Summary
Ce travail présente un protocole pour établir une culture de suspension cellulaire dérivée de feuilles de thé(Camellia sinensis L.) qui peut être utilisée pour étudier le métabolisme des composés externes qui peuvent être pris par l'ensemble de la plante, tels que les insecticides.
Abstract
Une plate-forme pour étudier le métabolisme des insecticides à l'aide de tissus in vitro de la plante de thé a été développée. Les feuilles des plantulettes stériles de thé ont été induites pour former le callus lâche sur le média basal de Murashige et de Skoog (MS) avec les hormones végétales 2,4-dichlorophenoxyacetic acide (2,4-D, 1.0 mg L-1) et kinetin (KT, 0.1 mg L-1). Callus s'est formé après 3 ou 4 tours de sublituring, chacun d'une durée de 28 jours. Le callus lâche (environ 3 g) a ensuite été inoculé dans le support liquide B5 contenant les mêmes hormones végétales et a été cultivé dans un incubateur secouant (120 tr/min) dans l'obscurité à 25 à 1 oC. Après 3-4 sous-cultures, une suspension cellulaire dérivée de la feuille de thé a été établie à un rapport de sous-culture allant de 1:1 à 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais). À l'aide de cette plate-forme, six insecticides (5 g mL-1 chaque thiaméthoxam, imidaclopride, acétamipride, imidaclothiz, diméthoate et omethoate) ont été ajoutés dans la culture de suspension cellulaire dérivée des feuilles de thé. Le métabolisme des insecticides a été suivi à l'aide de chromatographie liquide et de chromatographie gazeuse. Pour valider l'utilité de la culture de suspension de cellules de thé, les métabolites du thiaméthoxan et du diméthoate présents dans les cultures cellulaires traitées et les plantes intactes ont été comparés utilisant la spectrométrie de masse. Dans les cultures traitées de cellules de thé, sept métabolites du thiaméthoxan et deux métabolites du diméthoate ont été trouvés, tandis que dans les usines intactes traitées, seulement deux métabolites du thiamethoxam et un de dimethoate ont été trouvés. L'utilisation d'une suspension cellulaire a simplifié l'analyse métabolique par rapport à l'utilisation de plantes de thé intactes, en particulier pour une matrice difficile comme le thé.
Introduction
Le thé est l'une des boissons non alcoolisées les plus consommées dans le monde1,2. Le thé est produit à partir des feuilles et des bourgeons de la forêt use use vivace Camellia sinensis L. Les plantes à thé sont cultivées dans de vastes plantations et sont sensibles à de nombreux insectes nuisibles3,4. Les insecticides organophosphorés et néonicotinoïdes sont souvent utilisés comme insecticides systémiques5 pour protéger les plants de thé contre les ravageurs tels que les mouches blanches, les larves de feuilles et certaines espèces de lépidoptères 6,7. Après l'application, ces insecticides sont absorbés ou translocalisés dans la plante. À l'intérieur de la plante, ces insecticides systémiques peuvent être transformés par hydrolyse, oxydation ou réactions de réduction par des enzymes végétales. Ces produits de transformation peuvent être plus polaires et moins toxiques que les composés parents. Cependant, pour certains organophosphates, les bioactivités de certains produits sont plus élevées. Par exemple, l'acéfate est métabolisé en methamidophos plus toxiques8,9, et le diméthoate en omethoate10,11. Les études métaboliques végétales sont donc importantes pour déterminer le sort d'un pesticide à l'intérieur d'une plante12.
