Summary
骨外植の元生体培養は、骨生理学の研究や骨のリモデリングや骨疾患における薬物の潜在的な評価のための貴重なツールとなり得る。提示されたプロトコルは、新生児マウスの頭蓋骨から分離されたカルヴァリアの調製および培養、ならびにその用途を記述する。
Abstract
骨は骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、およびミネラル化された細胞外マトリックスから構成される結合組織であり、その強さと柔軟性を与え、その機能を果たすことができます。骨は様々な刺激にさらされ続け、病理学的状態では骨のリモデリングを調節緩和することができる。骨生物学や疾患を研究し、潜在的な治療薬を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。
本稿では、新生児マウスから分離されたカルバリアの解剖過程と培養条件について、骨形成と骨腫瘍微小環境を研究する。インビトロおよびインビボモデルとは対照的に、このex vivoモデルは、組織の3次元環境と骨の細胞多様性を維持し、所定の条件下で培養して所望の微小環境をシミュレートすることを可能にする。したがって、骨のリモデリングとそのメカニズム、ならびに癌細胞と骨の相互作用などの他の細胞型との相互作用を調べることができます。
ここで報告されたアッセイは、5-7日齢BALB/Cマウスのカルバリアを使用する。得られたヘミカルバリアは、インスリン、乳癌細胞(MDA-MB-231)、または乳癌細胞培養から調整された培地の存在下で培養される。分析後、インスリンが新しい骨形成を誘導し、癌細胞とその調整された培地が骨吸収を誘発することを確立した。このカルバリアモデルは、骨の発達やがんによる骨疾患の研究に基礎的および応用研究に成功しています。全体的に、それは容易で、有益で、低コストのアッセイのための優秀な選択である。
Introduction
骨は筋肉を支え、内臓および骨髄を保護し、カルシウムおよび成長因子,1、2を貯蔵および放出することを含むいくつかの機能を有する動的結合組織1である。その完全性および適切な機能を維持するために、骨組織は連続的に改造のプロセスの下にある。一般に、骨リモデリングのサイクルは、骨吸収と骨形成1に分けることができる。骨のリモデリングのこれらの2つの段階の間の不均衡は、骨の病理の開発につながることができます。また、乳がんなどの病気は骨の完全性に影響を与えることが多い。進行期の患者の約70%以上が骨転移を有するか、または有するであろう。乳癌細胞が骨に入ると、それらは骨代謝に影響を及ぼし、過剰な吸収(破骨病変)および/または形成(骨芽細胞病変)3を生じる。
骨疾患の生物学を理解し、新しい治療法を開発するためには、骨のリモデリングに関わるメカニズムを理解する必要があります。がん研究では、骨転移過程と転移性微小環境との関係を調べるのが重要です。1889年、スティーブン・パジェトは、腫瘍細胞と標的組織との間に相溶性がある場合に転移が起こると仮定し、転移部位が微小環境4に対する腫瘍の親和性に依存することを示唆した。1997年、マンディとギーズは、腫瘍細胞が生存と成長を達成するために骨微小環境をどのように変えるか、そして骨微小環境がカルシウムおよび成長因子55、6、76,を提供することによってどのように成長を促進するかを説明する「骨転移の悪循環」という概念を導入した。
骨のリフォームや骨転移に関与するメカニズムを特徴付け、可能な治療可能性を有する分子を評価するためには、インビトロおよびインビボモデルの開発が必要であった。しかし、これらのモデルは現在、骨微小環境の簡略表示やコスト88、99など多くの制限を提示している。ex vivoの骨の培養は、骨細胞の多様性と同様に、立体的組織を維持するという利点を有する。また、実験条件も制御できる。外植モデルには、中足骨、大腿骨頭部、カルバリア、下顎または骨壁コア10の培養が含まれる。ex vivoモデルの利点は、多様な研究で実証されている。2009年、Nordstrandと共同研究者は、骨癌細胞と前立腺癌細胞11との相互作用に基づく共培養モデルの確立を報告した。また、2012年には、カーティンと共同研究者は、ex vivoのコカルチャー12を用いた立体モデルの開発を報告した。このようなex vivoモデルの目的は、正常または病理学的骨リモデリングに関与するメカニズムを特徴付け、新しい治療薬の有効性を評価することができるように、骨微小環境の条件を可能な限り正確に再現することです。
