Summary
Questo lavoro presenta un protocollo per stabilire una coltura di sospensione cellulare derivata dal tè ( Foglie diCamellia sinensis L.) che possono essere utilizzati per studiare il metabolismo di composti esterni che possono essere assorbiti da tutta la pianta, come gli insetticidi.
Abstract
È stata sviluppata una piattaforma per studiare il metabolismo degli insetticidi utilizzando tessuti in vitro della pianta del tè. Foglie da sterili piantagioni di tè sono stati indotti a formare callus sciolto su Murashige e Skoog (MS) mezzi basali con gli ormoni vegetali 2,4-dichlorophenoxyacetic acido (2,4-D, 1.0 mg L-1) e kinetina (KT, 0.1 mg L-1). Callus si formò dopo 3 o 4 giri di subcultura, ciascuno della durata di 28 giorni. Il callo sciolto (circa 3 g) è stato poi inoculato in supporti liquidi B5 contenenti gli stessi ormoni vegetali ed è stato coltivato in un'incubatrice agitazione (120 giri/) al buio a 25 gradi centigradi. Dopo 3/4 sottoculture, una sospensione cellulare derivata dalla foglia di tè è stata stabilita in un rapporto di sottocultura compreso tra 1:1 e 1:2 (liquido madre sospensione: mezzo fresco). Utilizzando questa piattaforma, sei insetticidi (5 g mL-1 ciascuno tiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate e omethoate) sono stati aggiunti nella coltura delle sospensioni cellulari derivata dalla foglia di tè. Il metabolismo degli insetticidi è stato tracciato utilizzando la cromatografia liquida e la cromatografia a gas. Per convalidare l'utilità della coltura delle sospensioni delle cellule del tè, i metaboliti del tiamethoxan e del dimethoate presenti nelle colture cellulari trattate e nelle piante intatte sono stati confrontati utilizzando la spettrometria di massa. Nelle colture trattate di cellule del tè, sono stati trovati sette metaboliti di tiamethoxan e due metaboliti di dimethoate, mentre nelle piante trattate intatte, sono stati trovati solo due metaboliti del tiamethoxam e uno di dimethoate. L'uso di una sospensione cellulare ha semplificato l'analisi metabolica rispetto all'uso di piante da tè intatte, soprattutto per una matrice difficile come il tè.
Introduction
Il tè è una delle bevande analcoliche più consumate al mondo1,2. Il tè è prodotto dalle foglie e dalle gemme della perenne camellia sinensis L. Tea coltivate in vaste piantagioni e sono suscettibili a numerosi insetti parassiti3,4. Gli insetticidi organofosforici e neonicotinoidi sono spesso usati come insetticidi sistemici5 per proteggere le piante da tè da parassiti come mosche bianche, tramogge di foglie e alcune specie di lepidopteran6,7. Dopo l'applicazione, questi insetticidi vengono assorbiti o traslocati nella pianta. All'interno della pianta, questi insetticidi sistemici possono essere trasformati attraverso l'idrolisi, l'ossidazione o le reazioni di riduzione da parte degli enzimi vegetali. Questi prodotti di trasformazione possono essere più polari e meno tossici rispetto ai composti padre. Tuttavia, per alcuni organofosfati, le bioattività di alcuni prodotti sono più elevate. Ad esempio, l'accesata è metabolizzato nel methamidophos più tossico8,9e dimethoate in omethoate10,11. Gli studi metabolici delle piante sono quindi importanti per determinare il destino di un pesticida all'interno di una pianta12.
Le colture di tessuti vegetali si sono dimostrate una piattaforma utile per studiare il metabolismo dei pesticidi, con i metaboliti identificati simili a quelli trovati nelle piante intatte13,14,15. L'uso di colture tissutali, in particolare le colture di sospensioni cellulari, ha diversi vantaggi. In primo luogo, gli esperimenti possono essere effettuati senza microrganismi, evitando così l'interferenza della trasformazione o della degradazione dei pesticidi da parte dei microbi. In secondo luogo, la coltura dei tessuti fornisce materiali coerenti da utilizzare in qualsiasi momento. In terzo luogo, i metaboliti sono più facili da estrarre dalle colture di tessuti che dalle piante intatte, e le colture di tessuti hanno spesso meno composti interring e minore complessità dei composti. Infine, le colture tissutali possono essere utilizzate più facilmente per confrontare una serie di metabolismo dei pesticidi in un singolo esperimento16.
