Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för upprättande av en cell SUS pension kultur som härrör från te (Camellia sinensis L.) blad som kan användas för att studera metabolismen av externa föreningar som kan tas upp av hela växten, såsom insekticider.
Abstract
En plattform för att studera insekticid metabolism med hjälp av in vitro-vävnader av teplantan utvecklades. Blad från sterila te plantlets induceras för att bilda lös förhårdnader på murashige och Skoog (MS) basal media med växthormoner 2, 4-diklorfenoxiättiksyra (2, 4-D, 1,0 mg l-1) och kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus bildades efter 3 eller 4 omgångar av subculturing, varje varar 28 dagar. Lös Valk (ca 3 g) inokulerades sedan till B5 flytande media som innehöll samma växthormoner och odlades i en skakinkubator (120 rpm) i mörker vid 25 ± 1 ° c. Efter 3 − 4 subkulturer, en cell SUS pension som härrör från teblad fastställdes vid en subkultur ratio mellan 1:1 och 1:2 (SUS pension moder vätska: färskt medium). Med hjälp av denna plattform, sex insekticider (5 μg mL-1 varje thiamethoxam, imidakloprid, acetamiprid, imidaklothiz, dimetoat, och omethoate) lades till Tea Leaf-derived cell SUS pension kultur. Metabolismen av insekticider spåras med hjälp av vätskekromatografi och gaskromatografi. För att validera nyttan av te cell SUS pension kultur, metaboliterna av tiamethoxan och dimetoat närvarande i behandlade cell kulturer och intakt växter jämfördes med hjälp av masspektrometri. I behandlade te cell kulturer hittades sju metaboliter av tiamethoxan och två metaboliter av dimetoat, medan de i behandlade intakta växter endast fann två metaboliter av tiamethoxam och en av dimetoat. Användningen av en cell SUS pension förenklat metabolisk analys jämfört med användning av intakt te växter, särskilt för en svår matris som te.
Introduction
Te är en av de mest konsumerade alkoholfria dryckerna i världen1,2. Te framställs av löv och knoppar av Woody perenna Camellia sinensis L. te plantor odlas i stora plantager och är mottagliga för många skade insekter3,4. Organophosphorus och neonikotinoid insekticider används ofta som systemiska insekticider5 för att skydda te plantor från skade djur som Whiteflies, Leaf Hoppers, och vissa fjärilsarter arter6,7. Efter applicering absorberas dessa insekticider eller translokaliseras till växten. Inom anläggningen kan dessa systemiska insekticider omvandlas genom hydrolys, oxidation eller Reduktions reaktioner av växtenzymer. Dessa omvandlings produkter kan vara mer polära och mindre giftiga än moder föreningarna. Men för vissa organofosater är bioaktiviteterna hos vissa produkter högre. Till exempel, acefat metaboliseras till den mer giftiga metamidofos8,9, och dimetoat till ometoat10,11. Växt metaboliska studier är därför viktiga för att bestämma ödet för ett bekämpnings medel inom en anläggning12.
Växt vävnads kulturer har visat sig vara en användbar plattform för undersökning av pesticider metabolism, med de identifierade metaboliterna liknar dem som finns i intakt växter13,14,15. Användningen av vävnads kulturer, särskilt cell SUS pensions kulturer, har flera fördelar. För det första kan experiment utföras fritt från mikroorganismer och på så sätt undvika inblandning av omvandling av bekämpnings medel eller nedbrytning av mikrober. För det andra, vävnads kulturen ger konsekvent material för användning när som helst. För det tredje, metaboliterna är lättare att extrahera från vävnads kulturer än från intakt växter, och vävnads kulturer har ofta färre interring föreningar och lägre komplexitet föreningar. Slutligen kan vävnads kulturer lättare användas för att jämföra en rad bekämpnings medels metabolism i ett enda experiment16.
I denna studie, en cell SUS pension härrör från bladen av steril-odlade te plantlet var framgångs rikt etablerat. Te cell SUS pensionen kulturen användes sedan för att jämföra skingrande beteenden av sex systemiska insekticider.