Les cultures de tissus végétaux se sont avérées être une plate-forme utile pour étudier le métabolisme des pesticides, avec les métabolites identifiés similaires à ceux trouvés dans les plantes intactes13,14,15. L'utilisation des cultures tissulaires, en particulier les cultures de suspension cellulaire, présente plusieurs avantages. Tout d'abord, les expériences peuvent être menées sans micro-organismes, évitant ainsi l'interférence de la transformation ou de la dégradation des pesticides par les microbes. Deuxièmement, la culture tissulaire fournit des matériaux cohérents pour une utilisation à tout moment. Troisièmement, les métabolites sont plus faciles à extraire des cultures tissulaires que des plantes intactes, et les cultures tissulaires ont souvent moins de composés interring et une moindre complexité des composés. Enfin, les cultures tissulaires peuvent plus facilement être utilisées pour comparer une série de métabolisme des pesticides dans une seule expérience16.
Dans cette étude, une suspension de cellules dérivée des feuilles de la plante de thé stérile-cultivée a été avec succès établie. La culture de suspension de cellules de thé a été alors employée pour comparer les comportements de dissipation de six insecticides systémiques.
Ce protocole détaillé est destiné à fournir quelques conseils afin que les chercheurs puissent établir une plate-forme de culture de tissu végétal utile pour étudier le sort métabolique des xénobiotiques dans le thé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culture de callus de thé
REMARQUE : Les feuilles stériles ont été dérivées de lignées végétales cultivées in vitro développées pour la première fois dans le groupe de recherche17. Toutes les procédures jusqu'à la section 5 ont été effectuées dans une hotte d'écoulement laminaire stérile, à l'exception du temps de culture dans un incubateur.
- Ajuster le pH des deux supports (le milieu basal de Murashige et Skoog [MS] et le milieu liquide B5 de Gamborg) à 5,8 avant l'autoclatage (121 oC, 20 min).
- Couper le long de la veine moyenne d'une feuille stérile à l'aide de ciseaux, puis subdiviser chaque moitié en petits morceaux d'environ 0,3 cm x 0,3 cm dans un plat de Pétri.
- Placez les explants stériles (les petits morceaux de feuilles) sur le support basal MS contenant les hormones végétales 2,4-D (1,0 mg L-1) et KT (0,1 mg L-1). Six explants peuvent être placés dans un flacon de 300 ml contenant 100 ml de supports basaux MS.
- Culture les explants ci-dessus à une température constante de 25 oC dans l'obscurité. Après 28 jours, sélectionnez la première génération de calus induit et transférez-la en flacon frais (une sous-culture). Acquérir le calus lâche et friable après 3-4 sous-cultures.
2. Culture de suspension de cellules de thé
- Couper les callosités vigoureuses, friables et lâches du milieu solide en petits morceaux (gamme ici 0,5 à 2 mm) à l'aide d'une lame chirurgicale stérile dans des conditions stériles.
- Peser environ 3 g des petits morceaux de callus. Placez le callus dans un flacon de 150 ml contenant 20 ml de b5 de supports liquides complétés par 2,4-D (1,0 mg L-1) et KT (0,1 mg L-1).
- La culture de la suspension des cellules liquides à une température constante (25 à 1 oC) dans un incubateur secouant à 120 tr/min dans l'obscurité.
- Après 7 à 10 jours de culture, retirer les flacons de culture et les laisser reposer quelques minutes.
- Prenez tout le supernatant comme matière de graine pour la sous-culture à la moyenne fraîche (rapport de sous-culture du liquide de mère de suspension au moyen frais s'est compris entre 1:1 et 1:2). Retirez les grandes callosités précipitées.
- Obtenir la dernière culture de suspension cellulaire bien cultivée après des cycles de sous-culture de 28 jours chacun.
3. Triphenyl tetrazolium chlorure d'un soud de la viabilité cellulaire
- Tuer un échantillon de cellules vivantes à 100 oC pendant 10 minutes comme cellule témoin avant la coloration de la viabilité.
- Centrifuge toutes les cultures de suspension cellulaire pendant 8 min à 6000 x g. Retirez le supernatant avant de suspendre les cellules dans 2,5 mL de tampon salin (PBS) tampon tampon tampon tampon (pH 7.3) et secouez-le pendant 1 min à la main.
