Summary
हड्डी explants की पूर्व वीवो संस्कृति हड्डी शरीर विज्ञान के अध्ययन और हड्डी रीमॉडलिंग और हड्डियों के रोगों में दवाओं के संभावित मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नवजात चूहों खोपड़ी से अलग calvarias की तैयारी और संस्कृति का वर्णन करता है, साथ ही साथ इसके अनुप्रयोगों ।
Abstract
हड्डी ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, और ऑस्टियोप्लास्ट और एक खनिज बाह्य मैट्रिक्स का गठन किया गया एक संयोजी ऊतक है, जो इसे अपनी ताकत और लचीलापन देता है और इसे अपने कार्यों को पूरा करने की अनुमति देता है। हड्डी लगातार उत्तेजनाओं की एक किस्म है, जो रोग की स्थिति में हड्डी remodeling नियंत्रण मुक्त कर सकते है के संपर्क में है । हड्डी जीव विज्ञान और रोगों का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए, इन विट्रो और वीवो मॉडल में विकसित करना आवश्यक हो गया है।
यह पांडुलिपि हड्डी के गठन और बोन ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का अध्ययन करने के लिए नवजात चूहों से अलग calvarias की विच्छेदन प्रक्रिया और संस्कृति की स्थिति का वर्णन करती है। इन विट्रो और वीवो मॉडल ों के विपरीत, यह पूर्व वीवो मॉडल वांछित माइक्रोएनवायरमेंट को अनुकरण करने के लिए परिभाषित परिस्थितियों में विविधता करते हुए ऊतक के त्रि-आयामी वातावरण के साथ-साथ हड्डी की सेलुलर विविधता के संरक्षण की अनुमति देता है। इसलिए, बोन रीमॉडलिंग और इसके तंत्र की जांच करना संभव है, साथ ही अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत, जैसे कैंसर कोशिकाओं और हड्डी के बीच बातचीत।
यहां रिपोर्ट किए गए परखों में 5-7 दिन पुराने बीएएलएलबी/सी चूहों से कैलवेरिया का इस्तेमाल किया गया है । प्राप्त हेमी-कैलवेरिया इंसुलिन, स्तन कैंसर कोशिकाओं (एमडीए-एमबी-231) या स्तन कैंसर कोशिका संस्कृतियों से वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं। विश्लेषण के बाद, यह स्थापित किया गया था कि इंसुलिन ने नई हड्डी के गठन को प्रेरित किया, जबकि कैंसर कोशिकाओं और उनके वातानुकूलित मध्यम प्रेरित हड्डी अवशोषण। अस्थि विकास और कैंसर से प्रेरित हड्डियों की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए बुनियादी और लागू अनुसंधान में कैल्वरियाल मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। कुल मिलाकर, यह एक आसान, जानकारीपूर्ण और कम लागत वाली परख के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है।
Introduction
हड्डी एक गतिशील संयोजी ऊतक है जिसमें मांसपेशियों का समर्थन करने, आंतरिक अंगों और अस्थि मज्जा की रक्षा करने और कैल्शियम और विकास कारकों को संग्रहित करने और जारी करनेसहित,कई कार्यहैं। इसकी अखंडता और उचित कार्य को बनाए रखने के लिए, हड्डी ऊतक लगातार रीमॉडलिंग की प्रक्रिया के तहत है। सामान्य शब्दों में, हड्डी पुनर्मॉडलिंग के एक चक्र को हड्डी अवशोषण और हड्डी गठन1में विभाजित किया जा सकता है। हड्डी रीमॉडलिंग के इन दो चरणों के बीच एक असंतुलन हड्डी विकृतियों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, स्तन कैंसर जैसी बीमारियां अक्सर हड्डी अखंडता को प्रभावित करती हैं; उन्नत चरणों में लगभग 70% से अधिक रोगियों के पास हड्डी मेटास्तासेस होंगे या होंगे। जब स्तन कैंसर की कोशिकाएं हड्डियों में प्रवेश करती हैं, तो वे अस्थि चयापचय को प्रभावित करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक अवशोषण (ऑस्टियोप्लास्टिक घाव) और/या गठन (ऑस्टियोब्लास्टिक घाव)3।
