10μl 上清液。
- 使用酶联免疫吸附剂检测 (elisa) 试剂盒量化收集到的上清液中 ll-37 肽浓度。
- 检查细胞在体内的浸润和宿主的反应。
- 将9周大的 sprague-dawley (sd) 大鼠放入麻醉室, 连接到异氟烷蒸气并麻醉大鼠。在大鼠成为完全麻醉后, 在没有感情的情况下将大鼠转移到手术台上。在手术过程中, 用用蒸发器连续麻醉大鼠。用动物的剃须刀刮掉老鼠背的毛, 用碘和酒精皮肤磨砂对其进行消毒。使用手术刀在背上的上侧部通过1.5 厘米的切口创建皮下口袋。
- 使用每个切口的推子将一个膨胀的纳米纤维支架 (1.5 mmmmmhm 厚) 插入皮下口袋。使用订书机关闭切口。
- 在 1, 2 和 4周, 安乐死的大鼠与95% 的二氧化碳。用手术剪刀轻轻解剖外植体和周围组织。在组织学分析之前, 将组织浸入福尔拉林中至少 3天, 然后与石蜡嵌入。用微体解剖组织, 然后进行血红素和 eosin (h & e), 马松的三色体染色。
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Representative Results
通过对亚临界co2流体的降压将传统的二维电纺纳米纤维垫扩展到三维支架的效果表现在不同的容量上: 支架的厚度从未经处理时的1毫米增加到 2.5 mm。19.2 毫米, 分别进行1和 2 co2 处理 (图 3-a-c)。孔--对细胞幼苗至关重要的结构特征--也以与厚度增加相对应的方式增加 (图 3c)。未处理的垫子的孔隙率分别从未处理垫子的99.0 增加到第一次和第二次处理后的92.1 和 99.0 (图 3d)。这一点很重要, 因为细胞穿透脚手架的程度, 从而诱导再生的功效在很大程度上取决于孔隙率1。
sem 图像显示, 未经处理的2d 垫子的密集包装, 纤维结构转化为有序的层状结构与对齐的纳米纤维后, 与 co 2 (图 3e-h)。以往的研究已经得出结论, 类似的层状结构与有组织的纤维可能是至关重要的保存纳米粒子线索再生组织, 如肌腱, 肌肉, 和神经7,8。然而, 这些研究检查了用 nbh47,8扩大的支架。这种方法需要额外的加工时间和溶剂, 可以从支架 7,8中浸出生物活性分子。nbh4 是一种强还原剂, 可与包封的生物活性分子发生反应.相反, 与使用 nabh4方法膨胀的支架相比, 使用亚临界 co2 流体进行膨胀可保持预先播种到支架中的其他分子的生物活性 (图 4)。这证明了使用香豆素6染料;染料的绿色更好地保留在用co2展开的支架中 (图 4), 这表明使用亚临界 co2 流体进行膨胀可以更好地保持封装的分子的完整性在 pcl 支架上。
根据制造商的说明, 用维生素 elisa 试剂盒 (图5a) 测定了支架扩张前后的抗菌肽 ll-37 的释放动力学。采用铜绿假单胞菌 (铜绿假单胞菌) 培养, 评价了 ll-37 含胡椒纳米纤维支架在 co 2 扩张前后的抗菌效果。用支架孵育后的活菌落数量进行了量化。结果表明, co2 膨胀、ll-37 负载支架的抗菌活性与未膨胀 ll-37 负载支架相似, 表明膨胀过程可以保持封装 ll-37 的生物活性。肽 (图 5b)。
通过皮下植入对大鼠方格孔的 co2 膨胀纳米纤维支架进行了进一步的体内研究。这允许在孔内进行细胞迁移和扩散, 并允许在扩展过程中创建的纳米纤维层内进一步渗透 (图 6)。扩大支架显示, 从第1周到第4周, 从第1周到第4周, 形成的血管数量 (图 6c, e) 和多核巨细胞 (图 6C, f) 显著增加。进一步的免疫组织学染色结果显示, c-c 趋化因子受体7型 (ccr7) 阳性浸润巨噬细胞数量减少, 分化206(CD206) 阳性浸润巨噬细胞的集群数量增加植入后第1周至第4周。