- Ajouter 2,5 ml de la solution de chlorure de tétrasolide de 0,4 % et secouer à nouveau à la main.
- Incuber le mélange pendant 1 h dans un incubateur debout (30 oC).
4. Traitement et échantillonnage des cultures de suspension de cellules de thé avec des insecticides
- Ajouter une aliquot de 400 l de solution de stock stérilisée par filtre (500 mL-1) de quatre néonicotinoïdes (thiamethoxam, acetamiprid, imidacloprid et imidaclothiz) ou deux organophosphates (dimethoate et omethoate) dans les cultures de suspension cellulaire, respectivement.
REMARQUE: Si le but est de comparer les comportements xénobiotiques, utilisez le même lot mère de suspensions cellulaires pour tester les différents composés. - Culture des échantillons de suspensions cellulaires avec des insecticides à température constante (25 à 1 oC) et en secouant la vitesse de l'incubateur (120 tr/min). Prenez les échantillons (voir l'étape 4.3 ou 4.4) sur 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 et 75 jours.
- Pour tester un échantillon contenant un néonicotinoïde, retirer un aliquot de 1 ml de la culture cellulaire homogène, le placer dans un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 ml et la centrifugeuse à 4000 x g pendant 2 min.
- Passer les supernatants à travers une membrane de filtre de la taille d'un porre de 0,22 m avant l'analyse par la masse de chromatographie liquide-ultravioletde (HPLC-UV) et de chromatographie liquide ultra-haute performance-quadrupole temps de vol (UPLC-QTOF) spectrométrie (Tableau des Matériaux).
- Pour tester un échantillon contenant un organophosphate, retirer un aliquot de 500 L de la culture cellulaire et placer dans un tube centrifugede de 35 ml ou un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 ml (préparer ce dernier échantillon comme celui des néonicotinoïdes).
- Ajouter 0,1 g de chlorure de sodium et 5 ml d'acétone/acétate d'éthyle (3:7, v/v) dans le tube centrifuge de 35 ml des 500 échantillons de ll.
- Vortex les mélanges pendant 1 min, puis laissez-les reposer pendant 10 min.
- Prendre 2,5 ml du supernatant dans un tube de verre de 10 ml et s'évaporer à la séchage à l'aide d'un évaporateur d'azote à 40 oC.
- Dissoudre le résidu avec 1 ml d'acétone, vortex pendant 1 min, le passer à travers une membrane de filtre de 0,22 m avant l'analyse par le détecteur photométrique de chromatographie-flamme de gaz (GC-FPD).
5. Préparation d'échantillon de plante de thé intacte avec des insecticides
REMARQUE : L'essai intact de plante de thé a été mené dans un système hydroponique utilisant des semis de thé cultivés dans 50 mL d'une solution nutritive (30 NH4, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K', 20 Ca2 ', 25 Mg2 ', 0.35 Fe 2', 0.1 B 3 ,1,0 Mn2 ,0,1 Zn 2,0,025 Cu2 ,0,05 Mo,et 10 Al3 ,en mg L-1)18. Une serre expérimentale était sous un cycle clair-obscurité (12 h de lumière et 12 h d'obscurité) à 20 oC à l'Université agricole d'Anhui.
- Mettre cinq plantes dans un pot en plastique de 4 L pendant 15 jours.
- Ajouter 0 ppm (contrôle) ou 100 ppm de thiaméthoxam ou diméthoate dans des pots en plastique, respectivement.
- Préparer l'échantillon de plante intact selon la méthode précédente, à l'exception de présoaking19, puis analyser avec spectrométrie de masse pour un spectre de masse précis.
6. Analyse des instruments
-
Analyse HPLC du comportement métabolique des néonicotinoïdes
- Utilisez un HPLC-UV (Tableau des Matériaux) pour détecter le contenu et les produits métaboliques du thiaméthoxam et de l'acétamipride à une longueur d'onde de 254 nm, et de l'imidaclopride et de l'imidaclothiz à 270 nm dans des échantillons de la section 4.3.