हड्डियों की बीमारियों के जीव विज्ञान को समझने और नए उपचार विकसित करने के लिए, हड्डी रीमॉडलिंग में शामिल तंत्र को समझना आवश्यक है। कैंसर रिसर्च में बोन मेटास्टैसिस प्रोसेस और मेटास्टैटिक माइक्रोएनवायरमेंट से इसके रिलेशन की जांच करना जरूरी है । 1889 में, स्टीफन पेजेट ने परिकल्पना की कि मेटास्टेस तब होती है जब ट्यूमर कोशिकाओं और लक्ष्य ऊतकों के बीच अनुकूलता होती है, और सुझाव दिया जाता है कि मेटास्टैटिक साइट माइक्रोएनवायरमेंट4के लिए ट्यूमर की आत्मीयता पर निर्भर करती है। 1 99 7 में, मुंडी और आड़ ने "हड्डी मेटाटैस के दुष्चक्र" की अवधारणा को पेश किया ताकि यह समझा जा सके कि ट्यूमर कोशिकाएं अपने अस्तित्व और विकास को प्राप्त करने के लिए अस्थि सूक्ष्मवातावरण को कैसे संशोधित करती हैं, और कैसे अस्थि सूक्ष्मवातावरण कैल्शियम और विकास कारक5,6,6,7प्रदान करके उनके विकास को बढ़ावा देता है।
हड्डी के पुनर्मॉडलिंग और हड्डी मेटास्टेसिस में शामिल तंत्र की विशेषता और संभावित चिकित्सीय क्षमता के साथ अणुओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह विट्रो में और वीवो मॉडल में विकसित करने के लिए आवश्यक हो गया है । हालांकि, ये मॉडल वर्तमान में कई सीमाएं पेश करते हैं, जैसे हड्डी माइक्रोएनवायरमेंट का सरलीकृत प्रतिनिधित्व, और उनकी लागत8,,9। हड्डी explants पूर्व वीवो की संस्कृति को त्रि-आयामी संगठन के साथ-साथ हड्डी कोशिकाओं की विविधता को बनाए रखने का लाभ है। इसके अलावा प्रायोगिक परिस्थितियों को नियंत्रित किया जा सकता है। एक्सप्लांट मॉडल में मेटाट्रासल हड्डियों, ऊर्ध्वाधर सिर, कालवेरिया, और मंडीबुलर या ट्रैबरकुलर कोर10की संस्कृति शामिल है। पूर्व वीवो मॉडल के फायदे विविध अध्ययनों में प्रदर्शित किए गए हैं। 2009 में, नॉर्डस्ट्रैंड और सहयोगियों ने हड्डी और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं11के बीच बातचीत के आधार पर एक सहसंस्कृति मॉडल की स्थापना की सूचना दी। इसके अलावा, 2012 में, कर्टिन और सहयोगियों ने पूर्व वीवो सहसंस्कृतियों12का उपयोग करके त्रि-आयामी मॉडल के विकास की सूचना दी। इस तरह के पूर्व वीवो मॉडल का उद्देश्य हड्डी माइक्रोएनवायरमेंट की स्थितियों को यथासंभव सही तरीके से फिर से बनाना है ताकि सामान्य या रोग हड्डी रीमॉडलिंग में शामिल तंत्र को चित्रित करने और नए चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में सक्षम हो सके।
वर्तमान प्रोटोकॉल गैरेट13 और मोहम्मद एट अल14द्वारा प्रकाशित प्रक्रियाओं पर आधारित है । नवजात माउस कैल्वेरिया संस्कृतियों को एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि वे विकास और हड्डी कोशिकाओं के तहत हड्डी के त्रि-आयामी वास्तुकला को बनाए रखते हैं, जिसमें अंतर के सभी चरणों में कोशिकाएं (यानी ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोब्लास्ट, ऑस्टियोसाइट्स, स्ट्रोमेटल कोशिकाएं) शामिल हैं जो परिपक्व ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोब्लास्ट, साथ ही खनिजमातृ14का नेतृत्व करते हैं। पूर्व वीवो मॉडल हड्डियों की बीमारियों की रोग प्रक्रिया का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है। हालांकि, बोन रीमॉडलिंग या कैंसर से प्रेरित बोन ऑस्टियोलिसिस पर प्रभाव को सही तरीके से मापा जा सकता है।