Detta detaljerade protokoll är avsett att ge viss vägledning så att forskarna kan etablera en växt vävnad kultur plattform användbar för att studera den metaboliska öde xenobiotika i te.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tecallus kultur
Obs: sterila blad härrör från in vitro-odlade plantlet linjer först utvecklades i forskar gruppen17. Alla procedurer upp till avsnitt 5 utfördes i en steril laminär flödessluva, med undantag för kultur tiden i en inkubator.
- Justera pH-värdet för de två medierna (Murashige och Skoog [MS] basal medium och Gamborgs B5 Liquid medium) till 5,8 före autoklavering (121 ° c, 20 min).
- Skär längs den mellersta venen av ett sterilt blad med sax, och sedan dela upp varje halv i små bitar av ca 0,3 cm x 0,3 cm i en petriskål.
- Placera de sterila explantorna (de små blad bitarna) på MS-basmedia som innehåller växthormoner 2, 4-D (1,0 mg L-1) och KT (0,1 mg l-1). Sex exväxter kan placeras i en 300 mL-kolv som innehåller 100 mL MS-basala medier.
- Kultur ovanstående blad blad sticklingar vid en konstant temperatur på 25 ° c i mörkret. Efter 28 dagar, Välj den första generationen av inducerade förhårdnader och överföring till färsk kolv (en subkultur). Förvärva lös och splättat förhårdnader efter 3 − 4 subkulturer.
2. te cell SUS pension kultur
- Skär de kraftfulla, spär och lösa förhårdnader från det fasta mediet i små bitar (intervall här 0.5 − 2 mm) med hjälp av en steril kirurgisk blad under sterila förhållanden.
- Väg ca 3 g av de små bitarna av callus. Placera förhårdnader i en 150 ml kolv innehåll ande 20 ml B5 flytande Media kompletterat med 2, 4-D (1,0 mg l-1) och kt (0,1 mg l-1).
- Odla vätskan cell SUS pensionen vid en konstant temperatur (25 ± 1 ° c) i en skakinkubator vid 120 rpm i mörker.
- Efter 7 till 10 dagar av odling, ta bort kulturkolvar och låt dem stå i några minuter.
- Ta alla supernatanten som frö material för subkultur till färskt medium (subkultur förhållandet mellan SUS pension moder vätska till färskt medium varierade mellan 1:1 och 1:2). Ta bort utfällda, stora förhårdnader.
- Få den slutliga väl odlade cell SUS pensionen kultur efter 3 − 4 subkultur cykler av 28 dagar vardera.
3. triphenyl tetrazoliumklorid-analys av cellernas livs kraft
- Döda ett prov av levande celler vid 100 ° c i 10 min som en kontroll cell innan genomförbarheten färgning.
- Centrifugera all cell SUS pensions kultur i 8 min vid 6000 x g. Ta bort supernatanten innan du avbryter cellerna i 2,5 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert (pH 7,3) och skaka den i 1 min för hand.
- Tillsätt 2,5 mL av den 0,4% triphenyl tetrazoliumklorid (TTC) lösning och skaka för hand igen.
- Inkubera blandningen i 1 timme i en stående inkubator (30 ° c).
4. behandling och provtagning av te cell SUS pensions kulturer med insekticider
- Tillsätt en alikvot av 400 μL filtersteriliserad stam lösning (500 μg mL-1) av fyra neonikotinoider (tiamethoxam, acetamiprid, imidakloprid och imidaklothiz) eller två organiska fosfater (dimetoat och omethoat) i cell SUS pensions kulturer, Respektive.
Anmärkning: om målet är att jämföra xenobiotiska beteenden, använda samma moder parti av cell SUS pensioner att testa de olika föreningarna. - Odla proverna av cell SUS pensioner med insekticider vid konstant temperatur (25 ± 1 ° c) och skaka inkubator hastighet (120 rpm). Ta proverna (se steg 4,3 eller 4,4) på 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 och 75 dagar.
- För att testa ett prov som innehåller en neonikotinoid, ta bort en 1 mL alikvot av den homogena cell kulturen, placera den i ett 1,5 mL plastcentrifugrör och centrifugera vid 4000 x g i 2 min.
