Summary
Detta protokoll presenterar en metod för decellularization och efterföljande hydrogel bildandet av murina mjölkfett kuddar efter ex vivo bestrålning.
Abstract
Strålning är en terapi för patienter med trefaldig negativ bröstcancer. Effekten av strålning på den extracellulära matrisen (ECM) av friska bröstvävnad och dess roll i lokala recidiv på den primära tumör platsen är okända. Här presenterar vi en metod för decellularization, frystorkat, och tillverkning av ECM hydrogeler härrör från murina bröst fett kuddar. Resultaten presenteras på effektiviteten i decellularization processen, och rheologiska parametrar bedömdes. GFP-och luciferase-märkta bröstcancerceller inkapslade i hydrogeler visade en ökning av spridningen i bestrålade hydrogeler. Slutligen, phalloidin konjugatfärgning var anställd för att visualisera cytoskelettet organisation av inkapslade tumörceller. Vårt mål är att presentera en metod för fabricera hydrogeler för in vitro-studie som efterliknar in vivo bröstvävnad miljö och dess svar på strålning för att studera tumör cell beteende.
Introduction
Cancer kännetecknas av överskott proliferation av celler som kan kringgå apoptos och även metastasera till avlägsna platser1. Bröstcancer är en av de vanligaste formerna bland kvinnor i USA, med uppskattningsvis 266 000 nya fall och 40 000 dödsfall i 20182. En särskilt aggressiv och svår att behandla subtyp är Triple negativ bröstcancer (TNBC), som saknar östrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), och Human Epidermal tillväxtfaktor (HER2). Strålbehandling används ofta i bröstcancer för att eliminera kvarvarande tumörceller efter lumpectomy, men över 13% av TNBC patienter fortfarande uppleva återfall på den primära tumör plats3.
Det är känt att strålbehandling är effektivt för att lindra metastaser och recidiv eftersom kombinationen av lumpectomy och strålning resulterar i samma långsiktiga överlevnad som mastektomi4. Emellertid, det har nyligen visat att strålbehandling är förknippad med lokala recidiv till den primära tumör platsen i immunkomprometterade inställningar5,6. Dessutom är det välkänt att strålningen förändrar den extracellulära matrisen (ECM) av normal vävnad genom att framkalla fibros7. Därför är det viktigt att förstå den roll som strålning-inducerad ECM förändringar i diktera tumör cell beteende.
Decellularized vävnader har använts som in vitro-modeller för att studera sjukdom8,9. Dessa decellularized vävnader bevara ECM sammansättning och recapitulate komplexet in vivo ECM. Denna decellularized vävnad ECM kan bearbetas ytterligare och smälta att bilda rekonstituerade ECM hydrogeler som kan användas för att studera celltillväxt och funktion10,11. Till exempel, injicerbara hydrogeler härrör från decellularized humant lipoaspirate och från myokardvävnad fungerat som icke-invasiva metoder för vävnadsteknik, och en hydrogel som härrör från svin lungvävnad utnyttjades som en in vitro-metod för testning mesenkymala stamcells fäste och bärkraft12,13,14. Effekten av normala vävnads strålningsskador på ECM-egenskaper har dock inte undersökts.
Hydrogels härledda från ECM har störst potential för in vitro-studier av in vivo fenomen. Flera andra material har studerats, inklusive kollagen, fibrin, och matrigel, men det är svårt att syntetiskt recapitulate sammansättningen av ECM13. En fördel med att använda ECM-härledda hydrogeler är att ECM innehåller nödvändiga proteiner och tillväxtfaktorer för en viss vävnad14,15. Bestrålning av normal vävnad under lumpectomy orsakar betydande förändringar i ECM, och ECM-härledda hydrogeler kan användas för att studera denna effekt in vitro-. Denna metod kan leda till mer komplexa och mer exakta in vitro-modeller av sjukdom.