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण होते हैं: 5-7 दिन पुराने चूहों, कैलवेरिया प्रीकल्चर, कैलवेरिया संस्कृति अनुप्रयोगों (उदाहरण के लिए, इंसुलिन, कैंसर कोशिकाओं या वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में संस्कृति, और यहां तक कि एजेंटों से कैलवेरिया का विच्छेदन जांच के उद्देश्य के अनुसार चिकित्सीय क्षमता), हड्डी निर्धारण और कैल्वरिया डीक्काफिकेशन, ऊतक प्रसंस्करण, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और परिणाम व्याख्या।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इन परखों में इस्तेमाल होने वाले सभी चूहों को बाल्ब/सी चूहों उपभेदों से प्राप्त किया गया था, जो पुरुष और मादा चूहों का अंधाधुंध उपयोग करते थे । एफवीबी, स्विस चूहों, सीडी-1 और सीएसए चूहों11,,12,,14जैसे अन्य उपभेदों का उपयोग करके पिछले संस्कृति प्रयोग भी किए गए हैं। सभी चूहों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशा-निर्देशों के अनुसार रखा गया था, परिशिष्ट Q. पशु विषयों को शामिल करने वाली प्रक्रियाओं को संस्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा Ensenada (CICESE) में वैज्ञानिक अनुसंधान और उच्च शिक्षा केंद्र में मंजूरी दी गई है ।
1. कैल्वरियल विच्छेदन
- विच्छेदन उपकरणों (जैसे, 1 x 2 दांत ऊतक संदंश, सीधे सर्जिकल कैंची, कैंची विच्छेदन, ठीक इत्तला दे दी चिमटी, ठीक घुमावदार टिप विच्छेदन संदंश, विच्छेदन संदंश, स्केलपेल विच्छेदन) । बाँझ आसुत पानी प्रत्येक विच्छेदन के बीच शल्य चिकित्सा उपकरणों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बाँझ 1x PBS प्रत्येक हेमी-calvaria सफाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- लैमिनार फ्लो हुड में प्रक्रिया (जैसे, माइक्रोपाइपिट, उपजी चश्मा, बाँझ पेट्री व्यंजन) को पूरा करने के लिए बाँझ विच्छेदन उपकरणों, पानी, 1x पीबीएस और आवश्यक सामग्रियों को रखें।
नोट: बाँझ परिस्थितियों में पूरी प्रक्रिया को पूरा करें। - दो 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में बाँझ 1x पीबीएस के 12 mL जोड़ें।
- पिल्ले का चयन करें और उन्हें हुड के पास रखें।
नोट: 5-7 दिन पुराने पिल्ले से calvarias विच्छेदन। - माउस को विच्छेदन संदंश का उपयोग करके सावधानी पूर्वक चुनें और पकड़ें।
- कैंची विच्छेदन का उपयोग कर माउस को काटना और पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में सिर जगह है ।
नोट: पुराने चूहों के लिए डेपुटेशन उपयुक्त नहीं है। यदि प्रयोग पुराने चूहों के साथ किया जाना चाहिए, इच्छामृत्यु की विधि पशु प्रयोग नियमों के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए । - 1 x 2 दांत ऊतक संदंश के साथ नाक क्षेत्र द्वारा सिर को मजबूती से पकड़ें और खोपड़ी के ऊपर त्वचा को तब तक हटा दें जब तक कि कैलवेरिया दिखाई न दे।
- उजागर कैलवेरिया पर खोपड़ी के टांके (यानी, सजिटल, कोरोनल और लैम्ब्डोइड) की पहचान करें।
- लैम्ब्डॉइड सीवन के पीछे माइक्रोकैंची की नोक के साथ प्रवेश करें और इसके साथ एक सीधा कट बनाएं।
- खोपड़ी के पीछे की ओर माइक्रोकैंची की नोक डालें। कोरोनल सीवन की ओर लैम्ब्डॉइड सीवन के डिस्टल साइड के साथ सीधे कट बनाएं। अन्य लैम्ब्डॉइड सीवन के साथ इसी तरह आगे बढ़ें।
- पूर्वकाल फॉन्टेनल के कट के साथ बने कट के अंत को जोड़ने के लिए एक और कट (45 डिग्री कोण पर) बनाएं।
- अन्य लैम्ब्डॉइड सीवन के साथ चरण 1.10 और 1.11 दोहराएं।