图 1: 典型的电纺设置.介绍了一种典型的同轴电纺装置。电纺需要三个主要组件: 高压电源、纺纱机和导电集热器。同轴纺丝使用两种液体纺丝纳米纤维支架;这允许其他分子的封装。纳米纤维对齐和组件可以通过改变旋转鼓的转速通过集热器进行增强。在这个协议中, 使用两个皮下注射针创建了一个定制的喷嘴。类似的喷嘴也可在商业上买到。这一数字是根据谢旭人等14人改编的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用亚临界 co2 流体展开脚手架的步骤.(a)使用可密封且能承受压力的容器, 如30毫升塑料离心管。(b)添加1厘米 x 1 厘米的二维 pcl 纳米纤维垫。(c)加入 ~ 1 克干冰。(d)密封容器。(e)允许在管内施加压力。这将使固体 co2变成液体co2。当液体聚集时, 迅速释放管的密封。这将导致液体co2迅速成为气体co2, 导致 co2 渗透二维纳米纤维垫。(f)观察3d 脚手架。这些步骤可以重复, 直到达到所需的厚度。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 使用 co2 亚临界流体扩展前后的二维垫子的可视化.(a)照片显示 pcl 纳米纤维垫在治疗亚临界 co2 液体 (右) 之前和第一次处理后 (左)。(b)照片显示 pcl 纳米纤维垫在第一次处理之前使用 co2 亚临界液 (右) 和第二次处理后 (左).(c)图显示了 pcl 纤维垫在一次和两次处理后的厚度, 并采用亚临界 co2 流体处理。(d)图显示了 pcl 纤维垫在一次和两次非临界 co2 流体处理前后的相对孔隙率。(E-H)图像显示了 pcl 纤维垫在处理前通过扫描电镜采集的 pcl 垫的横截面外观。(G-H)亚临界 co2 流体处理后 pcl 纤维垫的扫描电镜图像。这一数字已从江泽民等人的9 人改编而成。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 香豆素6染色 pcl 纳米纤维垫在膨胀前后与亚临界 co2 流体和 nbh4 水溶液一起膨胀.(a)图像显示了在与 co2 (右) 和 nabh4 (左) 扩张后 pcl 支架中残留的库马6染料的数量.(b)图片显示 pcl 脚手架的总顶视图及其相应的荧光, 顺序如下: 原始脚手架 (右下角)、装有 coumarine 6 染料的2d 垫 (右上角)、装有 coumarine 6 染料的 pcl 脚手架, 并扩展了 co2 (左上角), nbh4 (左下角)。(c)图显示了 pcl 垫子未经处理后, 通过亚临界co2流体膨胀, 并通过 nabh4 处理膨胀后, 香豆素 6染料的荧光强度。荧光被图像 j 软件量化。这一数字已从江泽民等人的9 人改编而成。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 封装在 pcl 支架中的生物活性分子。(a)图描述了抗菌素肽 ll-37 在2d 膜中的相对释放, 而亚临界 co2 流体膨胀三维支架 ( b)图描述了不同 pcl 纳米纤维垫暴露在 p 中时的抗菌效果.铜绿假单胞菌这一数字已从江泽民等人的9 人改编而成。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: pcl 纳米纤维支架在大鼠皮下背侧有和不具有亚临界co2扩张的体内反应。(a) h & e 染色。绿点表示细胞浸润的边界。(b)马松的三色染色。绿色箭头表示胶原蛋白沉积。(c)高放大的 h-e 染色图像。绿色箭头表示血管。(d)高放大的 h & e 染色图像。绿色箭头表示巨型细胞。(e)图描述了每毫米2血管的生长情况。(f)与使用亚临界 co2 扩展的 pcl 垫子相比, 图量化了渗入传统二维 pcl 垫子的巨型细胞数量。这一数字已从江泽民等人的9 人改编而成。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
研究了通过 co2 降压技术将传统的二维电纺纳米纤维垫转化为扩展的三维支架。传统的二维纳米纤维垫通过亚临界 co2 流体成功地展开。关键的步骤是在优化的条件下制造2d 纳米纤维垫, 并在不变形边缘的情况下切割垫子 (例如, 使用锋利的手术剪刀)。与传统的二维垫相比, 这种 co2 膨胀纳米纤维支架具有许多优点, 包括层状结构 (图 3a-b)、更少的填料密度 (图 3d-h) 和更高的孔隙率 (图 3A)。这种膨胀方法与现有的膨胀方法相比也很有利, 因为它的加工速度更快, 并且减少了封装活性生物分子的整体损失, 因为这种技术排除了水溶液和冷冻干燥程序8,9。然而, 这种技术的局限性在于, 聚合物纳米纤维的形态不应在亚临界co2流体中溶解。例如, plga (50:50) 纳米纤维垫不能使用此技术展开。这种纳米纤维垫可以使用其他气体液体进行膨胀。