I denna studie, vi utsattes murina bröst fett kuddar (MFP) till strålning ex vivo. Multifunktionsskrivare var decellularized och göras till pre-gel lösning. Hydrogels bildades med inbäddade 4T1-celler, en murin TNBC-celllinje. Hydrogelmaterialets reologiska egenskaper undersöktes, och tumörcelldynamiken utvärderades i hydrogeler. Hydrogels tillverkade av bestrålade multifunktionsskrivare förstärkt tumör cell spridning. Framtida studier kommer att omfatta andra celltyper för att studera cell-cell interaktioner i samband med canceråterfall efter behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurstudier har utförts i enlighet med institutionella riktlinjer och protokoll som godkänts av Vanderbilt University institutionella djuromsorg och användning kommittén.
1. beredning och ex vivo bestrålning av multifunktionsskrivare
- Offra atymiska nu/nu möss (8 – 10 veckor) med hjälp av co2 kvävning följt av cervikal dislokation.
- Rengör huden med 70% etanol.
- Samla in mjölkfett kuddar (MFP) från offrade möss med Försteriliserad sax och tång i ett 15 mL koniskt rör som innehåller kompletta RPMI-media (RPMI kompletterat med 1% penicillin-streptomycin och 10% fetalt bovint serum) (se tabellen med material ).
- Bestråla prover till 20 Gy med hjälp av en cesium källa.
- Ta med de bestrålade MFP-filerna och kompletta RPMI-media till ett biosäkerhetsskåp. Medierna kommer att vara beroende av den cell linje som skall odlas i den slutliga hydrogel. Fyll 6 cm eller 10 cm rätter med tillräckligt med media för att dränera multifunktionsskrivare. För 6 cm rätter, Använd 8 mL media, och för 10 cm rätter, Använd 20 mL media.
- Inkubera i en inkubator 37 ° c/5% CO2 i två dagar. Tidslängden i inkubatorn kan justeras.
- Skölj vävnader i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), torka av överflödig fukt och placera multifunktionsskrivare i 15 mL koniska rör för förvaring vid-80 ° c till decellularization. Denna frysning steg underlättar decellularization steg och provet bör frysas även om nästa steg är annars klar.
2. decellularization (anpassad från referenser12,16,17)
Anmärkning: detta förfarande har anpassats från tidigare publicerade metoder fokuserade på fett decellularization, som inkluderade natrium deoxicholat Joniska rengöringsmedel snarare än natriumdodecyl sulfate att ta bort DNA effektivt12,16 , 17.
- På dag 1, ta bort frysta multifunktionsskrivare från-80 ° c och Tina vid rumstemperatur.
- När tinade, torra MFP-kort på en delikat uppgift torka. Väg multifunktionsskrivare med hjälp av en analytisk skala.
- Med hjälp av ett par tång med sax eller en skalpell, dela vävnad upp i 3 mm x 3 mm x 3 mm prover för studier av intakt ECM och resterande vävnad för hydro gel produktion.
Anm.: antalet prover är beroende av antalet provningsmetoder, t. ex. den samling av två prover som beskrivs nedan: en för paraffin inbäddning (steg 2,5) och en för frysning i kryostat inbäddnings medium, om så önskas (se tabellen av material och steg 2,6). - Väg vävnaderna. Om inbäddning i paraffin för snittning, Fortsätt till steg 2,5. Om frysning i kryostat inbäddnings medium för snittning, Fortsätt till steg 2,6.
- I en kemisk huva, sänk vävnaden i 10% neutral buffrad formalin (NBF) (se tabellen av material) för 24 h vid 4 ° c. Tvätta 3 gånger i PBS i 5 min vardera. Sänk vävnaden i 30% sackaros för 48 h vid 4 ° c.
- Väg vävnaden nu när denna pjäs har avlägsnats. Fortsätt till steg 2,6.
- I en kemisk huva, placera MFP bitar i en märkt kassett prepped med kryostat inbäddning medium. Lägg till mer kryostat inbäddning medium för att täcka vävnaden.