नोट: उचित कटौती करने के लिए और पर्याप्त एम्बेडिंग और डेटा विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए टांके की पहचान करना महत्वपूर्ण है। - कैलवेरिया को हटाने और पेट्री डिश में रखने के लिए फाइन टिप संदंश का इस्तेमाल करें। स्केलपेल के साथ, कोरोनल सीवन के माध्यम से सागताल सीवन के साथ पीछे के फोंटानेल से सीधे कट बनाएं और दो हेमी-कैलवेरियास प्राप्त करने के लिए पूर्वकाल फॉन्टेनल में समाप्त हो जाते हैं।
- ठीक इत्तला दे दी चिमटी के साथ हेमी-calvarias के प्रत्येक उठाओ और उन्हें एक नया पेट्री पीबीएस युक्त पकवान में जगह है।
2. कैलवेरिया संस्कृति
- 24 अच्छी प्लेट के कुओं में 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक (यानी, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक उच्च ग्लूकोज डीएमईएम माध्यम का 1 किलोल जोड़ें। ठीक टिप संदंश के साथ, प्रत्येक हेमी-कैलवेरिया को उठाएं और इसे एक कुएं में रखें।
नोट: हेमी-कालवेरिया अवतल की ओर नीचे रखो। - हेमी-कैलवेरिया को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
- प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम निकालें और अन्य कोशिकाओं से परीक्षण या वातानुकूलित मीडिया के लिए यौगिक युक्त ताजा मीडिया के 1 mL जोड़ें ।
नोट: प्रत्येक उपचार समूह के लिए कम से कम तीन हेमी-कैलवेरिया का उपयोग करें और नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। - हेमी-कालवेरिया को 7 दिन के लिए इनक्यूबेट करें, हर 2-3 दिन में मीडिया बदल रहे हैं।
3. कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति
- 80-90% संगम पर कैंसर कोशिकाओं के साथ एक पेट्री डिश का चयन करें और उन्हें ट्राइप्सिनाइज करें। ट्रिप्सिनाइज करने के लिए, कैंसर कोशिकाओं को धोने के लिए पीबीएस (5 mL प्रति 75 सेमी2 फ्लास्क) का उपयोग करके 0.05% ट्राइप्सिन और 0.53 मीटर ईटीए (प्रति 75 सेमी2 फ्लास्क) वाले एचबीएसएस समाधान में ऊष्मायन के बाद।
- कक्ष के तापमान (आरटी) पर 5 न्यूनतम के लिए 800 x ग्राम पर सेल निलंबन को 15 मीटर शंकुत्मक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें।
- अधिनेता को निकालें और त्यागें।
- डीएमईएम के 2 mL में गोली को फिर से निलंबित करें जिसमें 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक शामिल हैं। लाइव कोशिकाओं की गणना करें।
- प्रत्येक अध्ययन समूह को हेमी-कैलवेरिया (यानी, आरएनए या हिस्टोलॉजी विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण और सहसंस्कृति समूह) को असाइन करें।
- हेमी-calvarias से संस्कृति मीडिया को हटा दें और 2% एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक पूरक या कैंसर की कोशिकाओं के साथ पूरक नहीं युक्त DMEM के 1 mL जोड़ें ।
नोट: जोड़ने के लिए कोशिकाओं की मात्रा परीक्षण सेल लाइन के आधार पर बदल सकते हैं । एमडीए-एमबी-231 या पीसी-3, 500,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से उचित काम की तरह कैंसर कोशिकाओं के साथ। - 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2के साथ इनक्यूबेट . हड्डी के ऊतकों का पालन करने वाली केवल कैंसर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रत्येक हेमी-कैलवेरिया को एक नई अच्छी तरह से पास करें।
- 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए इनक्यूबेट और हर 2-3 दिन में मीडिया बदलें।
4. निर्धारण
- हेमी-कालवेरिया को लपेटने के लिए ऊतक कागज के वर्गों को काटें।
नोट: बायोप्सी फोम पैड या छोटे बायोप्सी के लिए स्टील कैप्सूल का भी उपयोग किया जा सकता है। - प्रत्येक हेमी-कैलवेरिया को सागताल सीवन से लेने के लिए सीधे ठीक-टिप संदंश का उपयोग करें, एक ऊतक कागज पर रखें, और लपेटें।
