Summary
En protokoll presenteres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å syntetisere et sett av bakteriell biosensors for analyse av skudd rester, og for å teste funksjon av enhetene for tiltenkt bruk ved hjelp av fluorescens spektroskopi.
Abstract
MicRoboCop er en Biosensor som er designet for en unik anvendelse innen rettsmedisinske kjemi. MicRoboCop er et system bestående av tre enheter som, når de brukes sammen, kan indikere tilstedeværelsen av skudd rester (GSR) ved å produsere et fluorescens signal i nærvær av tre viktige analytter (antimon, bly, og organiske komponenter av GSR). Protokollen beskriver syntesen av biosensors ved hjelp av Escherichia coli (E. coli), og de analytiske kjemi metodene som brukes til å evaluere selektivitet og følsomheten til sensorene. Funksjonen til systemet er demonstrert ved hjelp av GSR innhentet fra innsiden av en brukt patron casing. En gang forberedt, det biosensors kan lagret til behøvde og kan brukes som test for disse nøkkel analytter. En positiv respons fra alle tre analytter gir en Presumptive positiv test for GSR, mens hver enkelt enhet har søknader om påvisning av analytter i andre prøver (f.eks. en detektor for bly forurensning i drikkevann). Den viktigste begrensningen av systemet er tiden det tar for et positivt signal; fremtidig arbeid kan innebære å studere forskjellige organismer for å optimalisere responstiden.
Introduction
En Biosensor er enhver analytisk enhet som bruker biologiske komponenter (som proteiner, nukleinsyre syrer, eller hele organismer) som produserer et svar som kan brukes for påvisning av en kjemisk substans eller analytt. Som et eksempel, kullgruveindustrien brukt en Biosensor for mye av de 20th århundre for å oppdage tilstedeværelsen av giftige gruve gasser: kanarifuglen i kull gruven1. Den biologiske organisme (Canary ' s) respons (død eller nød) til en kjemisk analytt (karbonmonoksid) ble observert av gruvearbeiderne for å beskytte arbeiderne. I et mer moderne og sofistikert eksempel, kan bakterier endres ved hjelp av syntetiske biologi teknikker for å svare på tilstedeværelsen av en viss kjemisk analytt ved å stille et bestemt svar, for eksempeluttrykk for et fluorescerende protein.
Syntetisk biologi er et bredt begrep som refererer til bygging av biologiske enheter og systemer som ikke eksisterer naturlig, eller re-design av eksisterende biologiske systemer for et bestemt formål2. Syntetisk biologi skilles fra genetisk engineering av en standard metodikk og eksistensen av standardiserte deler (standard syntetisk biologi genetiske elementer) som kan brukes til å syntetisere enheter og systemer. En del er innført i Genova av en enhet, en organisme som en bakterie, for å uttrykke en viss egenskap som vil tjene som en indikasjon på funksjon. For eksempel, i mange syntetiske enheter, er uttrykket av et fluorescerende protein innført i en enkelt encellede organisme som reporter protein. Flere enheter kan kombineres til et system. Genomer av mikroorganismer som bakterier er lett å manipulere på denne måten. Mange eksempler på biosensors som er spesifikke for et bredt spekter av kjemiske analytter har blitt rapportert i litteraturen i løpet av det siste tiåret3,4.
I dette arbeidet, MicRoboCop systemet er presentert som et eksempel på en Biosensor utformet ved hjelp av syntetiske biologi teknikker med romanen programmer i rettsmedisinske og miljøkjemi. MicRoboCop er et system av tre separate enheter som, kombinert, vil tillate Escherichia coli å uttrykke rødt fluorescerende PROTEIN (RFP) i nærvær av skudd rester (GSR) som er samlet inn fra en persons hender eller en overflate. Hver av de tre enhetene reagerer på en bestemt kjemisk analytt som er kjent for å være en komponent i GSR5. De tre analytter som systemet svarer er jeg. 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) og relaterte forbindelser, II. bly (i form av bly ioner), og III. antimon (også i form av ioner).