REMARQUE : L'état HPLC-UV était le même que l'étude précédente19.
- Utilisez un HPLC-UV (Tableau des Matériaux) pour détecter le contenu et les produits métaboliques du thiaméthoxam et de l'acétamipride à une longueur d'onde de 254 nm, et de l'imidaclopride et de l'imidaclothiz à 270 nm dans des échantillons de la section 4.3.
-
Analyse GC du comportement métabolique des organophosphates
- Détecter le contenu du diméthoate et de l'omethoate dans les échantillons de la section 4.4 par un GC-FPD à l'aide d'une colonne chirale (Tableau des matériaux).
- Utilisez l'azote comme gaz porteur et fixez le débit à 1,0 ml min-1.
- Fixez la température initiale à 120 oC et maintenez-la pendant 5 min. Augmenter la température à 150 oC à 30 oC min-1 et maintenir pendant 3 min. Augmenter à 170 oC à 10 min-1 et maintenir pendant 7 min. Enfin, augmentez jusqu'à 210 oC à 30 oC min-1, puis maintenez pendant 5 min.
- Définir la température d'injection à 200 oC en mode splitless; Définir la température du détecteur à 250 oC.
- Définir le volume d'injection à 1 L.
-
Analyse UPLC-QTOF des métabolites insecticides dans la culture cellulaire
- Détecter les métabolites des insecticides en culture cellulaire (échantillons de la section 4.3) à l'aide d'UPLC-QTOF avec une colonne C18 (Tableau des matériaux).
- Définir le débit à 0,2 ml min-1. Définir le volume d'injection à 10 L.
- Pour les échantillons traités aux néonicotinoïdes, fixez la phase mobile initiale à 85 % A (5 mM d'eau formatée d'ammonium) et à 15 % B (acétonitrile). Plus de 10 min, augmenter la phase b mobile à 38% et revenir à 15% sur 1 min, tenir pendant 9 min.
- Pour les échantillons traités par organophosphate, définir la phase mobile initiale à 55 % A (0,1 % d'eau acide formique) et à 45 % B (acétonitrile). Plus de 5 min, augmenter la phase mobile B à 70%, puis revenir à 45% de B sur 0,5 min, tenir pendant 2,5 min.
- Définir les paramètres d'exploitation QTOF comme suit : température du gaz, 325 oC; gaz de séchage (azote), 10 L min-1; température du gaz de gaine, 350 oC; flux de gaz de gaine, 11 L min-1; tension capillaire, 4000 V; tension de buse, 1000 V; tension fragmentaire, 100 V pour les insecticides néonicotinoïdes ou 110 V pour les insecticides organophosphorés; tension d'écumeur, 65 V; fonctionnant en mode ion positif.
- Fixez l'instrument sur le spectre complet de l'analyse et ciblez le mode MS/MS.
- Traiter les données à l'aide d'outils de masse précis; Inférer les métabolites sans produits standard de l'annotation MS / MS ainsi que la littérature12,15,20,21,22.
-
Analyse UPLC-Orbitrap des métabolites insecticides dans l'extrait végétal intact
- Détecter les métabolites d'insecticides dans l'extrait végétal intact à l'aide de la spectrométrie de masse UPLC-Orbitrap (Tableau des matériaux).
- Définir les paramètres d'exploitation de la spectrométrie de masse (tableau des matériaux)comme suit : pression de gaz de gaine, 35 arb; température du gaz, à 300 oC; tension de buse, 3.5 KV; température capillaire, 350 oC.