- एक लेबल एम्बेडिंग कैसेट के अंदर लिपटे हेमी-कैलवेरिया रखें।
- कैसेट को 10% फॉस्फेट-बफर फॉर्मेलिन के साथ एक कंटेनर में रखें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए फिक्स करें।
5. डेक्कलसिफिकेशन
- फॉर्मेलिन निकालें, 1x पीबीएस जोड़ें, और हेमी-कैलवेरिया को कुल्ला करने के लिए 30 मिन के लिए ऊतकों को उत्तेजित करें।
- पीबीएस निकालें और 10% EDTA (पीएच = 8, 0.34 M) जोड़ें।
नोट: सत्यापित करें कि समाधान ऊतकों को पूरी तरह से कवर करता है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए ऊतकों को डिजाक करें।
- EDTA समाधान त्यागें और ऊतक कुल्ला करने के लिए 1x पीबीएस जोड़ें।
- हिस्टोरोलॉजी प्रोसेसिंग तक हेमी-कैलवेरिया को 70% इथेनॉल में स्टोर करें।
6. ऊतक प्रसंस्करण
- 96% इथेनॉल, 60 मिन (3x) के दौर के साथ ऊतकों को निर्जलित करें, इसके बाद 100% इथेनॉल, 60 मिन (3x) हैं।
- इथेनॉल को 100% जाइलीन, 60 मिन (3x) से बदलें।
- पैराफिन मोम में कैसेट, 60 मिन (2x) इनक्यूबेट।
7. एम्बेडिंग
- कैसेट खोलें, ऊतक कागज को ध्यान से हटा दें, और कैलवेरिया को खोलें।
- प्रत्येक कैलवेरिया को ध्यान से उठाएं और एक ही अभिविन्यास में एक ही समूह से सभी हेमी-कैलवेरिया को ढेर करें।
- कुछ पैराफिन को सांचे में डाल दें।
- संदंश के साथ सभी हेमी-कैलवेरिया को उठाएं और उन्हें मोल्ड के आधार की ओर नीचे सागताल सीवन के साथ मोल्ड के अंदर रखें।
नोट: शामिल किए जाने के दौरान मोल्ड में हेमी-कैलवेरिया का अभिविन्यास लगातार हिस्टोलॉजिकल वर्गों और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अभिविन्यास calvarias से सामने और पार्श्व हड्डियों की पीछे की पहचान की अनुमति देगा और कोरोनल सीवन मात्रात्मक मूल्यांकन की सुविधा। - संदंश जारी करें और सत्यापित करें कि हेमी-कैलवेरिया जगह में रहते हैं।
- मोल्ड के शीर्ष पर लेबल किए गए कैसेट रखें और हेमी-कैलवेरिया को कवर करने के लिए इसे अधिक पैराफिन से भरें।
- मोल्डों को ठंडी सतह पर ले जाएं।
8. सेक्शनिंग
- माइक्रोटोम के साथ सिटटल सीवन के 500-600 माइक्रोन ट्रिम करें।
- 4 μm मोटी वर्गों में कटौती, और आवश्यक वर्गों को इकट्ठा।
- एक और 300 माइक्रोन ट्रिम करें।
- कट और एक और छह 4 μm मोटी वर्गों को इकट्ठा।
- ब्लॉक 300 माइक्रोन को आगे ट्रिम करें और अधिक वर्गों को इकट्ठा करें।
- ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट।
- स्लाइड्स में पढ़ें आरटी में।
9. धुंधला
- 3 मिन के लिए 100% जाइलीन में वर्गों विसर्जित कर दिया।
- 1 मिन के लिए 100% इथेनॉल में जलमग्न।
- 1 मिन के लिए 96% इथेनॉल में मर्ज करें।
- 1 मिन के लिए 80% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
- 1 मिन के लिए 70% इथेनॉल में जलमग्न।
- 3 मिन के लिए पानी में कुल्ला।
- 3 मिन के लिए हेमैटक्सीलिन में जलमग्न।
- धारा स्पष्ट होने तक पानी में कुल्ला करें।
- 10 सेकंड के लिए एक संतृप्त लिथियम कार्बोनेट समाधान में जलमग्न।
- 3 मिन के लिए पानी में कुल्ला।
- 1 मिन के लिए 96% इथेनॉल में जलमग्न।
- 3 मिन के लिए eosin में जलमग्न।
- 1 मिन के लिए 96% इथेनॉल में विसर्जित।
- 1 मिन के लिए 100% इथेनॉल में जलमग्न।
- 3 मिन के लिए 100% जाइलीन में जलमग्न।
- स्लाइड में प्रति माउंट-बढ़ते माध्यम कुछ जोड़ें और इसे कवरस्लिप के साथ सुरक्षित रखें।