- Passera supernatanterna genom en 0,22-μm porstorlek filter membran före analys av högpresterande vätskekromatografi-ultraviolett (HPLC-UV) och ultra-hög prestanda vätskekromatografi-fyrpolig tid-av-flygning (UPLC-QTOF) massa spektrometri (material tabell).
- För att testa ett prov som innehåller ett organfosfat, avlägsna en 500 μL alikvot av cell kulturen och placera det i ett 35 mL centrifugrör eller ett 1,5 mL plaströr (Förbered det sistnämnda provet som neonikotinoid).
- Tillsätt 0,1 g natriumklorid och 5 mL aceton/etylacetat (3:7, v/v) i 35 mL centrifugerör av 500 μL prov.
- Vortex blandningarna i 1 min, och sedan låta dem vila i 10 min.
- Ta 2,5 mL av supernatanten till ett 10 mL glasrör och avdunsta till nästan torrhet med hjälp av en kväve för ångare vid 40 ° c.
- Lös upp återstoden med 1 mL aceton, virvel i 1 min, passera genom en 0,22-μm filter membran före analys med gaskromatografi-flamfoto metrisk detektor (GC-FPD).
5. prov beredning av intakt te växt med insekticider
Anmärkning: den intakt Tea Plant rättegången genomfördes i en hydroponiska system med hjälp av te plantor som odlas i 50 mL av en näringslösning (30 NH4+, 10 no3-, 3,1 PO4-, 40 K+, 20 ca2 +, 25 mg2 +, 0,35 FE2 +, 0,1 B 3 +, 1,0 mn2 +, 0,1 Zn2 +, 0,025 cu2 +, 0,05 Mo+och 10 Al3 +, i mg L-1)18. En experimentell växthus var under en ljus-mörk cykel (12 h av ljus och 12 h mörker) vid 20 ° c vid Anhui Agricultural University.
- Lägg fem plantor i en 4 L plastpott i 15 dagar.
- Tillsätt 0 ppm (kontroll) eller 100 ppm av tiamethoxam eller dimetoat i plast krukor, respectively.
- Förbered den intakta växt provet enligt den tidigare metoden, med undantag för för blöt läggning19, och sedan analysera med masspektrometri för en noggrann massa spektrum.
6. instrument analys
-
HPLC-analys av det metabola beteendet hos neonikotinoider
- Använd en HPLC-UV (material tabell) för att detektera innehåll och metaboliska produkter av tiamethoxam och acetamiprid vid en våglängd av 254 nm, och av imidakloprid och imidaklothiz vid 270 nm i prover från avsnitt 4,3.
Obs: HPLC-UV-tillståndet var detsamma som i föregående studie19.
- Använd en HPLC-UV (material tabell) för att detektera innehåll och metaboliska produkter av tiamethoxam och acetamiprid vid en våglängd av 254 nm, och av imidakloprid och imidaklothiz vid 270 nm i prover från avsnitt 4,3.
-
GC-analys av det metabola beteendet hos organofosater
- Identifiera innehållet i dimetoat och omethoat i prover från avsnitt 4,4 med en GC-FPD med hjälp av en kiral kolumn (tabell över material).
- Använd kväve som bärar gas och Ställ in flödes hastigheten på 1,0 mL min-1.
- Ställ in den initiala temperaturen till 120 ° c, och håll den i 5 min. öka temperaturen till 150 ° c vid 30 ° c min-1 och håll i 3 min. öka till 170 ° c vid 10 ° c min-1 och håll i 7 min. Slutligen öka till 210 ° c vid 30 ° c min-1 och sedan hålla i 5 min.
- Ställ in insprutnings temperaturen till 200 ° c i splitless läge; Ställ in detektor temperaturen på 250 ° c.
- Ställ in injektions volymen på 1 μL.
-
UPLC-QTAV analys av insekticid metaboliter i cell odling
- Detektera metaboliter av insekticider i cell odling (prover från avsnitt 4,3) med hjälp av UPLC-QTOF med en C18-kolonn (material tabell).
- Ställ in flödes hastigheten på 0,2 mL min-1. Ställ in injektions volymen på 10 μL.