- Définir les programmes d'élution comme ci-dessus (étapes 6.3.3 et 6.3.4) pour l'analyse UPLC-QTOF de la culture cellulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'induction du calus à partir de feuilles récoltées dans des arbres à thé cultivés en campagne et à partir de feuilles extraites de plantlettes de thé cultivées in vitro dans un environnement stérile a été comparée en mesurant la contamination, le brunissement et l'induction après 28 jours de culture sur les milieux de La SP ( Figure 1A). La croissance de Callus a été enregistrée à 20, 37, 62 et 90 jours de culture (figure 1B). Le callus dérivé des feuilles cultivées in vitro a montré une croissance plus vigoureuse que le callus dérivé des feuilles cultivées sur le terrain pendant les 90 jours entiers de culture. Le callus des feuilles stériles était jaune vif, tandis que le callus des feuilles cultivées sur le terrain était brun (figure 1B).
À une concentration de 1,0 mg L-1 de 2,4-D23, la concentration de KT a été optimisée. À 0,05 mg L-1 KT, le taux de croissance du callus était lent, la texture était un peu compacte, et le callus était de couleur blanche (Figure 2C); à 0,1 mg L-1 KT de concentration, le taux de croissance du callus était le plus élevé, jusqu'à 61,5 % (figure2A), la texture était lâche, et la couleur était jaunâtre (Figure 2C); lorsque le KT a été augmenté à 0,5 mg L-1, le callus était compact et irrégulier et brun dans le centre (Figure 2C). Après que la concentration de KT ait été choisie, la concentration de 2,4-D a été plus approfondie étudiée. À une combinaison de 1 mg L-1 2,4-D et 0,1 mg L-1 KT, le taux de croissance du callus était le plus élevé, atteignant 46,9%, et l'apparition du callus était la meilleure (Figure 2B,D).
Après la sous-culture 2nd sur les supports solides, plus de la moitié de la surface de chaque feuille excisée a été recouverte par le calus croissant (figure 3A). Après la 4e sous-culture, les sections de feuilles ont été complètement couvertes par le calus. Après la sous-culture 5 e, la texture du calus a commencé à devenir compacte avec quelques taches blanches et brunes sur le fond.
Lorsque le cycle de sous-culture a duré 21 jours (figure3B), le callus était vigoureux, mais la plus grande quantité de croissance n'avait pas été atteinte, ce qui indique que la sous-culture fréquente se traduirait par moins de quantité de callus. Quand le cycle de sous-culture était de 28 jours, le callus avait grandi vigoureusement, la couleur était couleur jaunâtre et la texture était lâche. Après 35 jours, le calus a commencé à brunir à partir du centre. Le callus était dans le pire état, avec une couleur brun foncé et ne se développant plus, à 42 jours.
Deux types de supports liquides ont été comparés pour leurs effets sur la croissance du callus et la couleur de la suspension cellulaire (Figure 4). Trois rapports différents de liquide de mère au volume total de liquide de culture ont été examinés. Pendant les 75 jours de culture, la densité cellulaire a progressivement augmenté dans les cultures ont commencé à tous les trois rapports. Le rapport de 15 g de cellules dans 40 ml de supports frais (v/v) a donné une valeur de densité optique (OD) significativement supérieure à celle de 4 g en 40 mL (v/v) et de 6 g dans 40 ml (v/v) (figure 5A). Après 4 cycles de sous-culture de 28 jours chacun, un système de suspension de cellules de thé a été établi avec succès à partir du calus stérile de thé dans le support liquide de B5 (figure 6).