नोट: आप ऑस्टियोप्लास्ट और ऑस्टियोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए टेटोक्लास्ट और ऑस्टियोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए टेटोरेट प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेटेज़ (ट्रैप) के साथ धुंधला हेमैटोक्सिलाइन और ईसिन (एच एंड ई) के पूरक हो सकते हैं।
10. मात्रात्मक मूल्यांकन: विश्लेषण के लिए क्षेत्र को परिभाषित करना
- ओरिएंटेशन और टांके की पहचान करने के लिए कम पावर (यानी, 4x) के तहत सेक्शनकी जांच करें।
- कोरोनल सीवन को परिभाषित करें और एक तरफ लंबी हड्डी की सतह और दूसरी तरफ छोटी सतह की पहचान करें।
- 40x आवर्धन के तहत कोरोनल सीवन की पहचान करें, और लंबी सतह के साथ सीवन से दो या तीन ऑप्टिकल क्षेत्रों को दूर ले जाएं। विश्लेषण के लिए इस क्षेत्र की छवियों पर कब्जा।
- पुराने हड्डी क्षेत्र और नई हड्डी क्षेत्र को परिभाषित करें। नारंगी जी के साथ eosin Y पुरानी हड्डी गहरा और नई हड्डी लाइटर दाग ।
- रंग दहलीज उपकरण का उपयोग कर छवि जे सॉफ्टवेयर के साथ पुरानी और नई हड्डी के कुल हड्डी क्षेत्र को मापने। 2माइक्रोनके रूप में परिणाम व्यक्त करें ।
11. डेटा विश्लेषण
- सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण करें। समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर उचित परीक्षणों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, नॉनपैरामेट्रिक मान-व्हिटनी यू परीक्षण जैसा कि हेरेल किया जाता है)।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
कैल्वरियाल मॉडल में हड्डी के गठन का मूल्यांकन करने के लिए, हमने मीडिया में हेमी-कैलवेरिया के साथ या इंसुलिन के ५० μg/mL के बिना खेती की । ऊतक वर्गों को तैयार किया गया था और एच एंड ई के साथ दाग दिया गया था। इन स्थितियों में, हिटोलॉजी ने दिखाया कि कैल्वरियल हड्डी की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा गया था, जिससे इसके विभिन्न घटकों(चित्रा 1)की पहचान की अनुमति थी। इंसुलिन के साथ इलाज किए गए बछड़ों ने नियंत्रण(चित्रा 2ए)की तुलना में हड्डी के ऊतकों की मात्रा में वृद्धि प्रस्तुत की। हेमी-कैलवेरिया की मोटाई और हड्डी क्षेत्र के लिए मात्रात्मक हिस्टोमॉर्फेमेट्रिक विश्लेषण ने नियंत्रण(चित्रा 2बी)की तुलना में इंसुलिन-उपचारित ऊतकों में दोनों मापदंडों के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि की पुष्टि की। ये डेटा हड्डी निर्माण की स्थिति को पुन: पेश करने के लिए पूर्व वीवो मॉडल प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता का संकेत देते हैं।
इसके अतिरिक्त, कैलवरियल पूर्व वीवो मॉडल का उपयोग कैंसर और हड्डी सूक्ष्मपर्यावरण की स्थिति को पुन: पेश करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल ब्रेस्ट कैंसर सेल्स एमडीए-एमबी-231 के असर का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। ऐसा करने के लिए, कैलवरियल हड्डियों को सीधे कैंसर कोशिकाओं के साथ सहसंस्कारित किया गया था या केवल कैंसर कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया के साथ सुसंस्कृत किया गया था। संस्कृति के 7 दिनों के बाद, कैल्वेरिया को पैराफिन में एम्बेडेड किया गया था, और एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन किया गया था। एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति ऑस्टियोलिसिस को बढ़ाने के लिए दिखाई दिया, जैसा कि हड्डी में कमी और कैल्वरियाल संरचना को नुकसान से दिखाया गया है जब नियंत्रण कैल्वेरियास की तुलना में केवल मीडिया(चित्रा 2ए)के साथ खेती की जाती है। कैल्वरिया के अस्थि क्षेत्र मात्राकरण ने