In questo studio, è stata stabilita con successo una sospensione cellulare derivata dalle foglie di piantagione di tè coltivata sterilmente. La coltura delle sospensioni delle celle di tè è stata poi utilizzata per confrontare i comportamenti di dissipazione di sei insetticidi sistemici.
Questo protocollo dettagliato ha lo scopo di fornire alcune indicazioni in modo che i ricercatori possano stabilire una piattaforma di coltura dei tessuti vegetali utile per studiare il destino metabolico degli xenobiotici nel tè.
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Protocol
1. Cultura del callo del tè
NOTA: Le foglie sterili sono state derivate da linee di plantlet coltivate in vitro sviluppate per la prima volta nel gruppo di ricerca17. Tutte le procedure fino alla sezione 5 sono state eseguite in una cappa sterile di flusso laminare, ad eccezione del tempo di coltura in un'incubatrice.
- Regolare il pH dei due supporti (Murashige e Skoog [MS] supporto basale e mezzo liquido B5 di Gamborg) a 5,8 prima dell'autoclaving (121 gradi centigradi, 20 min).
- Tagliare lungo la vena centrale di una foglia sterile con le forbici, quindi suddividere ogni metà in piccoli pezzi di circa 0,3 cm x 0,3 cm in una piastra di Petri.
- Collocare gli espianti sterili (i piccoli pezzi di foglie) su supporti basali MS contenenti gli ormoni vegetali 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg L-1). Sei espianti possono essere collocati in un flacone da 300 mL contenente 100 mL di supporti basali MS.
- Coltura le foglie di cui sopra esplode ad una temperatura costante di 25 gradi centigradi al buio. Dopo 28 giorni, selezionare la prima generazione di callo indotto e trasferirlo in una pallina fresca (una sottocultura). Acquisisci il callo sciolto e friabile dopo 3/4 sottoculture.
2. Coltura delle sospensioni a celle di tè
- Tagliare i calli vigorosi, friabili e sciolti dal mezzo solido in piccoli pezzi (gamma qui 0,5, 2 mm) utilizzando una lama chirurgica sterile in condizioni sterili.
- Pesare circa 3 g dei piccoli pezzi di callo. Posizionare il callus in un pallone da 150 mL contenente 20 mL di supporti liquidi B5 integrati con 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg L-1).
- Coltura la sospensione a celle liquide ad una temperatura costante (25 x 1 gradi centigradi) in un'incubatrice tremante a 120 giri al buio.
- Dopo 7-10 giorni di coltura, togliere i flaconi di coltura e lasciarli riposare per qualche minuto.
- Prendere tutti i sovrinamine come materiale di semi per la sottocoltura al mezzo fresco (rapporto di sottocultura tra liquido madre sospensione a medio fresco compreso tra 1:1 e 1:2). Rimuovere i calli precipitati e di grandi dimensioni.
- Ottieni l'ultima coltura di sospensioni cellulari ben coltivata dopo 3/4 cicli di sottocultura di 28 giorni ciascuno.
3. Triphenyl cloruro di clorzo
- Uccidi un campione di cellule viventi a 100 gradi centigradi per 10 min come cella di controllo prima di colorare la vitalità.
- Centrifugare tutta la coltura di sospensione cellulare per 8 min a 6000 x g. Rimuovere il supernatante prima di sospendere le cellule in 2,5 mL di buffer salina con buffer fosfati (PBS) (pH 7.3) e agitarlo a mano per 1 min.
- Aggiungere 2,5 mL della soluzione TTC (0,4% tripil tetrazolium) e agitare di nuovo a mano.