Figure 1 : Comparaison de l'induction du callus à partir de feuilles cueillies et de feuilles de planquet stériles. (A) Comparaison de l'induction du callus à partir de feuilles récoltées dans des plants de thé cultivés en plantation et de feuilles extraites de plantules stériles cultivées in vitro. Des explantations ont été observées pour la contamination, le brunissement et l'induction du callus. (B) Comparaison de la croissance du callus des feuilles dérivées des plants de thé cultivés en plantation (ensemble 1) et des plantules stériles cultivées in vitro (ensemble 2) : Les photographies étaient à des jours différents : 20 (panneaux a); 37 (b); 62 (c); et 90 (d). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le taux de croissance et l'état de croissance du callus dérivé de la feuille de thé sous différentes concentrations d'hormones végétales. Le taux de croissance (A) et le statut de croissance (C) du callus dérivé de la feuille de thé sous différentes concentrations de KT et 1 mg L-1 2,4-D; Le taux de croissance (B) et le statut de croissance (D) du callus sous différentes concentrations de 2,4-D et 0,5 mg L-1 KT. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Statut de Callus après différents nombres de cycles de sous-culture (A) et différentes longueurs de cycles de sous-culture (B). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Influence de différents types de médias sur la croissance du callus dans le système de culture de suspension liquide. (A) B5 moyen. (B) MS moyen. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Les valeurs de densité optique et la coloration TTC. (A) La valeur OD680 de la suspension cellulaire a commencé à des ratios différents de 0 à 75 jours; (B) La coloration TTC des cellules vivantes et de contrôle. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Processus d'établissement d'une culture de suspension de cellules de thé à température constante (25 '1 'C) dans un incubateur foncé. Culture stérile des plantlettes de thé comme source d'explantation de feuilles (a); Feuille de thé inoculée sur le milieu de la SP avec 2,4-D (1,0 mg L-1) et KT (0,1 mg L-1) (b); Calin cultivé initial après 28 jours (c); Callus adapté à la suspension cellulaire après 4 cycles de sous-culture de 28 jours chacun (d); Les étapes restantes étaient à la même température mais à une vitesse constante de 120 tr/min dans un incubateur secouant : Callus inoculé en milieu B5 pendant 7 à 10 jours (e); Suspension de cellules ensemoiraprès avoir enlevé le calus précipité et grand (f); La sous-culture de la suspension cellulaire après 1 cycle de 28 jours (g); Suspension de cellules matures après 3-4 cycles de sous-culture de 28 jours chacun (h). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1: Le métabolisme de 5 g/mL de 6 insecticides dans la culture de suspension des cellules de thé et dans les médias (CK) incubés à température constante (25 à 1 oC) et secouant la vitesse de l'incubateur (120 tr/min) sur 75 jours. Thiamethoxan (A), imidacloprid (B), acetamiprid (C), imidaclothiz (D), dimethoate (E1), et omethoate (F); (E2) Production au fil du temps du métabolite du diméthoate (omethoate) produit dans la culture cellulaire et les milieux traités au diméthoate. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2: Chromatogrammes ioniques totaux (TIC) des extraits de la culture cellulaire de contrôle non traitée, culture cellulaire traitée par le thiaméthoxam, média traité au thiaméthoxam (sans cellules) après 75 jours. Les pics 1-5, 7 et 8 étaient des métabolites de thiaméthoxam et le pic 6 était le thiaméthoxam (A); TICs des extraits de la culture cellulaire diméthoate-traitée, les médias diméthoate-traités (cellule-libre), et les cellules de commande non traitées après 60 jours. Les pics 1 et 2 étaient des métabolites de diméthoate et le pic 3 était diméthoate (B); TICs des extraits de thiamethoxam-traités (haut) et non traités (inférieur) plantes intactes (C); TICs des extraits de plantes intactes traitées au diméthoate (en haut) et non traitées (inférieures) (D); Le métabolite du diméthoate à tR 1,86 min dans les plantes intactes (D1); Aucun composé détecté à 1,86 min dans les plantes non traitées (D2). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 3: La spectrométrie de masse secondaire utilisant L'UPLC-QTOF de pics dérivés de cultures traitées avec (A) thiaméthoxam et (B) diméthoate. Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 4: Spectrométrie de masse secondaire utilisant Q-Exactive des pics dérivés de plantes intactes traitées avec le thiaméthoxam (A1, A2 et A3) et le diméthoate (B1 et B2). Ce chiffre a été modifié à partir de Jiao et al.24. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article présente le processus détaillé d'établir un modèle du métabolisme de pesticide dans le tissu de plante de thé, y compris la sélection des explants, la détermination de la viabilité de cellules, et l'établissement d'une culture de suspension de cellules de thé avec le métabolisme élevé activité. Toutes les parties d'un tissu végétal pourraient être utilisées pour initier le callus dans un environnement stérilisé25. Les feuilles de thé ont été choisies pour l'initiation du calus dans cette étude, non seulement parce que les feuilles ont tendance à être moins contaminées que les parties sous terre, mais aussi parce qu'elles sont la partie comestible de la culture et la cible principale de l'épandage de pesticides.