- Placera kassetten i en bägare med 2-metylbutan (se material tabellen) som är förkyld med flytande kväve. Bägaren bör ha tillräckligt med 2-metylbutan för att täcka botten men inte tillräckligt för att dränera kassetten eftersom kryostaten inbäddnings mediet inte bör röra 2-metylbutan. Låt kassetten sitta i 2-metylbutan tills kryostat inbäddning mediet fryser och blir ogenomskinlig.
- Linda in kassetten (s) i folie, etikett och lämna vid-80 ° c tills den används för snittning.
Anmärkning: vävnader som placerats omedelbart i kryostatinbäddnings medium var sektionerade vid 5 μm medan vävnader som inkuberades i sackaros var sektioneras till 30 μm för att bibehålla fettceller-morfologi.
- Använd tång för att manuellt massera resterande vävnad.
Anmärkning: Vävnadsdelar kan också placeras i 10% NBF för 24 – 48 timmar, sköljas i PBS och lämnas i 70% etanol tills de bäddas in i paraffin. Efter inbäddning kan 5 μm-sektioner användas för hematoxylin och eosin (H & E)-färgning (se avsnitt 7 nedan). - Placera multifunktionsskrivare i 6 cm rätter med 5 mL 0,02% trypsin/0.05% EDTA lösning. Inkubera vid 37 ° c i 1 h. spraya och torka av rätterna med 70% etanol innan de släpps ut i inkubatorn.
- Använd 0,7 mm silar för att tvätta multifunktionsskrivare med avjoniserat (DI) vatten genom att hälla vatten över vävnaden tre gånger. Använd tång för att manuellt massera vävnaden mellan tvätter.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placera vävnader i en förautoklaverad bägare som innehåller en lämplig storlek rör bar. Täck vävnader med 60 mL 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (se tabell över material) per 1 g vävnad och rör om 1 h vid rumstemperatur. Använd minst 20 mL.
- Dumper vävnad och innehåll i en sil. Skölj bägaren med DI-vatten och häll på vävnaderna. Upprepa två gånger till. Använd tång för att manuellt massera vävnaden i mellan sköljen.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placera vävnader och rör stänger tillbaka i samma bägare, och täck med 60 mL 4% deoxycholic syra per 1 g vävnad. Rör om i rumstemperatur i 1 h. Använd minst 20 mL.
- Dumpvävnad och innehåll i en nätsil. Skölj bägaren med DI-vatten och häll på vävnaderna. Upprepa två gånger till. Använd tång för att manuellt massera vävnaden i mellan sköljen.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga.
- Placera vävnader i samma bägare med färskt DI vatten kompletterat med 1% penicillin-streptomycin. Täck tätt med paraffin film. Lämna över natten vid 4 ° c.
- Tvätta silar och bägare för användning följande dag.
- På dag 2, Töm bägaren innehåll i en sil. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga.
- Placera multifunktionsskrivare i samma bägare med en lämplig storlek på rör bar. Täck med 60 mL 4% etanol/0,1% perättiksyralösning per 1 g vävnad. Använd minst 20 mL. Rör om i rumstemperatur i 2 timmar.
- Dumpvävnad och innehåll i en 0,7 mm SIL. Använd tång för att manuellt massera vävnaden. Lägg tillbaka innehållet i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 mL 1x PBS per 1 g vävnad. Använd minst 20 mL. Rör om i 15 minuter vid rumstemperatur. Upprepa en gång.
- Dumpvävnad och innehåll i en 0,7 mm SIL. Använd tång för att manuellt massera vävnaden. Lägg tillbaka innehållet i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 mL DI vatten per 1 g vävnad. Använd minst 20 mL. Rör om i 15 minuter vid rumstemperatur. Upprepa en gång.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Dumper vävnad och innehåll i en sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden.