本議定書はギャレット13とモハマドらによって公表された手順に基づいている。新生児マウスカルバリア培養は、成熟した破骨細胞および骨芽細胞につながる分化のすべての段階(すなわち、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、間質細胞)の細胞を含む、発達中の骨および骨細胞の三次元アーキテクチャを保持するため、実験モデルとして使用されてきた。ex vivoモデルは、骨疾患の病理学的過程を完全に表すものではありません。しかし、骨のリモデリングや癌による骨骨の骨の骨の骨の骨の影響を正確に測定することができます。
簡単に言えば、このプロトコルは、5-7日齢マウスからのカルバリアの解剖、カルバリア前培養、カルバリア培養アプリケーション(例えば、インスリン、癌細胞または条件付け培地の存在下での培養、さらには薬剤の解剖)から構成される。治療上の可能性は、調査の目的に従って)骨固定およびカルバリア脱灰、組織処理、組織学的分析、および結果解釈。
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Protocol
これらのアッセイで使用されるすべてのマウスは、雄マウスと雌マウスを無差別に用いて、BALB/cマウス株から得られた。これまでの培養実験は、FVB、スイスマウス、CD-1、およびCsAマウス11、12、14,などの11,他の株を用いても行われてきた。14すべてのマウスは国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って収容され、付録Q.動物被験者を含む手順は、エンセナダ科学研究高等教育センター(CICESE)の施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. カルバリア解剖
- 解剖器具(例えば、1×2歯のティッシュ鉗子、まっすぐな外科用はさみ、解剖はさみ、細かい先端のピンセット、細かい湾曲した先端解剖鉗子、解剖鉗子、メス)。滅菌蒸留水は、各解剖の間の外科用具をきれいにするために使用することができ、滅菌1x PBSは、各ヘミカルバリアの洗浄に使用することができます。
- 滅菌解剖器、水、1x PBS、および手順を実施するために必要な材料(例えば、マイクロピペット、沈殿ガラス、滅菌ペトリ皿)を層流フードに入れる。
注:滅菌条件下で全体の手順を実行します。 - 2つの10センチペトリ皿に12mLの無菌1x PBSを加えます。
- 子犬を選択し、フードの近くに配置します。
注:5-7日の古い子犬からカルバリアを解剖してください。 - マウスを慎重に選んで持ち続け、解剖鉗子を使用します。
- はさみを解剖してマウスの首を切り落とし、PBSでペトリ皿に頭を入れます。
注:切断は、古いマウスには適していません。古いマウスで実験を行う必要がある場合は、動物実験規則に従って安楽死の方法を変更する必要があります。 - 1 x 2歯のティッシュ鉗子で鼻の領域で頭をしっかりと保持し、カルバリアが見えるまで頭蓋骨の上の皮膚を取り除きます。
- 露出したカルバリアの頭蓋骨の縫合糸(すなわち、矢状、冠状動脈、およびラムドイド)を特定する。
- ラムドイド縫合糸の約2mm後ろのマイクロシザーの先端で貫通し、それに沿ってまっすぐ切り取ります。
- 頭蓋骨の後部にマイクロシザーの先端を挿入します。コロン縫合糸に向かってラムドイド縫合糸の遠位側に沿ってまっすぐ切り取ります。他のラムドイド縫合糸と同様に進みます。
- もう一度カット(45°)を作成して、前のフォントのカットで作られたカットの端を接続します。
- 他のラムドイド縫合糸でステップ1.10と1.11を繰り返します。
注: 縫合線を特定して適切なカットを行い、適切な埋め込みとデータ解析を実行することが重要です。 - 細かい先端の鉗子を使用してカルバリアを取り除き、ペトリ皿に入れます。メスで、後部フォンタネルから冠状縫合糸を通って矢状縫合糸に沿ってまっすぐ切り取り、前のフォンタネルで終わり、2つのヘミカルバリアを得る。
- 細かい先端のピンセットでヘミカルバリウスのそれぞれをピックアップし、PBSを含む新しいペトリ皿に入れます。
2. カルヴァリア文化
- 24ウェルプレートのウェルに0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)と1%の抗生物質/抗ミキシン(すなわち、ペニシリンおよびストレプトマイシン)を添加した高グルコースDMEM培地の1 mLを加える。細かい先端の鉗子で、各ヘミカルバリアを拾い、井戸に入れる。