नियंत्रण(चित्रा 2बी)की तुलना में एमडीए-एमबी-231 कैंसर कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत कैलवेरिया सजने के कुल अस्थि क्षेत्र में काफी कमी दिखाई। इन परिणामों से पता चला है कि calvarial ऊतक के साथ कैंसर की कोशिकाओं की सहसंस्कृतियों कैंसर और हड्डी सूक्ष्म वातावरण विश्राम कर सकते है और ऑस्टियोलिटिक हड्डी मेटास्टेसिस के तंत्र की जांच या इस प्रक्रिया के संभावित अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्रा 1: कालवारी हड्डी की हिस्टोलॉजिकल संरचना। एच एंड ई धुंधला के बाद हेमी-कैलवेरिया के प्रतिनिधि ऊतक अनुभाग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: इंसुलिन ने हेमी-कैलवेरिया सिक वीवो की हड्डी क्षेत्र और मोटाई में वृद्धि की, जबकि एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ हेमी-कैलवेरिया सजने वाली सहसंस्कृति ने ऑस्टियोलिसिस को प्रेरित किया। हड्डी निर्माण मॉडल के लिए, हेमी-कैलवेरिया को इंसुलिन (50 μg/mL) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत किया गया था, जबकि कैंसर कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति के लिए, हेमी-कैलवेरिया को 7 दिनों के लिए 5 x 105 एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सुसंस्कृत किया गया था और एच एंड ई दाग अनुभागों पर हिस्टोमोर्फोमेट्रिकल विश्लेषण किया गया था। (क)प्रतिनिधि ऊतक वर्ग। (ख)हड्डी क्षेत्र का हिस्टोमॉर्फेमियल विश्लेषण। परिणाम औसत ± एसईएम (एन = 3) के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। * पी एंड एलटी; 0.05, नॉनपैरामेट्रिक मान-व्हिटनी यू टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां, हम हड्डी के गठन या अवशोषण का मूल्यांकन करने और कैल्वरियाल माउस की हड्डी के साथ कैंसर कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक कैल्वेरियाल पूर्व वीवो मॉडल के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस तकनीक के महत्वपूर्ण कदम कैल्वरियास के विच्छेदन, संस्कृति, एम्बेडिंग और हिस्टोमॉर्फेमियल विश्लेषण हैं। कैल्वरिया के विच्छेदन के दौरान, हेमी-कैलवेरिया को एक ट्रैपेज़ोइड में काटना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह पैराफिन समावेशन के दौरान अभिविन्यास को दृढ़ता से सुविधा जनक रूप देगा। कैलवेरिया के साथ कैंसर सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करते समय, मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो कोशिका संस्कृति के लिए इलाज नहीं कर रहे हैं ताकि कैंसर कोशिकाओं को हड्डी के बजाय प्लास्टिक पर पालन करने और बढ़ने से रोका जा सके। ऊतक समावेश न करने के दौरान, प्रत्येक हेमी-कैलवेरिया को ध्यान से उन्मुख करना महत्वपूर्ण है। उन्हें पैराफिन ब्लॉक के बाहरी हिस्से में सिटटल बॉर्डर के साथ वर्टिकल तरीके से रखा जाना जरूरी है। हड्डी का अभिविन्यास लगातार हिस्टोलॉजिकल वर्गों और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसी तरह, बोन रीमॉडलिंग को मापने के लिए कैल्वेरिया में एक विशिष्ट क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए हिस्टोमॉर्फेमेट्रिक विश्लेषण के दौरान स्थिरता के लिए यह महत्वपूर्ण है। यहां, हमने पहले कोरोनल सीवन और फिर लंबी हड्डी की सतह की पहचान की जहां तस्वीरें ली गई थीं और माप बनाए गए थे।