- Lägg tillbaka innehållet i bägaren. Täck vävnader med 60 mL 100% n-propanol per 1 g vävnad. Använd minst 20 mL. Rör om i rumstemperatur i 1 h.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Dumpvävnad och innehåll i en 0,7 mm SIL. Använd tång för att manuellt massera vävnaden.
- Lägg tillbaka innehållet i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 mL DI vatten per 1 g vävnad. Använd minst 20 mL. Rör om i 15 minuter vid rumstemperatur. Upprepa tre gånger.
- Dumper vävnad och innehåll i en sil. Upprepa steg 2.3 – 2.6 för att samla bitar av vävnad för sackaros inkubation och frysning i kryostaten inbäddning medium.
- Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placeras i en märkt 15 mL tub. Frys vid-80 ° c över natten.
3. frystorkat
- Ta bort 15 mL-rören från-80 ° c och placera på torris. Håll proverna frysta på torris tills på frystorkat.
- Ta bort CAPS. Använd ett gummiband för att fästa en delikat uppgift torka till toppen för att täcka öppningen. Sätt prover på frystorkat i minst 2 dagar.
- Ta bort prover från frystorkade och placera rören på torris. Ta bort ömtåliga Task våtservetter väga varje prov på en analytisk skala. Montera lock och placera vid-80 ° c över natten.
4. fräsning
- Fyll en ytlig behållare med flytande kväve. Ta bort prover från frysen-80 ° c. Väg varje frystorkat MFP.
- Placera ett prov i murbruket. Använd en kryogen handske för att hålla morteln i flytande kväve.
- Använd en stöt fäst vid en handhållen borr för att fräsa provet. Fräs i 1 min intervall för att kontrollera förloppet och ta bort handskar hand från flytande kväve. I minst 5 minuter.
- Upprepa för alla prover. Spraya och torka av mortel och stöt med etanol mellan varje prov.
- Förvara pulveriserade prover i 15 mL-rör vid-80 ° c tills de är färdiga att användas.
Anmärkning: prover kan användas omedelbart eller lagras över natten.
5. hydrogel formation
- Om den förvaras vid-80 ° c över natten, ta bort och Tina vid rumstemperatur. Vid upptinning, beräkna den nödvändiga vikten av Pepsin (se tabell över material) och volym av saltsyra (HCL) som behövs för varje prov som resulterar i en lösning med 1% w/v prov pulver och 0,1% w/v pepsin i 0,01 M HCl. Tillsätt pepsin till HCL för att bilda en pepsin-HCl-lösning.
- Tillsätt prov pulver och pepsin-HCl lösning till en 15 mL tub. Tillsätt en liten röra bar, och rör om för 48 h.
- Placera rören på is i 5 min. beräkna den nödvändiga volymen av 10X PBS som behövs för varje prov som resulterar i en lösning med en 1x PBS koncentration. Tillsätt en lämplig volym 10X PBS till varje tub.
- Tillsätt 10% v/v 0,1 M NaOH till varje lösning för att nå pH 7,4. Använd ett pH-papper för att testa individuellt.
Obs: gel lösning kan förvaras vid 4 ° c i en vecka.
6. Encapsulating celler i hydrogeler
- Använda GFP-och luciferase-märkta celler
- Med hjälp av pH 7,4 gel lösning, Omsuspendera cellerna under inblandning pelleterat GFP-och luciferase-märkta 4T1 celler till en koncentration av 500 000 eller 1 000 000 celler/ml gel lösning. Tillsätt 16 μL gel cells lösning till varje brunn i en 16-brunn kammar bild. Inkubera i 30 min vid 37 ° c.
- Tillsätt 100 μL komplett RPMI-media till varje brunn. Fortsätt inkubering för 48 h vid 37 ° c. Den GFP-och luciferase-märkta celler kan visualiseras med fluorescens mikroskopi vid 0 timmar, 24 timmar, och 48 timmar efter gelation.