注:ヘミカルヴァリアの凹面側を下に置きます。 - ヘミカルバリアを37°Cで24時間インキュベートし、CO2を5%で行います。
- 各ウェルから培地を取り出し、化合物を含む1mLの新鮮な培地を加えて、他の細胞から試験または調整された培地を添加する。
注:各治療群に少なくとも3つのヘミカルバリアを使用し、陰性および正のコントロールを使用してください。 - ヘミカルバリアを7日間インキュベートし、2〜3日ごとにメディアを交換します。
3. がん細胞を含む培養
- 80-90%合流で癌細胞を持つペトリ皿を選択し、それらをトリプシン化します。トリプシン化するには、PBS(75cm2フラスコあたり5mL)を使用して2癌細胞1xを洗浄し、続いて0.05%トリプシンおよび0.53 mM EDTA(75cm2フラスコあたり2mL)2を含むHBSS溶液中でインキュベーションを行う。
- セル懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を800 x gで室温(RT)で5分間移動します。
- 上清を取り除き、捨てます。
- 2%胎児ウシ血清(FBS)と1%の抗生物質/抗ミコティックを含むDMEMの2 mLでペレットを再懸濁します。ライブセルをカウントします。
- 各研究グループ(すなわち、RNAまたは菌学分析のための陰性対照および共培養グループ)にヘミカルバリアを割り当てる。
- ヘミカルバリアから培養培地を取り出し、2%FBSと1%の抗生物質/抗抗抗ミキトティックを含むDMEMの1mLを加え、癌細胞を補充または添加しない。
注: 追加するセルの量は、テストしたセルラインによって異なります。MDA-MB-231やPC-3のような癌細胞では、井戸あたり500,000個の細胞が適切に働きます。 - 5%CO2で37°Cで24時間インキュベー2トする。各ヘミカルバリアを新しい井戸に渡して、骨組織に付着した癌細胞のみを保持する。
- 37°Cで7日間、5%CO2でインキュ2ベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。
4. 固定
- ティッシュペーパーの正方形をカットして、ヘミカルバリアを包みます。
注:小さな生検のためのバイオプシーフォームパッドやスチールカプセルも使用することができます。 - ストレートの細かい先端鉗子を使用して、矢状縫合糸から各ヘミカルバリアを拾い、ティッシュペーパーの上に置き、ラップします。
- 包まれたヘミカルバリアをラベル付き埋め込みカセットの中に入れる。
- カセットを10%リン酸緩衝ホルマリンの容器に入れます。
- 4°Cで24時間固定します。
5. 脱灰
- ホルマリンを取り出し、PBSを1倍にして、組織を30分間攪拌してヘミカルバリアをすすいだ。
- PBSを取り出し、10%EDTA(pH = 8,0.34 M)を加えます。
注: ソリューションが組織を完全にカバーしていることを確認します。 - 4°Cで48時間組織を脱灰する。
- EDTA溶液を捨て、1倍のPBSを加えて組織をすすいだ。
- ヘミカルバリアを70%エタノールで保存し、ヒスチオロジー処理を行うまで保管してください。
6. 組織処理
- 96%エタノール、60分(3x)、100%エタノール、60分(3x)のラウンドで組織を脱水します。
- エタノールを100%キシレン、60分(3x)で交換してください。
- カセットをパラフィンワックスでインキュベートし、60分(2倍)します。
7. 埋め込み
- カセットを開き、慎重にティッシュペーパーを取り出し、カルバリアを開きます。
- 各カルバリアを慎重にピックアップし、同じ方向に同じグループからすべてのヘミカルバリアを積み重ねてください。
- パラフィンをカビに入れます。
- 鉗子ですべてのヘミカルバリアを拾い、矢状縫合糸を金型の基部に向かって下にして型の中に置きます。
注:この方向は、カルバリアから前頭骨と頭頂骨の後部識別を可能にするので、インクルージョン中の金型中のヘミカルバリアの向きは、一貫した組織学的セクションと再現可能な結果を得るために重要ですそして、定量的評価を促進する冠状縫合。 - 鉗子を解放し、ヘミカルヴァリアが所定の位置にとどまることを確認する。
- 標識されたカセットをカビの上に置き、ヘミカルバリアを覆うためにより多くのパラフィンで満たします。
- 金型をコールド サーフェスに移動します。
8. 断面化
- マイクロトームで矢状縫合糸の500-600 μmをトリムします。
- 厚さ4μmのセクションをカットし、必要なセクションを収集します。
- さらに300 μmをトリミングします。