- För de neonikotinoid-behandlade proverna, ställ den initiala mobila fasen till 85% A (5 mM ammoniumformiat vatten) och 15% B (acetonitril). Över 10 min, öka mobil fas B till 38% och återgå till 15% över 1 min, håll i 9 min.
- För de organofosminbehandlade proverna, ange den initiala mobila fasen till 55% A (0,1% myrsyra vatten) och 45% B (acetonitril). Över 5 min, öka mobil fas B till 70%, sedan tillbaka till 45% av B över 0,5 min, håll för 2,5 min.
- Ställ in QTOF Operations parametrarna enligt följande: gas temperatur, 325 ° c; tork gas (kväve), 10 L min-1; gas temperatur, 350 ° c; avgasflöde, 11 L min-1; kapillärspänning, 4000 V; munstycke spänning, 1000 V; fragmentorspänning, 100 V för neonikotinoid insekticider eller 110 V för organiska fosfor bekämpnings medel; skimmer spänning, 65 V; fungerar i positivt Jon läge.
- Ställ in instrumentet på hela skannings spektrumet och rikta MS/MS-läget.
- Bearbeta data med hjälp av korrekta Mass verktyg; Härleda metaboliterna utan standard produkter från MS/MS-annoteringen samt litteraturen12,15,20,21,22.
-
UPLC-Orbitrap analys av insekticid metaboliter i intakt växt extrakt
- Detektera metaboliter av insekticider i intakt växt extrakt med hjälp av UPLC-Orbitrap masspektrometri (material tabell).
- Ställ in drifts parametrarna för masspektrometri (material tabell) enligt följande: slidgastryck, 35 arb; gas temperatur, 300 ° c; munstycke spänning, 3,5 KV; kapillärtemperatur, 350 ° c.
- Ställ in elueringsprogrammen som ovan (steg 6.3.3 och 6.3.4) för UPLC-QTOF-analys av cell kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Induktion av förhårdnader från blad skördas från fält-odlade Tea trees och från bladen censurerade från te plantlets odlas in vitro i en steril miljö jämfördes genom att mäta kontaminering, Browning, och induktion efter 28 dagar av odling på MS media ( Figur 1a). Callus tillväxt noterades vid 20, 37, 62 och 90 dagar av kultur (figur 1b). Den förhårdnader som härrör från in vitro-odlade bladen visade mer kraftig tillväxt än vad förhårdnader härrör från fält-odlade blad under hela 90 dagar av odling. Förhårdnader från de sterila bladen var ljust gul, medan förhårdnader från fält-odlade bladen var brun (figur 1b).
Vid en koncentration av 1,0 mg L-1 av 2, 4-D23, var koncentrationen av kt optimerad. Vid 0,05 mg L-1 kt, den förhårdnader tillväxt takten var långsam, texturen var lite kompakt, och förhårdnader var vit i färg (figur 2C); vid 0,1 mg L-1 kt koncentration, den förhårdnader tillväxt takten var den högsta, upp till 61,5% (figur 2A), texturen var lös, och färgen var gulaktig (figur 2C); När kt ökades till 0,5 mg L-1, var förhårdnader kompakt och oregelbunden och brun i mitten (figur 2C). Efter att KT-koncentrationen valdes, studerades koncentrationen av 2, 4-D. Vid en kombination av 1 mg l-1 2, 4-D och 0,1 mg l-1 kt, den förhårdnader tillväxt takten var den högsta, nådde 46,9%, och utseendet på förhårdnader var den bästa (figur 2b,D).
Efter 2nd subkulturen på solid media, mer än hälften av ytan av varje censurerade blad täcktes av växande förhårdnader (figur 3a). Efter den 4: e subkulturen, var blad avsnitten helt täckt av callus. Efter den 5: e subkulturen, började förhårdnader konsistens att bli kompakt med några vita och bruna fläckar på botten.
När under kulturen cykeln var 21 dagar lång (figur 3b), den förhårdnader var kraftfull, men den största mängden tillväxt hade inte uppnåtts, vilket tyder på att täta subkultur skulle resultera i mindre förhårdnader belopp. När subkulturen cykeln var 28 dagar lång, hade förhårdnader vuxit kraftigt, var färgen gulaktig färg och texturen var lös. Efter 35 dagar började förhårdnader att bruna från centrum. Den förhårdnader var i värsta tillstånd, med en djup brun färg och inte längre växer, på 42 dagar.