Anmärkning: cellproliferation kan mätas för GFP-och luciferase-märkta 4T1-celler som används här genom att tillsätta (S)-4,5-dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl) -4-tiazolekarboxylsyra kaliumsalt (se tabell över material) till brunnarna i 10 min och utföra Mareld avbildning med hjälp av ett Mareld Imaging system (se tabell över material). Efter behandling med bioluminescens kan cytoskelettet visualiseras (se avsnitt 10).
- Använda omärkta celler
- Med hjälp av pH 7,4 gel lösning, Omsuspendera cellerna under inblandning pelleterat omärkta 4T1 celler till en koncentration av 500 000 eller 1 000 000 celler/ml gel lösning. Tillsätt 16 μL gel cells lösning till varje brunn i en 16-brunn kammar bild och en 96-brunn tallrik. Inkubera i 30 min vid 37 ° c.
- Tillsätt 100 μL media i varje brunn. Fortsätt inkubering för 48 h vid 37 ° c.
Anmärkning: cellernas lönsamhet kan mätas (se avsnitt 11). Den 16-brunn kammare glida kanna bli brukat för tänkbar, och den 96-brunn plattan kanna bli brukat för kvantifiera.
7. H & E färgning
- För formalin-fast, paraffin-inbäddad vävnad, dränka diabilder som innehåller 5 μm sektioner två gånger i 100% xylen (5 – 10 min) för de-paraffinisering. Rehydrera genom att dränka i 100%, 95%, 85%, och 70% etanol för 5 min vardera följt av DI vatten i 5 min. Fortsätt till steg 7,6.
- För frysta vävnad avsnitt, ta avsnitt omedelbart från frys och sänk dem i 10% NBF för 10 min. tvätta i 1x PBS tre gånger för 5 min vardera. Skölj i vatten i 5 min.
- Fläcken kärnor med hematoxylin i 3 min. Skölj i rinnande kranvatten.
- Differentiera genom doppning 1 – 2 gånger i 0,3% syra alkohol (0,3% HCl i 70% etanol). Skölj i rinnande kranvatten i 5 min.
- Tillsätt blåelse agent för 30 s. Skölj i rinnande kranvatten i 5 min. submerge i 95% etanol för 30 s.
- Inkubera med eosin för 90 s vid rumstemperatur. Dehydrera i 3 förändringar av 100% etanol för 5 min vardera.
- Sänk två gånger i 100% xylen i 5 min vardera. Tillsätt distyren-plasticiser-xylen (DPX0 monteringsmaterial till bilden och Lägg till en täckglas. Låt det bota över natten före avbildning.
8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)- -2-naphtol färgning
- Förbered 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)- -2-naftol lösning.
- Tillsätt 0,5 g 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)- -2-naphtol pulver till en bägare med 100 mL propylenglykol. Värm till 95 – 100 ° c under omrörning i minst 30 min. förhindra att temperaturen överstiger 100 ° c.
- Ta bort bägaren från värmen och låt svalna något. Häll lösningen genom ett kvalitativt filtrerpapper av grad 4 för att avlägsna kvarvarande partiklar.
Obs: lösningen kan förvaras i rumstemperatur och bör filtreras genom ett spruta filter på 0,45 μm omedelbart före färgning.
- Fläcka frysta Vävnadsdelar.
- Ta bort diabilder från-80 ° c frys och lufttorka i 30 min. pre-cool 10% NBF vid-20 ° c i 30 min i en Coplin burk. Fixera bilderna vid rumstemperatur i 10 min. tvätta i DI vatten 3 gånger för 5 min vardera.
- Ta bort överflödigt vatten med en delikat uppgift torka innan doppa i propylenglykol 2 gånger för 5 min vardera. Ta bort diabilder från propylenglykol. Skölj ej ur.
- Placera bilder i sprutan filtrerad olja röd O färgning lösning för 3 h vid rumstemperatur.
- Differentiera genom att placera diabilder i 85% propylenglykol för 5 min. Skölj proverna i PBS två gånger för 5 min vardera.
- Fläcken prover med hematoxylin för 30 s. tvätta i rinnande kranvatten i 5 min och sedan placera diabilderna i DI vatten.