- Incubare il composto per 1 h in un'incubatrice in piedi (30 gradi centigradi).
4. Trattamento e campionamento delle colture di sospensioni per cellule del tè con insetticidi
- Aggiungere un'aliquota di 400 l di soluzione di stock sterilizzata a filtro (500 g mL-1) di quattro neonicotinoidi (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid e imidaclothiz) o due organofosfati (dimethoate e omethoate) nelle colture di sospensione cellulare, rispettivamente.
NOTA: Se l'obiettivo è confrontare i comportamenti xenobiotici, utilizzare lo stesso lotto madre di sospensioni cellulari per testare i diversi composti. - Coltura i campioni di sospensioni cellulari con insetticidi a temperatura costante (25 x 1 gradi centigradi) e agitazione della velocità dell'incubatrice (120 giri/min). Prelevare i campioni (vedere il passaggio 4.3 o 4.4) su 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 e 75 giorni.
- Per testare un campione contenente un neonicotinoide, rimuovere un'aliquota di 1 mL della coltura cellulare omogenea, collocarlo in un tubo di centrifuga di plastica da 1,5 ml e centrifugare a 4000 x g per 2 min.
- Passare i superanatanti attraverso una membrana filtrante di dimensioni pori di 0,22 m prima dell'analisi mediante la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC-UV) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni-quadrupolo di massa di volo (UPLC-QTOF) spettrometria (Tabella dei materiali).
- Per testare un campione contenente un organofosfato, rimuovere un 500 l'Ll della coltura cellulare e collocarlo in un tubo di centrifugadi o un tubo di centrifuga in plastica da 1,5 ml (preparare quest'ultimo campione come quello del neonicotinoide).
- Aggiungere 0,1 g di cloruro di sodio e 5 mL di acetato di acetone/etil (3:7, v/v) nel tubo centrifugato 35 mL dei 500 campioni.
- Vorticare le miscele per 1 min, e poi lasciarli riposare per 10 min.
- Prendere 2,5 mL del supernatante in un tubo di vetro da 10 mL ed evaporare a quasi essiccazione utilizzando un evaporatore di azoto a 40 gradi centigradi.
- Sciogliere il residuo con 1 mL di acetone, vortice per 1 min, passarlo attraverso una membrana filtrante 0,22-m prima dell'analisi da rilevatore fotometrico gas-demografia-fiamma (GC-FPD).
5. Esempio di preparazione di pianta di tè intatta con insetticidi
NOTA: Lo studio intatto della pianta del tè è stato condotto in un sistema idroponico utilizzando piantine di tè coltivate in 50mL di una soluzione nutritiva (30 NH4, 10 NO3-, 3,1 PO4-, 40 K , 20 Ca2 ,25 Mg2 ,0,35 Fe 2,0,1 B 3,1,0 Mn2, 0,1 , n2, 0,025 Cu2, 0,05 Mo e 10 Al3 ,in mg L-1)18. Una serra sperimentale era sotto un ciclo chiaro-scuro (12 h di luce e 12 h di oscurità) a 20 gradi centigradi presso l'Università Agricola Anhui.
- Mettere cinque piante in un vaso di plastica da 4 L per 15 giorni.
- Aggiungere 0 ppm (controllo) o 100 ppm di thiamethoxam o dimethoate rispettivamente in vasi di plastica.
- Preparare il campione vegetale intatto secondo il metodo precedente, ad eccezione di presoinconddiace19, quindi analizzare con spettrometria di massa per uno spettro di massa accurato.
6. Analisi strumentale
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Analisi HPLC del comportamento metabolico dei neonicotinoidi
- Utilizzare un HPLC-UV (Table of Materials) per rilevare il contenuto e i prodotti metabolici di tiamethoxam e acetamiprid ad una lunghezza d'onda di 254 nm, e di imidacloprid e imidaclothiz a 270 nm in campioni della sezione 4.3.
NOTA: la condizione HPLC-UV era la stessa dello studio precedente19.