Två typer av flytande Media jämfördes för deras effekter på tillväxten av förhårdnader och färgen på cell SUS pensionen (figur 4). Tre olika förhållanden av Moder vätska till den totala volymen av kultur vätska testades. Under de 75 dagarna av odling, cell tätheten successivt ökat i kulturer började på alla tre nyckeltal. Förhållandet mellan 15 g-celler i 40 mL färska medier (v/v) gav ett värde för optisk densitet (OD) betydligt högre än 4 g i 40 mL (v/v) och 6 g i 40 mL (v/v) (figur 5a). Efter 4 subkulturcykler av 28 dagar vardera, ett te cell SUS pension system framgångs rikt etablerat från sterila te förhårdnader i B5 flytande media (figur 6).
Figur 1 : Jämförelse av förhårdnader induktion från plockade blad och sterila plantlet blad. Ajämförelse av förhårdnader induktion från blad som skördats från Plantage-odlade te plantor och från blad som exciserats från sterila, in vitro-odlade plantlets. Explants observerades för kontaminering, Browning och induktion av callus. (B) jämförelse av förhårdnader tillväxt av löv som härrör från Plantage-odlade te plantor (set 1) och sterila in vitro-odlade plantlets (uppsättning 2): fotografier var på olika dagar: 20 (paneler a); 37 (b), 62 (c), och 90 (d). Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Tillväxt takten och tillväxt status av teblad härledd förhårdnader under olika växt hormon koncentrationer. Tillväxt takten (a) och tillväxt statusen (C) av kallblad som HÄRLETTS under olika kt-koncentrationer och 1 mg L-1 2, 4-D; Tillväxt takten (B) och tillväxt status (D) för förhårdnader under olika 2, 4-D koncentrationer och 0,5 mg L-1 kt. Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Callus-status efter olika antal subkulturcykler (a) och olika längder av subkulturcykler (B). Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Påverkan av olika media typer på förhårdnader tillväxt i flytande SUS pension kultur system. (A) B5-mediet. (B) MS medium. Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : De optiska densitetsvärdena och TTC-färgningen. A) värdet av cell SUS PENSIONEN i OD680 började vid olika förhållanden från 0 till 75 dagar. (B) den TTC-färgning av levande och kontroll celler. Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Processen att etablera en te cell SUS pension kultur vid konstant temperatur (25 ± 1 ° c) i en mörk inkubator. Steril kultur av te plantlets som källa av blad explant (a); Teblad inokulerade på MS-medium med 2, 4-D (1,0 mg L-1) och KT (0,1 mg l-1) (b); Initial odlade Valk efter 28 dagar (c); Callus lämplig för cell SUS pension efter 4 subkulturer cykler av 28 dagar vardera (d); De återstående stegen var vid samma temperatur men vid en konstant hastighet av 120 rpm i en skakinkubator: callus inokuleras till B5 medium för 7 till 10 dagar (e); Seedad cell SUS pension efter avlägsnande av fällda och stora förhårdnader (f); Subkulturen av cell SUS pension efter 1 cykel av 28 dagar (g); Mogen cell SUS pension efter 3-4 subkultur cykler av 28 dagar vardera (h). Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: metabolismen av 5 μg/ml 6 insekticider i te cell SUS pension kultur och i media (CK) inkuberas vid konstant temperatur (25 ± 1 ° c) och skakning inkubator hastighet (120 rpm) över 75 dagar. Tiamethoxan (a), imidakloprid (B), acetamiprid (C), imidaklothiz (D), dimetoat (E1) och omethoat (F); (E2) Produktion över tid av metaboliten av dimetoat (omethoate) som produceras i dimetoat-behandlad cell kultur och media. Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: totala jonkromatogram (TICs) av extrakten från obehandlad kontroll cell kultur, tiamethoxam-behandlad cell kultur, tiamethoxam-behandlade medier (cell-Free) efter 75 dagar. Toppar 1-5, 7 och 8 var metaboliter av tiametoxam och topp 6 var tiamethoxam (a); TICs av extrakten från dimetoat-behandlad cell kultur, dimetoat-behandlade medier (cell-Free), och obehandlade kontroll celler efter 60 dagar. Toppar 1 och 2 var metaboliter av dimetoat och Peak 3 var dimetoat (B); TICs av extrakten från tiamethoxam-behandlad (övre) och obehandlad (lägre) intakt växter (C); TICs av extrakten från dimetoat-behandlade (övre) och obehandlade (lägre) intakt växter (D); Metaboliten av dimetoat vid tR 1,86 min i intakta växter (D1); Inga föreningar detekterade vid tR 1,86 min i obehandlade växter (D2). Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: den sekundära masspektrometri som använder uplc-qtav toppar som härrör från kulturer som behandlats med (a) tiamethoxam och (B) dimetoat. Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 4: den sekundära masspektrometri med Q-exaktiv av toppar som härrör från intakt växt som behandlats med tiametoxam (a1, a2 och a3) och dimetoat (B1 och B2). Denna siffra har modifierats från Jiao et al.24. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel presenterar den detaljerade processen för att fastställa en modell av pesticider metabolism i te växt vävnad, inklusive val av explants, bestämning av cellernas livs kraft, och inrättandet av en te cell SUS pension kultur med hög metabolisk Aktivitet. Alla delar av en växt vävnad kan användas för att initiera förhårdnader i en steriliserad miljö25. Teblad valdes för förhårdnader initiering i denna studie, inte bara för att bladen tenderar att vara mindre förorenade än de delar under marken, men också för att de är den ätliga delen av grödan och det huvudsakliga målet för bekämpnings medel ansökan.
I denna studie jämfördes induktions frekvens och tillväxt status för förhårdnader från blad plockade från fältet och från blad censurerade från en steril plantlet odlas in vitro. De sterila bladen hade mycket lägre frekvens av Browning och kontaminering och en högre grad av induktion jämfört med fält-odlade blad. Detta berodde troligen på att löv från fältodlade plantor inte bara genomgick ytsterilisering med etanol och kvicksilver utan också en förändring i tillväxt miljön, medan sterila blad odlades i en steril miljö och kunde användas direkt utan ytterligare sterilisering. Dessutom, den förhårdnader härrör från in vitro-odlade, sterila plantlets visade mer kraftig tillväxt än den fältodlade bladen under 90 dagar av odling. Löv från sterila plantlets var mer lämpade för induktion av te förhårdnader, inte bara på grund av deras höga förhårdnader induktion och låg kontamination priser, men också på grund av den kortare pre-behandling tid och självständighet från säsongs mässiga faktorer.
Till kultur lös och splättat callus, de avgörande parametrarna, främst växt tillväxt regulator nivåer och längd och antal subkultur cykler, måste optimeras25. 2, 4-D kan effektivt främja förhårdnader induktion och tillväxt och är den mest använda hormonet i förhårdnader kultur26. Subkultur tider och subkultur cyklar längd är också viktiga för förhårdnader kultur25. Efter 2 till 4 subkulturer av 28 dagar av varje cykel, den förhårdnader hade en lös konsistens med en gulaktig färg och ingen Browning. Optimerings experimenten fastställde att det bästa förhårdnader-induktions protokollet var att placera löv plantor från sterila plantlets på MS-basmedia innehåll ande 1 mg l-1 2, 4-D och 0,1 mg l-1 kt och att överföra explant/förhårdnader var 28: de dag för en totalt 4 subkulturcykler. Detta protokoll inleddes lös och splättade förhårdnader som var lämplig för initiering av en cell SUS pension.
I växt vävnad kultur, det fasta mediet som används för förhårdnader tillväxt kan ofta användas för cell SUS pension kultur i en flytande form23. Te kommer till att vara stora mängder polyfenoler i MS basal medium som innehåller en hög koncentration av oorganiska salter, vilket resulterar i förhårdnader Browning27,28. I denna studie testades både flytande B5-media och MS-media. Den genomsnittliga tillväxt takten konstaterades ingen signifikant skillnad mellan de två kulturerna (16,66% i B5 basal media och 15,77% i MS basal Media; Figur 4). Dock var förhårdnader bruna i MS basal media. Så, B5 basal Media valdes i den föreslagna metoden.