- Montera proverna med vattenbaserat monteringsmedium och låt mediet torka över natten före avbildning.
9. rheologi
- Ta pre-gel lösningar från steg 5,4 till skjuvreometer på is.
- Fäst en 25 mm arm och plåt till rheometern. Öppna reologi programvaran på datorn ansluten till rheometer.
- Utför rotations mappning och bestäm nollgapet. Höj armen när du är klar.
- Pipettera över 500 μL pre-gel på plattan. Sänk armen tills pre-gellösningen helt upptar gapet mellan plattan och armen. Var konservativ eftersom sänka armen förbi denna punkt kommer att resultera i pre-gel lösning rinner ut ur sidan.
- Utför en frekvens svep på pre-gellösningen från 0,1 – 100 Hz efter att den har legat på 37 ° c i 30 min.
- Höj rheometerarmen när den är slutförd. Torka vätska med en delikat uppgift torka. Skölj med DI vatten och torka med en delikat uppgift torka. Upprepa steg 9.4-9.6 med ytterligare prover.
10. phalloidin konjugatfärgning av F-Actin
- Ta med phalloidin-konjugatlösning till rumstemperatur. Centrifugera snabbt vid låg hastighet innan öppningen. Alikvot tillräckligt med lösning för analysen och förvara resten vid-20 ° c.
- Späd 1000X phalloidin konjugerade stamlösning till en 1x arbetslösning genom att tillsätta 1 μL stamlösning till 1 mL 1x PBS + 1% bovint serum albumin (BSA). Detta gör nog för 10 brunnar (100 μL/brunn).
Anmärkning: man kan använda vanlig 1x PBS, men 1x PBS + BSA föredras för att förhindra att phalloidin konjugat fastnar på röret. Förvara inte denna lösning efter analysen. 1 μL av blått fluorescerande färgämne (se tabellen av material) arbetslösning kan tillsättas till fläck för kärnor. Arbetslösning kan göras genom att blanda 1 μL 20 mM blått fluorescerande färgämne med 11,3 μL 1x PBS. - Aspirera media från brunnar (steg 6,1). Skölj brunnarna med 1x PBS.
- Lägg till 10% NBF. Inkubera brunnar med 10% NBF i 20 minuter vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten. Tvätta 3 gånger med PBS i 5 min varje gång.
- Tillsätt 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol i PBS i 5 min. Aspirera och tvätta 3 gånger med PBS i 5 min varje gång.
- Tillsätt 100 μL arbetslösning från steg 10,2 till varje brunn. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur. Aspirera och tvätta 3 gånger med PBS i 5 min varje gång. Låt vara i PBS vid 4 ° c.
- Sug upp och ta bort brunnar från packningen på kammar bilden. Använd nål näsa pincett för att ta bort packningen från bilden. Montera och täckslip prover med vattenbaserade monteringsmedel. Låt bota (5 min).
- Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop vid excitation/emission på 590/618 nm.
11. genomförbarhet analys
- Skölj cellerna med Dulbecco s PBS (DPBS). Tillsätt 100 μl av dpbs som innehåller 1 μm calcein am och 2 μm etidiumbromid homodimer till varje brunn. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Bild den 16-brunn kammare glida vid fluorescens Microscopy. Calcein acetoximetyl (calcein AM) kan observeras vid excitation/emission = 494/517 nm. Ethidium homodimer kan observeras vid excitation/emission = 528/645 nm.
- Läs 96-brunnen plattan på en Plattläsare med samma våglängder i steg 11,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFPs var decellularized efter bestrålning med hjälp av förfarandet som visas i figur 1a. MFPs pre-decellularization (figur 1b) och post-decellularization (figur 1c) visas. Decellularization bekräftades med hjälp av hematoxylin och eosin (H & E) färgning, och 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol färgning användes för att utvärdera lipidhalten (figur 2). Reologiska egenskaper hos ECM-hydrogeler bedömdes också vid 37 ° c (figur 3). Lagringmodulus var högre än förlustmodulus för alla förhållanden, vilket visar stabil hydrogel formation.