- さらに6つの4μmの厚いセクションをカットして収集します。
- ブロックをさらに300μmトリミングし、より多くのセクションを収集します。
- ガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付けます。
- RTでスライドを乾燥させます。
9. 染色
- セクションを100%キシレンに3分間浸します。
- 100%エタノールに1分間水没します。
- 96%エタノールで1分間マージします。
- 80%エタノールに1分間浸漬します。
- 70%エタノールに1分間水没。
- 水で3分間すすいでください。
- ヘマトキシリンに3分間沈水する。
- セクションが透明になるまで水ですすります。
- 飽和炭酸リチウム溶液に10秒間沈水します。
- 水で3分間すすいでください。
- 96%エタノールに1分間水没する。
- エオシンに3分間沈水。
- 96%エタノールに1分間浸漬します。
- 100%エタノールに1分間水没します。
- 100%キシレンで3分間沈水します。
- スライドに取り付け取り付け用メディアを追加し、カバースリップで保護します。
注:ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色を酒率耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色で補い、破骨細胞および骨折り病を評価することができます。
10. 定量的評価:分析領域の定義
- 低電力(つまり4x)の下のセクションを調べて、方向と縫合糸を特定します。
- コロナ縫合を定義し、片側の長い骨表面と他方の短い面を特定します。
- 40倍の倍率でコロナ縫合を特定し、長い表面に沿って縫合線から離れて2つまたは3つの光学フィールドを移動します。解析のためにこの領域の画像をキャプチャします。
- 古いボーン領域と新しいボーン領域を定義します。オレンジGのエオシンYは、古い骨を暗く、新しい骨を明るく染めます。
- 色のしきい値ツールを使用して、イメージ J ソフトウェアを使用して、古いボーンと新しいボーンの総ボーン領域を測定します。μm2として結果を表現します。
11. データ分析
- 統計ソフトウェアを使用して結果を分析します。グループ間の有意な違いは、適切な検定(例えば、非パラメトリックマン・ホイットニーU試験が行われているように)を用いて決定することができる。
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Representative Results
カルバリアモデルでの骨形成を評価するために、50μg/mLのインスリンを用いずに培地中のヘミカルバリアを培養した。組織切片を調製し、H&Eで染色した。これらの条件において、構造学は、カルバリ骨の構造的完全性が維持され、その異なる成分の同定を可能にすることを示した(図1)。インスリンで治療したカルバリアは、対照と比較して骨組織の量の増加を示した(図2A)。ヘミカルバリアの厚さと骨面積に関する定量的組織形態学的分析は、コントロールと比較してインスリン処理組織の両方のパラメータに有意な増加を確認した(図2B)。これらのデータは、骨形成条件を再現するex vivoモデルプロトコルの実現可能性を示す。
また、カルバリア型のex vivoモデルは、がんや骨の微小環境状態を再現するために使用することができます。このプロトコルは、マウスカルバリアに対する乳癌細胞MDA-MB-231の影響を評価するために使用された。これを行うために、カルバリア骨を癌細胞と直接共培養するか、または癌細胞の調整された培地のみで培養した。培養7日後、パラフィンにカルバリアを埋め込み、H&E染色を行った。MDA-MB-231乳癌細胞との共培養は、骨の減少およびカルバリア構造への損傷が培地のみで栽培された対照カルバリアと比較して示すように、骨の低下を増加させるように見えた(図2A)。カルヴァリアの骨面積定量は、対照と比較してMDA-MB-231癌細胞で培養したカルバリアの総骨面積の有意な減少を示した(図2B)。これらの結果は、カルバリア組織を有する癌細胞の共同培養が癌および骨微小環境を再現し、骨折れ骨転移のメカニズムを調査したり、このプロセスの可能な阻害剤を評価するために使用できることを実証した。