- Utilizzare un HPLC-UV (Table of Materials) per rilevare il contenuto e i prodotti metabolici di tiamethoxam e acetamiprid ad una lunghezza d'onda di 254 nm, e di imidacloprid e imidaclothiz a 270 nm in campioni della sezione 4.3.
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Analisi GC del comportamento metabolico degli organofosfati
- Rilevare il contenuto di dimethoate e omethoate nei campioni della sezione 4.4 da un GC-FPD utilizzando una colonna chirale (Tabella dei materiali).
- Utilizzare l'azoto come gas portante e impostare la portata a 1,0 mL min-1.
- Impostare la temperatura iniziale a 120 gradi centigradi, e tenerla per 5 min. Aumentare la temperatura a 150 gradi centigradi a 30 gradi centigradi min-1 e tenere premuto per 3 min. Infine aumentare a 210 gradi centigradi a 30 gradi centigradi min-1 e poi tenere premuto per 5 min.
- Impostare la temperatura di iniezione a 200 gradi centigradi in modalità senza divisioni; Impostare la temperatura del rivelatore a 250 gradi centigradi.
- Impostare il volume di iniezione su 1 .
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Analisi UPLC-QTOF dei metaboliti degli insetticidi nella coltura cellulare
- Rilevare i metaboliti degli insetticidi nella coltura cellulare (campioni della sezione 4.3) utilizzando UPLC-QTOF con una colonna C18 (Tabella dei materiali).
- Impostare la portata su 0,2 mL min-1. Impostare il volume di iniezione su 10.
- Per i campioni trattati con neonicotinoidi, impostare la fase mobile iniziale su 85% A (5 mM di acqua formatta di ammonio) e 15% B (acetonitrile). Oltre 10 min, aumentare la fase mobile B al 38% e tornare al 15% oltre 1 min, tenere per 9 min.
- Per i campioni trattati con organofosfato, impostare la fase mobile iniziale al 55% A (0,1% di acqua acimica) e al 45% B (acetonitrile). Oltre 5 min, aumentare la fase mobile B al 70%, poi tornare al 45% di B sopra 0,5 min, tenere per 2,5 min.
- Impostare i parametri di funzionamento QTOF come segue: temperatura del gas, 325 gradi centigradi; essiccazione del gas (azoto), 10 L min-1; temperatura del gas di guaina, 350 gradi centigradi; flusso di gas di guaina, 11 L min-1; tensione capillare, 4000 V; tensione dell'ugello, 1000 V; tensione del frammentatore, 100 V per gli insetticidi neonicotinoidi o 110 V per insetticidi organofosforici; tensione skimmer, 65 V; in modalità ios positivo.
- Impostare lo strumento sullo spettro di scansione completo e sulla modalità MS/MS di destinazione.
- Elaborare i dati utilizzando strumenti di massa accurati; Dedurre i metaboliti senza prodotti standard dall'annotazione MS/MS così come la letteratura12,15,20,21,22.
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Analisi UPLC-Orbitrap dei metaboliti degli insetticidi in estratto vegetale intatto
- Rilevare i metaboliti degli insetticidi nell'estratto vegetale intatto utilizzando la spettrometria di massa UPLC-Orbitrap (Tabella dei materiali).
- Impostare i parametri operativi della spettrometria di massa (Tabella dei materiali) come segue: pressione del gas di guaina, 35 arb; temperatura del gas, temperatura del gas, 300 gradi centigradi; tensione dell'ugello, 3,5 KV; temperatura capillare, 350 gradi centigradi.
- Impostare i programmi di elusione come indicato di seguito (passaggi 6.3.3 e 6.3.4) per l'analisi UPLC-QTOF della coltura cellulare.