GFP-och luciferase-märkta 4T1 bröstcancerceller inkapslades i hydrogels. Cellproliferation granskades med fluorescensmikroskopi, mätningar av bioluminescens och genomförbarhet färgning 48 h efter inkapsling (figur 4). Bestrålade hydrogeler visade en ökande trend i tumörcellsproliferation. Phalloidin-konjugaten användes för att visualisera F-Actin i de inkapslade cellerna (figur 5). Denna teknik kan användas för att undersöka cellmorfologi och cytoskeletala egenskaper.
Figur 1: experimentellt arbetsflöde. (A) Schematisk hydrogel formation. Digitalkamera bilder togs av multifunktionsskrivare pre-(B) och post-decellularization (C). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bekräftelse av decellularization och de-lipidation i multifunktionsskrivare. Hematoxylin och eosin färgning (H & E) av icke-strålade multifunktionsskrivare inbäddade i paraffin och sektioneras vid 5 μm (a) jämfördes med multifunktionsskrivare frysta i kryostat inbädda medium (5 μm sektioner) före (B) och efter decellularization (C), inkuberas med sackaros före frysning i kryostatinbäddnings medium och sektioneras vid 30 μm (D). 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphtol färgning gjordes för att visualisera lipid retention i multifunktionsskrivare frysta i kryostat inbäddnings medium (5 μm sektioner) före (E) och efter decellularization (F) och inkuberas med sackaros före frysning i kryostat inbädda medium och sektioneras vid 30 μm sektioner (G). Skalstreck representerar 50 μm. Decell = decellularization. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bekräftelse av hydrogelbildning. Reologi användes för att bestämma lagring och förlust Modulus av kontroll (a) och bestrålade (B) pre-gel lösning tillverkad av multifunktionsskrivare vid 37 ° c och 0,5% stam. Felstaplar visar standardavvikelse. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: spridning av tumörceller i bestrålade ECM-hydrogels. 4T1 cellproliferation 48 h efter inympning visas med pre-gel härledd från kontroll (A) och bestrålade (B) MFP: er. (C) bioluminescence signal från 4T1 celler inbäddade i kontroll och bestrålade hydrogels. Calcein am färgade levande celler och etidiumbromid homodimer färgade döda celler utvärderades i kontroll (D) och bestrålade (E) hydrogels, och Live/Dead förhållandet kvantifierades (F). Skalstreck representerar 200 μm. Felstaplar visar standardfel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cytoskeletala egenskaper i ECM-hydrogels. Celler inom (a) kontroll och (B) bestrålade ECM-hydrogeler färgas med phalloidin-konjugat för att visualisera F-Actin (röd) och blått fluorescerande färgämne för att visualisera kärnor (blått) i bestrålade multifunktionsskrivare. skalstapeln motsvarar 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Vävnads vikt (g) | Kontroll (0 Gy) |
Bestrålade (20 Gy) |
| Ursprunglig MFP-vikt | 0,461 | 0,457 |
| MFP-vikt efter histologisk prov borttagning | 0,423 | 0,416 |
| MFP-vikt efter decellularization | 0,025 | 0,025 |
| Decellularized MFP vikt efter histologi prov avlägsnande | 0,015 | 0,016 |
Tabell 1: vävnads vikter före och efter decellularisering. Representativa vävnads vikter för varje villkor mättes före och efter MFP decellularization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod för hydrogel bildas är till stor del beroende på mängden start vävnad. Murina multifunktionsskrivare är små, och decellularization processen resulterar i en betydande minskning av material (tabell 1). Processen kan upprepas med fler multifunktionsskrivare för att öka den slutliga avkastningen. Fräsning är ett annat viktigt steg som kan leda till förlust av material. Andra har visat framgång med en kryogen kvarn, men detta protokoll är baserat på fräsning via en handhållen murbruk och borrmaskin med en mortelinfästning8,17. Detta har fördelen av lägre kapitalkostnader och minimera materialförluster men kan införa variationer i slutprodukten.