Dans cette étude, le taux d'induction et l'état de croissance du callus à partir de feuilles cueillies dans le champ et de feuilles excisées à partir d'une plantule stérile cultivée in vitro ont été comparés. Les feuilles stériles avaient des taux beaucoup plus faibles de brunissement et de contamination et un taux d'induction plus élevé que les feuilles cultivées sur le terrain. Cela s'explique probablement par le fait que les feuilles des plantes cultivées sur le terrain ont non seulement subi une stérilisation de surface à l'aide d'éthanol et de mercure, mais aussi un changement dans l'environnement de croissance, tandis que les feuilles stériles étaient cultivées dans un environnement stérile et pouvaient être utilisées directement sans stérilisation supplémentaire. En outre, le callus dérivé des plantules stériles cultivés in vitro a montré une croissance plus vigoureuse que les feuilles cultivées sur le terrain pendant les 90 jours de culture. Les feuilles des plantules stériles étaient plus appropriées pour l'induction du callus de thé, non seulement en raison de leur induction élevée de callus et des faibles taux de contamination, mais également en raison du temps plus court de pré-traitement et de l'indépendance des facteurs saisonniers.
Pour la culture du callus lâche et friable, les paramètres cruciaux, principalement les niveaux de régulateur de croissance des plantes et la longueur et le nombre de cycles de sous-culture, doivent être optimisés25. 2,4-D peut effectivement favoriser l'induction et la croissance de callus et est l'hormone la plus largement utilisée dans la culture de callus26. Les temps de sous-culture et la durée du cycle de sous-culture sont également importants pour la culture du callus25. Après 2 à 4 sous-cultures de 28 jours de chaque cycle, le calus avait une texture lâche avec une couleur jaunâtre et pas de brunissement. Les expériences d'optimisation ont déterminé que le meilleur protocole d'induction du callus était de placer des explants de feuilles à partir de plantules stériles sur des supports basaux MS contenant 1 mg L-1 2,4-D et 0,1 mg L-1 KT et de transférer l'explante/callus tous les 28 jours pendant un total de 4 cycles de sous-culture. Ce protocole a lancé le callus lâche et friable qui était approprié pour le déclenchement d'une suspension de cellule.
Dans la culture de tissu de plante, le milieu plein employé pour la croissance de callus peut souvent être employé pour la culture de suspension de cellules dans une forme liquide23. Alors que, le thé devient de grandes quantités de polyphénols dans le milieu basal MS contenant une forte concentration de sels inorganiques, résultant en le callus brunir27,28. Dans cette étude, les supports B5 liquides et les supports de SP ont tous deux été testés. Les taux de croissance moyens n'ont pas été trouvés de différence significative entre les deux cultures (16,66 % dans les médias basaux B5 et 15,77 % dans les médias basaux de La SP; Figure 4). Cependant, les callosités étaient brunes dans les médias basaux de la SP. Ainsi, les supports basal b5 ont été sélectionnés dans la méthode proposée.
L'oxygène est important pour la croissance et le métabolisme des cellules végétales. Dans la culture liquide, un volume excessif de liquide diminuera la concentration en oxygène et inhibera la croissance cellulaire, tandis que trop peu de liquide inhibe également la croissance cellulaire25. Plusieurs rapports de volume liquide/flacon (liquide mL : flacon mL) ont été testés. Basé sur le poids sec de la croissance cellulaire après 21 d, le liquide: ratios flaconclassés comme suit: 30:150 'gt; 40:150 'gt; 20:150, 50:150, 60:150 (mL: mL)23. Dans cette étude, 40 ml de liquide de culture ont été placés dans un flacon de 150 ml (40 ml : 150 ml) a été choisi en fonction de la façon dont la suspension cellulaire a été observée à l'œil nu.