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Representative Results
L'induzione di callo dalle foglie raccolte da alberi da tè coltivati sul campo e da foglie eccitate da piantagioni di tè coltivate in vitro in un ambiente sterile è stata confrontata misurando contaminazione, doratura e induzione dopo 28 giorni di coltivazione su supporti MS ( figura 1A). La crescita del callo è stata registrata a 20, 37, 62 e 90 giorni di cultura (Figura 1B). Il callo derivato dalle foglie coltivate in vitro ha mostrato una crescita più vigorosa rispetto al callo derivato dalle foglie coltivate sul campo durante tutti i 90 giorni di coltivazione. Il callo dalle foglie sterili era giallo brillante, mentre il callo dalle foglie coltivate sul campo era marrone (Figura 1B).
Ad una concentrazione di 1,0 mg L-1 di 2,4-D23, la concentrazione di KT è stata ottimizzata. A 0,05 mg L-1 KT, il tasso di crescita del callo era lento, la texture era un po 'compatta, e il callo era di colore bianco (Figura 2C); a 0,1 mg di concentrazione L-1 KT, il tasso di crescita calloso è stato il più alto, fino al 61,5% (Figura 2A), la texture era allentata e il colore era giallastro (Figura 2C); quando il KT è stato aumentato a 0,5 mg L-1, il callo era compatto e irregolare e marrone al centro (Figura 2C). Dopo aver selezionato la concentrazione di KT, la concentrazione di 2,4-D è stata ulteriormente studiata. Con una combinazione di 1 mg L-1 2,4-D e 0.1 mg L-1 KT, il tasso di crescita del callo è stato il più alto, raggiungendo 46.9%, e l'aspetto del callo era il migliore (Figura 2B,D).
Dopo la seconda sottocultura su supporti solidi, più della metà della superficie di ogni foglia eccitata è stata coperta dal callo crescente (Figura 3A). Dopo la sottocultura 4th, le sezioni di foglia sono state completamente coperte dal callo. Dopo la sottocultura 5 th, la consistenza callosa ha cominciato a diventare compatta con alcune macchie bianche e marroni sul fondo.
Quando il ciclo della sottocultura durava 21 giorni (Figura 3B), il callo era vigoroso, ma non era stato raggiunto il massimo numero di crescita, indicando che la sottocultura frequente avrebbe comportato una minore quantità di callo. Quando il ciclo della sottocultura durava 28 giorni, il callo era cresciuto vigorosamente, il colore era di colore giallastro e la consistenza era allentata. Dopo 35 giorni, il callo cominciò a dorarsi dal centro. Il callo era nello stato peggiore, con un colore marrone scuro e non cresce più, a 42 giorni.
Due tipi di supporti liquidi sono stati confrontati per i loro effetti sulla crescita del callo e il colore della sospensione cellulare (Figura 4). Sono stati testati tre diversi rapporti tra liquido madre e volume totale di liquido di coltura. Durante i 75 giorni di coltivazione, la densità cellulare è gradualmente aumentata nelle colture iniziata a tutti e tre i rapporti. Il rapporto di 15 g di celle in supporti freschi da 40 mL (v/v) ha prodotto un valore di densità ottica (OD) significativamente superiore a quello di 4 g in 40 mL (v/v) e 6 g in 40 mL (v/v) (Figura 5A). Dopo 4 cicli di sottocultura di 28 giorni ciascuno, è stato stabilito con successo un sistema di sospensione delle celle di tè da un callo sterile in supporti liquidi B5 (Figura 6).