En utmaning att bekräfta decellularization och de-lipidation är i frysning fettvävnad i kryostat inbäddning medium. Figur 2A visar H & E färgning av en unirstrålad MFP inbäddad och sektionerad i paraffin. Distinkta kärnor är synliga på kanterna av fettceller nära korsningar med andra celler, och fettceller morfologi är väl underhållen. Figur 2b , C, E, F Visa multifunktionsskrivare som förberetts genom inbäddning och frysning av multifunktionsskrivare i kryostatinbäddnings medium och snittning av 5 μm skivor. Denna process kunde inte behålla fettceller morfologi och form. Emellertid, decellularization bekräftades genom förlusten av kärnor och andra spår av DNA (figur 2C), och de-lipidation visualiserades med förlust av neutral lipid innehåll färgning (figur 2F). Adipocyte-morfologin upprätthölls genom inkuberande multifunktionsskrivare i sackaros, inbäddning och infrysning i kryostatinbäddnings medium och snittning av 30 μm skivor (figur 2D, G). Medan visualiseringen av H & E färgning var svår med denna metod (figur 2D), 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol färgning bekräftade retention av fettceller morfologi (figur 2g).
Vi har utvecklat en in vitro-hydrogelmodell som kan efterlikna den normala vävnads mikromiljön in vivo och dess respons på strålningsskador. ECM hydrogeler har tillverkats i liknande studier, men effekterna av strålningsskador på tumör cell beteende har inte bedömts9,12,16,17,18. Vi förväntar oss att bestrålning av multifunktionsskrivare kommer att förändra ECM ombyggnad och sammansättning, och dessa sammansättning förändringar kommer att kännetecknas i framtida studier. Vi observerade en ökande trend i spridningen av 4T1-celler i bestrålade ECM-hydrogeler med både Mareld-avbildning och genomförbarhet färgning (figur 4). Dessutom använde vi phalloidin konjugat för att fläcka F-aktin filament i inkapslade tumörceller och fann en kvalitativ ökning av aktin anpassning och tumör cell förlängning i bestrålade ECM hydrogels, vilket tyder på en ökning av vidhäftningshållfasthet och invasiv kapacitet (figur 5)19,20. Framtida experiment kommer att undersöka förändringar i Focal vidhäftning dynamik och proteas-medierad remodeling för utvärdering av cell migration och invasion.
Denna metod utvecklades med hjälp av en murina tnbc cellinjer, men denna metod kan användas som en plattform för att utvärdera spridningen och invasivitet av andra celltyper. Framtida studier kan innefatta immunceller för att avgöra deras roll som svar på strålning samt andra former av vävnadsskada (t. ex. kirurgi). Även om denna studie utvärderade ECM hydrogeler från mfps bestrålade ex vivo, ytterligare studier kommer att undersöka in vivo strålning av multifunktionsskrivare för att utvärdera effekten av fysiologiska strålning svar och infiltrerande immunceller på ECM egenskaper. Vi har etablerat en metod för att tillverka ECM hydrogeler från mus multifunktionsskrivare för att studera effekten av normal vävnads strålning på tumör cell beteende, och denna teknik kan utvidgas till mänsklig vävnad för en mer relevant hydrogel modell. Övergripande, undersöka normal vävnadsskada genom ECM hydrogeler kan leda till insikter i rollen av ECM förändringar efter strålbehandling i lokala recidiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Laura L. Bronsart för att tillhandahålla GFP-och luciferase-4T1 celler, Dr Edward l. lagory för råd om 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)- -2-Naphthol färgning, Dr. Craig l. Duvall för Ivis och lyophilizer bruk och Dr. Scott A. guelcher för skjuvreometer Använda. Denna forskning stöddes ekonomiskt av NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