Les cellules végétales ne peuvent pas bien se développer lorsque la densité cellulaire est trop élevée ou trop faible. Ainsi, la proportion de la culture de suspension de cellules mères au milieu frais au moment de la sous-culture affecte le potentiel de croissance des cellules29. Cette étude a utilisé la valeur OD de la culture homogène de suspension cellulaire pour représenter la quantité de croissance cellulaire. L'inoculation avec 15 g de liquide de mère dans 40 mL de volume total de liquide de culture (v/v) était appropriée pour la croissance de cellules. Le rapport de sous-culture était égal à entre 1:1 et 1:2 (suspension mère liquide: milieu frais).
La viabilité cellulaire dans la culture de suspension de cellules de thé a été testée par la coloration de TTC. Le composé incolore tTC peut être converti en formazan de couleur rouge par des déshydrogénases dans les mitochondries des cellules vivantes, mais la couleur ne peut pas être changée des cellules mortes (figure 5B). Cette méthode a vérifié l'état de croissance des cellules en culture liquide.
La mise en place d'une culture de suspension de cellules de thé fournit une plate-forme de recherche in vitro facile pour étudier le métabolisme et les métabolites de différents pesticides. Indépendamment de la saison et des conditions météorologiques, les cultures de suspension cellulaire peuvent être traitées avec différents pesticides, différentes concentrations d'ingrédientactif actif et pour différentes durées de temps. Les métabolites produits dans les cultures de suspension des cellules de thé étaient semblables à ceux extraits de plantes intactes (figuresupplémentaire 1 et figure supplémentaire 2). Fait intéressant, sept métabolites de thiaméthoxam et deux métabolites de diméthoate ont été détectés dans la culture de suspension de cellules de thé, mais seulement deux métabolites de thiaméthoxam et un pour le diméthoate dans les plantes intactes traitées (Figure supplémentaire 1, Figure supplémentaire 2, et Figure supplémentaire 3). Ceci peut être dû à l'extraction plus facile des cellules sans cuticule cireuse, moins de composés du thé interférant avec les résultats de spectrométrie de masse (l'effet de matrice), ou le profil plus simple de métabolite des cellules de thé comparées à la plante entière.
Les résultats ont montré que le thiaméthoxam était plus facilement métabolisé par la cellule de thé par rapport aux trois autres néonicotinoïdes (Figure supplémentaire 4). Les deux organophosphates (diméthoate et omethoate) ont été métabolisés plus rapidement que les néonicotinoïdes. Ces résultats montrent la diversité des voies métaboliques et de la régulation métabolique dans la cellule de thé, qui doivent être étudiées plus avant.
L'utilisation de plantes intactes pour étudier le métabolisme des insecticides et identifier les métabolites insecticides présente de nombreuses difficultés, y compris des obstacles à l'absorption et au transport à longue distance des composés initiaux et de dégradation à l'intérieur de la plante30. Les cultures de suspension cellulaire pourraient non seulement résoudre ce problème, mais aussi réduire l'interférence de matrice dans l'analyse d'échantillon comparée à l'extrait des feuilles fraîches24. Cette recherche a prouvé que les cultures de suspension de cellules de thé sont une plate-forme efficace pour étudier le métabolisme des composés xénobiotiques dans la plante de thé. Il peut être servi comme un mode d'étude du métabolisme des xénobiotiques dans d'autres plantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program (2016YFD0200900) de Chine, la National Natural Scientific Foundation of China (No. 31772076 et No. 31270728), China Postdoctoral Science Foundation (2018M630700), et Open Fund of State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization (SKLTOF20180111).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W.
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