Figura 1 : Confronto dell'induzione del callo dalle foglie raccolte e dalle foglie sterili della pianta. (A) Confronto dell'induzione del callo dalle foglie raccolte da piante da tè coltivate in piantagioni e da foglie asformi da piante sterili coltivate in vitro. Sono stati osservati espianti per la contaminazione, la doratura e l'induzione del callo. (B) Confronto della crescita callosa delle foglie derivate da piante da tè coltivate in piantagione (set 1) e di piantagioni sterili coltivate in vitro (set 2): le fotografie erano in giorni diversi: 20 (pannelli a); 37 (b); 62 (c); e 90 (d). Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Il tasso di crescita e lo stato di crescita del callo derivato dalla foglia di tè sotto diverse concentrazioni ormonali delle piante. Il tasso di crescita (A) e lo stato di crescita (C) del callo derivato dalle foglie di tè sotto diverse concentrazioni di KT e 1 mg L-1 2,4-D; Il tasso di crescita (B) e lo stato di crescita (D) del callo in diverse concentrazioni 2,4-D e 0,5 mg L-1 KT. Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : stato del callo dopo diversi numeri di cicli di sottocoltura (A) e diverse lunghezze di cicli di sottocoltura (B). Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Influenza di diversi tipi di supporti sulla crescita del callo nel sistema di coltura delle sospensioni liquide. (A) Mezzo B5. (B) Ms medio. Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : i valori di densità ottica e la colorazione TTC. (A) Il valore OD680 della sospensione cellulare è iniziato a rapporti diversi da 0 a 75 giorni; (B) La colorazione TTC delle cellule viventi e di controllo. Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Il processo di definizione di una coltura di sospensione delle celle di tè a temperatura costante (25 x 1 oC) in un'incubatrice scura. Cultura sterile di piantagioni di tè come fonte di espianto foglia (a); Foglia di tè inoculata su mezzo MS con 2,4-D (1,0 mg L-1) e KT (0,1 mg L-1) (b); Callus colto iniziale dopo 28 giorni (c); Callus adatto per la sospensione cellulare dopo 4 cicli di sottocoltura di 28 giorni ciascuno (d); I passi rimanenti erano alla stessa temperatura, ma ad una velocità costante di 120 rpm in un'incubatrice tremante: Callus inoculato in mezzo B5 per 7 a 10 giorni (e); Sospensione delle cellule di semi dopo la rimozione del callo precipitato e di grandi dimensioni (f); La sottocoltura della sospensione cellulare dopo 1 ciclo di 28 giorni (g); Sospensione cellulare matura dopo 3-4 cicli di sottocoltura di 28 giorni ciascuno (h). Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Il metabolismo di 5 g/mL di 6 insetticidi nella coltura delle sospensioni delle cellule del tè e nei media (CK) incubato a temperatura costante (25 x 1 C) e scuotendo la velocità dell'incubatrice (120 giri/) per 75 giorni. Thiamethoxan (A), imidacloprid (B), acetamiprid (C), imidaclothiz (D), dimethoate (E1) e omethoate (F); (E2) Produzione nel tempo del metabolita del dimetto (omethoate) prodotto nella coltura cellulare e nei media trattati con dimethoato. Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Cromatogrammi ionici totali (TIC) degli estratti provenienti dalla coltura cellulare di controllo non trattata, coltura cellulare trattata con thiamethoxam, supporti trattati con thiamethoxam (senza cellule) dopo 75 giorni. Picchi 1-5, 7 e 8 erano metaboliti del thiamethoxam e Peak 6 era thiamethoxam (A); I TIC degli estratti provenienti dalla coltura cellulare trattata con ditotoloata, dai supporti trattati con ditolofoso (senza cellule) e dalle cellule di controllo non trattate dopo 60 giorni. Picchi 1 e 2 erano metaboliti del dimetto e Peak 3 era dimethoate (B); TIC degli estratti da thiamethoxam trattati (superiore) e non trattati (inferiore) piante intatte (C); TIC degli estratti da piante trattate con ditofoso (superiore) e non trattate (inferiore) intatte (D); Il metabolita del dimethoato a tR 1.86 min in piante intatte (D1); Nessun composto rilevato a tR 1,86 min in piante non trattate (D2). Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: La spettrometria di massa secondaria che utilizza UPLC-QTOF di picchi derivati da colture trattate con (A) thiamethoxam e (B) dimethoate. Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 4: La spettrometria di massa secondaria che utilizza Q-Exactive di picchi derivati da piante intatte trattate con thiamethoxam (A1, A2 e A3) e dimethoate (B1 e B2). Questa cifra è stata modificata daJiao et al. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Questo articolo presenta il processo dettagliato di definizione di un modello di metabolismo dei pesticidi nel tessuto vegetale del tè, compresa la selezione di espianti, la determinazione della vitalità cellulare e la creazione di una coltura di sospensione delle cellule del tè con alta attività. Qualsiasi parte di un tessuto vegetale potrebbe essere utilizzata per avviare callo in un ambiente sterilizzato25. Le foglie di tè sono state scelte per l'avvio del calloso in questo studio, non solo perché le foglie tendono ad essere meno contaminate rispetto alle parti sotto terra, ma anche perché sono la parte commestibile della coltura e l'obiettivo principale dell'applicazione di pesticidi.