Syre är viktigt att plantera cell tillväxt och metabolism. I flytande kultur, en överdriven volym av vätska kommer att minska syre koncentrationen och hämmar cell tillväxt, medan för lite vätska också hämmar cell tillväxt25. Flera proportioner av vätska till kolv volym (mL vätska: mL kolv) testades. Baserat på torrvikt av cell tillväxt efter 21 d, vätskan: Flask kvoterna rangordnade enligt följande: 30:150 > 40:150 > 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. I denna studie, 40 mL av odlings vätskan placerades i en 150 mL kolv (40 mL: 150 mL) valdes enligt hur cell SUS pensionen såg ut som observerats av blotta ögat.
Växt celler kan inte växa bra när cell tätheten är för hög eller för låg. Således påverkar andelen av Moder cell SUS pension kultur till färskt medium vid tiden för subkulturen tillväxtpotentialen i cellerna29. Denna studie använde OD-värdet av den homogena cell SUS pensions kulturen för att representera mängden cell tillväxt. Inympning med 15 g av fostrar flytande in i 40 mL av den sammanlagda volymen av kultur flytande (v/v) var passande för cell tillväxten. Subkulturförhållandet var lika med mellan 1:1 och 1:2 (SUS pension moder vätska: färskt medium).
Cell livs kraft inom te cell SUS pensionen kulturen testades av TTC färgning. Den färglös TTC föreningen kan omvandlas till den röda färgade formazan av dehydrogenaser i mitokondrierna av levande celler, men färgen kan inte ändras från döda celler (Figur 5b). Denna metod kontrollerade tillväxt status av cellerna i flytande kultur.
Inrättandet av en te cell SUS pension kultur ger en lätt in vitro forsknings plattform för att studera metabolism och metaboliter av olika bekämpnings medel. Oberoende av säsong och väder, cell SUS pension kulturer kan behandlas med olika bekämpnings medel, olika koncentrationer av aktiv ingrediens, och för olika längder av tid. De metaboliter som produceras i te cell SUS pension kulturer liknade dem som utvinns ur intakt växter (kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2). Intressant, sju metaboliter av tiamethoxam och två metaboliter av dimetoat upptäcktes i te cell SUS pension kultur, men endast två metaboliter av tiamethoxam och en för dimetoat i behandlade intakt växter (kompletterande figur 1, Kompletterande figur 2och kompletterande figur 3). Detta kan bero på den lättare extraktion från celler utan vaxliknande nagelband, färre föreningar från te störa masspektrometri resultat (matrisen effekt), eller den enklare metaboliten profil av te celler jämfört med hela växten.
Resultaten visade att tiamethoxam var mer lätt metaboliseras av te-cellen jämfört med de andra tre neonikotinoider (kompletterande figur 4). Båda de organofosfater (dimetoat och omethoate) metaboliserades snabbare än neonicotinoids. Dessa resultat visar mångfalden av metaboliska vägar och metabolisk reglering i tecellen, som behöver studeras ytterligare.
Genom att använda intakta växter för att studera insekticid metabolism och identifiera insekticid metaboliter uppvisar många svårigheter, inklusive hinder för absorption och långväga transport av både initial och nedbrytning föreningar inom anläggningen30. Cell SUS pension kulturer kunde inte bara lösa detta problem, men också minska matris inblandning i provet analys jämfört med extraktet från färska blad24. Denna forskning visade att te cell SUS pension kulturer är en effektiv plattform för att studera metabolismen av xenobiotiska föreningar i teplantan. Den kan serveras som ett sätt att studera metabolismen av xenobiotika i andra växter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den nationella centrala forsknings & utvecklingsprogram (2016YFD0200900) i Kina, Kinas nationella naturvetenskaplig grund (nr 31772076 och nr 31270728), Kina post doktor Science Foundation (2018M630700), och öppna fonden för Statliga viktiga laboratoriet för Tea Plant biologi och utnyttjande (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