我们之前的研究表明, 与二维垫8相比, 细胞在膨胀的纳米纤维支架中播种的方式更加均匀。在这项工作中, 血管形成率显著提高 (图 6c, e), 并观察到宿主免疫细胞浸润在 co 2 膨胀纳米纤维支架与方形阵列孔跟随大鼠皮下注射 (图 6d, f)。血管生成和免疫细胞浸润表明, 支架与宿主组织接触, 可能与受损组织再生所需的归巢细胞接触;这意味着植入后进入宿主9的成功率较高。
co2膨胀支架也有可能与各种肽和其他分子结合在一起, 这些分子可以帮助获得所需的反应。在这里, 预期的效果是成为组织再生的支架, 同时通过纳入的 ll-37 肽提供抗菌活性。与使用 nah-4 膨胀的支架相比, 用亚临界co2流体膨胀的支架也显示出更好的整合分子保留.封装在 pcl 支架中的染料分子更好地保留 (图 4)。此外, 与二维垫相比, 3d co 2 膨胀支架释放的抗菌肽 ll-37 的比例略高 (图 5a)。ll-37 的生物活性得以保留, 因为与二维支架相比, co2 膨胀支架具有类似的抗菌效果 (图 5b)。
这种新的三维扩展方法, 标志着合成脚手架的生产不再局限于使用二维纳米纤维垫。所提供的数据表明, 这种膨胀方法能更好地保持膨胀纳米纤维支架中包封生物活性材料的数量和生物活性。同时, 膨胀的纳米纤维支架模仿体内9的纳米粒子环境, 这一特性极大地有助于诱导组织再生1。在未来, 这些 co2膨胀支架可能在帮助伤口愈合和组织再生以及三维组织模型创建和局部控制的药物输送方面有潜在的应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所 (2p20 gm103440-06 和1r01gm123081 至 j. x.)、otis glebe 医学研究基金会 ne lb606 和内布拉斯加州医科大学启动资金的资助中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | 440744 | |
| N,N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-199-1 | |
| Dichloromethane | Fisher Chemical | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| Rotating Steel Drum | customized | This serves as a collector during electrospinning. | |
| Syringe Pump | Fisher Scientific | 14-831-200 | Coaxial spinning requires two single syringe pumps. |
| Revolver | Lab Net International | H5600 | Adjustable lab rotator for mixing solutions |
| Hypodermic Needle (27G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26426 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| Hypodermic Needle (21G x 1 1/2") | EXCELINT International Co | 26416 | This is part of the example customized coaxial nozzel shown. |
| High Voltage DC Power Supply | Gamma High Voltage Research | ES30 | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Nova 2300 | |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| LL 37 ELISA Kit | Hycult Biotech | HK321-02 |
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