In questo studio, sono stati confrontati il tasso di induzione e lo stato di crescita del callo dalle foglie prelevate dal campo e dalle foglie asformi da una piantasterile coltivata in vitro. Le foglie sterili avevano tassi molto più bassi di doratura e contaminazione e un più alto tasso di induzione rispetto alle foglie coltivate sul campo. Ciò era probabile perché le foglie provenienti da piante coltivate sul campo non solo subivano la sterilizzazione superficiale mediante etanolo e mercurio, ma anche un cambiamento nell'ambiente di crescita, mentre le foglie sterili venivano coltivate in un ambiente sterile e potevano essere utilizzate direttamente senza sterilizzazione aggiuntiva. Inoltre, il callo derivato dalle piantagioni sterili coltivate in vitro ha mostrato una crescita più vigorosa rispetto alle foglie coltivate sul campo durante i 90 giorni di coltivazione. Le foglie delle piantagioni sterili erano più adatte per l'induzione del callo del tè, non solo a causa della loro elevata induzione del callo e dei bassi tassi di contaminazione, ma anche a causa del più breve tempo di pre-trattamento e dell'indipendenza dai fattori stagionali.
Per la coltura del callo sciolto e friabile, i parametri cruciali, principalmente i livelli di crescita delle piante e la durata e il numero dei cicli di sottocoltura, devono essere ottimizzati25. 2,4-D può promuovere efficacemente l'induzione e la crescita del callo ed è l'ormone più usato nella cultura del callo26. Anche i tempi di subcultura e la lunghezza del ciclo della sottocultura sono importanti per la cultura del callo25. Dopo 2 o 4 sottoculture di 28 giorni di ogni ciclo, il callo aveva una consistenza sciolta con un colore giallastro e nessuna doratura. Gli esperimenti di ottimizzazione hanno determinato che il miglior protocollo di induzione del callus consisteva nell'inserire espianti fogliari da piantagioni sterili su supporti basali MS contenenti 1 mg L-1 2,4-D e 0,1 mg L-1 KT e di trasferire l'eximpianto/callus ogni 28 giorni per un totale di 4 cicli di sottocoltura. Questo protocollo ha avviato callo sciolto e friabile che era adatto per l'avvio di una sospensione cellulare.
Nella coltura dei tessuti vegetali, il mezzo solido utilizzato per la crescita del callo può spesso essere utilizzato per la coltura delle sospensioni cellulari in forma liquida23. Mentre, il tè entra in essere grandi quantità di polifenoli nel mezzo basale MS contenente un'alta concentrazione di sali inorganici, con conseguente doratura del callo27,28. In questo studio, sono stati entrambi testati supporti liquidi B5 e supporti MS. I tassi medi di crescita non hanno trovato differenze significative tra le due culture (16,66% nei media basali B5 e 15,77% nei media basali degli Stati membri; Figura 4). Tuttavia, i calli erano marroni nei media basali della SM. Così, B5 supporti basali è stato selezionato nel metodo proposto.
L'ossigeno è importante per la crescita delle cellule vegetali e metabolismo. Nella coltura liquida, un volume eccessivo di liquido diminuirà la concentrazione di ossigeno e inibirà la crescita cellulare, mentre troppo poco liquido inibisce anche la crescita cellulare25. Sono stati testati diversi rapporti di volume liquido/fiaschetta (mL liquido: fiaschetta mL). Sulla base del peso secco della crescita cellulare dopo 21 d, il liquido: rapporti di fiaschetta classificati come segue: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. In questo studio, 40 mL di liquido di coltura sono stati collocati in un flacone da 150 mL (40 mL: 150 mL) è stato selezionato in base al modo in cui la sospensione cellulare sembrava osservata ad occhio nudo.