मानकीकरण को प्राप्त करने और वर्णित प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए, हमने कुछ स्थापित पद्धतियों को थोड़ा संशोधित किया। हेमी-कालवेरिया के विच्छेदन के दौरान, पीबीएस का उपयोग संस्कृति मीडिया के बजाय माउस सिर को कुल्ला करने के लिए किया गया था। calvarias पर एक प्रभाव का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, ऊतक स्तन कैंसर कोशिकाओं की विभिन्न संख्या के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था। सामान्य तौर पर, 5 x 105 कैंसर कोशिकाएं 7 दिन की परख के लिए अच्छी तरह से काम करती हैं। साथ ही निर्धारण के दौरान कैलवारियों की सुरक्षा के लिए स्पंज की जगह टिश्यू पेपर का इस्तेमाल किया गया। ऊतक को कागज के भीतर अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था।
वर्णित मॉडल की कुछ सीमाएं हैं। नवजात चूहों से calvarias हड्डियों के घटकों में से कुछ की कमी है कि मेटास्टेज़ के प्राप्तकर्ता हैं, चाहे संरचनात्मक (यानी, trabecular हड्डी) या प्रतिरक्षा कोशिकाओं या अस्थि मज्जा के अंय कोशिकाओं के रूप में सेलुलर घटकों, हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल है कि कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत सहित । विट्रो में कैल्वरिया की संस्कृति पूर्ण फिजियोपैथोलॉजी का अनुकरण नहीं कर सकती। इसके अलावा, जब हड्डी मेटास्टेज़ की बात आती है, तो स्तन कैंसर कोशिकाएं शायद ही कभी कैलवेरिया में मेटास्टेसाइज करती हैं, और हड्डियों को अधिक सक्रिय हड्डी रीमॉडलिंग के साथ एहसान करती हैं, जैसे कशेरुकी, कूल्हे, या हाथ और पैरों की लंबी हड्डियां। इसके अलावा, कैंसर कोशिकाओं के साथ हेमी-कैलवेरिया की सहसंस्कृति केवल मेटास्टैटिक झरना के नवीनतम चरणों का प्रतिनिधित्व करती है: हड्डी का उपनिवेशीकरण और मेटास्टासिस का विकास। इसके अलावा, नमूनों की संख्या प्रति कूड़े पिल्ले की संख्या से सीमित है । प्रति प्रयोग एक कूड़े का उपयोग करने और परिणामों के भीतर विविधताओं से बचने के लिए कूड़े को मिश्रित नहीं करने की सिफारिश की जाती है। हमने बाल्बी/सी या एफवीबी चूहों से calvarias का उपयोग करते समय हड्डी रीमॉडलिंग में इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए, लेकिन क्या तनाव इस परख में हड्डी रीमॉडलिंग के समय प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है निर्धारित किया जाना बाकी है ।
वीवो मॉडल की तुलना में कैल्वरियाल पूर्व वीवो मॉडल के मुख्य फायदे में कम लागत, परख की सादगी और हड्डी रीमॉडलिंग प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए कम प्रायोगिक समय शामिल है। कैंसर कोशिकाओं और calvarias के सहसंस्कृति सेल संपर्क निर्भर बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हड्डी remodeling पर गुप्त कारकों के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जबकि वातानुकूलित मीडिया का उपयोग घुलनशील कारकों के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है । इसके अलावा, प्रत्यक्ष संपर्क मॉडल इंटरसेलुलर इंटरकोशिएशन इंटरकोशिएशन इंटरकोशिएसिस माइक्रोएनवायरमेंट के लक्षण वर्णन और आणविक तंत्र के साथ-साथ घातक जटिलताओं के उपचार के लिए नई दवाओं के अध्ययन और मूल्यांकन की सुविधा प्रदान कर सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।
Acknowledgments
लेखकों ने हिटोलॉजी के साथ उनकी मदद के लिए मारियो नोमुरा, एमडी और रोडोल्फो डियाज और पेपर की गुणवत्ता में सुधार के लिए अपनी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए पिरिक फोरनियर, पीएचडी का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