図1:カルバリア骨の組織学的構造H&E染色後のヘミカルバリアの代表的な組織部。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:インスリンは、MDA-MB-231乳癌細胞とのヘミカルバリアの共培養中に、ヘミカルバリアex vivoの骨面積と厚さを増加させ、骨液化を誘発した。骨形成モデルでは、ヘミカルバリアをインスリンの存在下または不在(50μg/mL)で培養し、癌細胞との共培養のために、ヘミカルバリアを5 x 105 MDA-MB-231細胞の存在下または不存在下で7日間培養し、ヒストモルモ測定分析をH&E染色セクションで行った。(A)代表的な組織切片。(B) 骨領域のヒストモルモメトリクス解析結果は、平均±SEM(n=3)として表される。*P < 0.05, ノンパラメトリックマンホイットニーU検定.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、骨形成または吸収を評価し、癌細胞とカルバリア性マウスの骨との相互作用を研究するためのカルバリア式ex vivoモデルのプロトコルについて説明する。この手法の重要なステップは、カルバリアの解剖、培養、埋め込み、および組織形態測定分析である。カルバリアの解剖中、パラフィン包含中の向きを強く促進するため、ヘミカルバリアを台形に切断することが重要です。カルバリアとのがん細胞相互作用を研究する際には、細胞培養用に治療されていないマルチウェルプレートを使用して、がん細胞が骨の代わりにプラスチックに付着して成長するのを防ぐことが重要です。組織の包含の間に、各ヘミカルバリアを注意深く配向することが重要である。それらはパラフィンブロックの外側の矢状の境界線と縦に置かれる必要がある。骨の向きは、一貫した組織学的切片と再現性のある結果を得るために不可欠です。同様に、骨のリモデリングを測定するためにカルバリアの特定の領域を定義することは、組織形態測定分析中の一貫性のために重要です。ここでは、最初にコロナ縫合糸を特定し、次に写真が撮影された長い骨表面と測定を特定しました。
標準化を実現し、記載されたプロトコルを開発するために、我々はいくつかの確立された方法論をわずかに変更しました。ヘミカルバリアの解剖の間、PBSは培養培地の代わりにマウスヘッドをすすぐために使用された。カルバリアに影響を与えるために必要な細胞の数を決定するために、組織を乳癌細胞の異なる数でインキュベートした。一般に、5 x 105の癌細胞は、7日間のアッセイのためにうまく機能する。また、固定中、カルバリアを保護するためにスポンジの代わりにティッシュペーパーを使用した。その組織は紙の中で十分に保存されていた。
説明したモデルには、いくつかの制限があります。新生児マウスのカルバリアは、転移の受容者である骨の成分の一部を欠いている、構造(すなわち、骨腺骨)または癌細胞が相互作用する造血幹細胞を含む骨髄の免疫細胞または他の細胞などの細胞成分。体外のカルバリアの培養は、完全な生理病理学をシミュレートすることはできません。また、骨転移に関しては、乳癌細胞はカルバリアに転移することはめったにおらず、椎骨、股関節、または腕と脚の長い骨のようなより活発な骨改造を伴う骨を好む傾向がある。また、がん細胞とのヘミカルバリアの共培養は、転移カスケードの最新のステップ、すなわち骨の植民地化と転移の成長を表すだけです。さらに、サンプルの数は、ごみあたりの子犬の数によって制限されます。結果内の変動を避けるために、実験ごとに1つのごみを使用し、ごみを混ぜないことをお勧めします。BALB/cマウスまたはFVBマウスからカルバリアを使用した場合の骨リモデリングでも同様の結果を得たが、このアッセイにおける骨改造の時間応答に影響を与えるかどうかはまだ決まっていない。
生体内モデルと比較したカルバリア式ex vivoモデルの主な利点は、低コスト、アッセイの簡易性、および骨のリモデリング応答を得るための実験時間の短縮を含む。癌細胞とカルバリアの共培養は、細胞接触依存相互作用と分泌因子が骨リモデリングに及ぼす影響を研究することを可能にし、条件付き培地を使用すると可溶性因子の効果に焦点を当てることができる。また、直接接触モデルは、細胞間相互作用の特徴付けと骨転移微小環境の分子機構、ならびに悪性腫瘍の骨格合併症の治療のための新薬の検討と評価を促進することができる。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、マリオ・ノムラ、M.D.、ロドルフォ・ディアスの神学の支援、ピエリック・フルニエ博士の貴重なコメントに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
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