Le cellule vegetali non possono crescere bene quando la densità cellulare è troppo alta o troppo bassa. Così, la percentuale di coltura di sospensioni cellulare madre a nuovo mezzo al momento della sottocultura influisce sul potenziale di crescita delle cellule29. Questo studio ha utilizzato il valore OD della coltura omogenea delle sospensioni cellulari per rappresentare la quantità di crescita cellulare. L'inoculazione con 15 g di liquido madre in 40 mL di volume totale di liquido di coltura (v/v) era adatto per la crescita cellulare. Il rapporto di sottocoltura era uguale a 1:1 e 1:2 (sospensione madre liquida: mezzo fresco).
La vitalità cellulare all'interno della coltura delle sospensioni delle cellule del tè è stata testata dalla colorazione TTC. Il composto TTC incolore può essere convertito nel formazan di colore rosso da dicuati nei mitocondri delle cellule viventi, ma il colore non può essere modificato da cellule morte (Figura 5B). Questo metodo ha verificato lo stato di crescita delle cellule nella coltura liquida.
La creazione di una coltura di sospensioni per cellule del tè fornisce una piattaforma di ricerca in vitro facile per studiare il metabolismo e metaboliti di diversi pesticidi. Indipendentemente dalla stagione e dalle condizioni atmosferiche, le colture di sospensioni cellulari possono essere trattate con diversi pesticidi, diverse concentrazioni di principio attivo e per diverse lunghezze di tempo. I metaboliti prodotti nelle colture di sospensione delle cellule del tè erano simili a quelli estratti da piante intatte (Figura supplementare 1 e Figura supplementare 2). È interessante notare che sono stati rilevati sette metaboliti del tiamethoxam e due metaboliti di dimethoato nella coltura della sospensione delle cellule del tè, ma solo due metaboliti del thiamethoxam e uno per il dimethoate nelle piante intatte trattate ( Figura supplementare1, Figurasupplementare 2 e Figura supplementare 3). Ciò può essere dovuto alla più facile estrazione dalle cellule senza cuticola cerosa, meno composti dal tè che interferiscono con i risultati della spettrometria di massa (l'effetto matrice), o il più semplice profilo metabolita delle cellule del tè rispetto all'intera pianta.
I risultati hanno mostrato che il tiamethoxam è stato più facilmente metabolizzato dalla cellula del tè rispetto agli altri tre neonicotinoidi ( Figura supplementare4). Entrambi gli organofosfati (dimethoate e omethoate) sono stati metabolizzati più velocemente dei neonicotinoidi. Questi risultati mostrano la diversità delle vie metaboliche e della regolazione metabolica nella cellula del tè, che devono essere ulteriormente studiate.
L'utilizzo di piante intatte per studiare il metabolismo degli insetticidi e per identificare i metaboliti insetticidi presenta numerose difficoltà, tra cui barriere all'assorbimento e trasporto a lunga distanza di composti iniziali e di rottura all'interno della pianta30. Le colture di sospensione cellulare non solo potevano risolvere questo problema, ma anche ridurre l'interferenza della matrice nell'analisi dei campioni rispetto all'estratto delle foglie fresche24. Questa ricerca ha dimostrato che le colture di sospensione delle cellule del tè sono una piattaforma efficace per studiare il metabolismo dei composti xenobiotici nella pianta del tè. Può essere servito come una modalità per studiare il metabolismo degli xenobiotici in altre piante.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research & Development Program (2016YFD0200900) della Cina, dalla National Natural Scientific Foundation of China (n. 31772076 e n. 31270728), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700) e dall'Open Fund di Laboratorio chiave dello Stato di biologia e utilizzo delle piante di tè (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
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