GSR består av mange forskjellige kjemiske stoffer, men de tre som vanligvis brukes til å identifisere en rest som GSR er barium, bly, og antimon5. Standard bevismessige test for identifisering av GSR er å bruke skanning elektron mikroskopi (SEM) med energi dispersive X-ray fluorescens (EDX)5. SEM-EDX lar analytikere å identifisere den unike morfologi og elementær komponenter av GSR. For tiden er det få mye brukt binære presumptive tester tilgjengelig. En nylig publisert presumptive test bruker ion-Mobility spektroskopi (IMS), som er spesialisert utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig i mange laboratorier6. Det er også noen farge "spot" tester som kan brukes, selv om de vanligvis brukes for avstand besluttsomhet eller for GSR identifikasjon på bullet hull og sår5. I tillegg har det vært en viss begrenset oppmerksomhet i litteraturen til elektrokjemiske tester for GSR som benytter voltammetric analyse, som har fordelen av potensielt være feltet bærbare, eller anodisk stripping voltammetri, som er en ekstremt følsom metode for metalliske elementer7. Det er svært lite omtale i litteraturen i biosensors designet spesielt for det formål å oppdage GSR, men noen biosensors for andre rettsmedisinske søknader har blitt publisert8.
De biologiske elementene for hver enhet i MicRoboCop-systemet, og plasmider konstruksjonen, er illustrert i figur 1. Den buede pilen i figur 1B representerer arrangøren regionen som er aktivert i nærvær av analytt, er den ovale ribosomal bindende nettsted som tillater oversettelse av reporteren protein, den grå boksen er merket RFP er genet som uttrykker rød fluorescerende protein, og den røde Octagon er transkripsjon oppsigelse området. Alle tre enhetene vil bli brukt sammen som et system for å oppdage GSR. Hver enhet med en bestemt promoter (SbRFP, PbRFP og TNT-RFP) vil bli inkubert med prøven som blir testet og fluorescens av RFP vil bli målt. RFP vil bare bli uttrykt hvis den aktuelle kjemiske analytt er til stede og aktiverer promoter regionen. Tre enheter som responderer på noen av de kjemiske stoffene som finnes i GSR, er utformet og presenteres i dette arbeidet.
Den arrangører som brukes i de tre MicRoboCop enhetene er en arsen og antimon følsom promoter, SbRFP, en bly følsom promoter, PbRFP11,12 og en TNT følsom promoter, TNT-RFP 13. fordi et søk i litteraturen avslørte ingen promoter utformet for å svare på barium, ble TNT arrangøren valgt i stedet siden denne arrangøren er følsom for en rekke strukturelt relaterte forbindelser (særlig 2, 4-dinitrotoluene og dinitrobenzene) som er kjent for å være en del av de organiske forbindelsene etterlatt i GSR. Denne arrangøren har med hell blitt brukt til å spesifikt oppdage minutt mengder TNT og 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) i begravd land gruver13. Ved å bruke de tre enhetene sammen som et system, vil en positiv test for GSR produsere fluorescens i alle tre enhetene. En fluorescens signal i bare én eller to enheter vil indikere en annen miljømessig kilde til analytt (e) eller i tilfelle av TNT arrangøren, aktivering av en forbindelse som ikke er en organisk sammensatt etterlatt i GSR. Ved å bruke alle tre enhetene sammen, er muligheten for et falskt positivt resultat på grunn av miljømessige kilder minimert. Blyfri ammunisjon, som er stadig i popularitet, representerer fortsatt bare ca 5% av ammunisjon salg i USA; Derfor, falske negative resultater på grunn av fravær av bly kan være en mulighet, men det er fortsatt verktøyet i en sensor som bruker bly som en markør for GSR14. I tillegg til dette spesifikke rettsmedisinske programmet, kan hver enhet brukes separat for å oppdage miljøgifter.
Protokollene som presenteres inkluderer syntetiske biologi teknikker som brukes til å lage enheter (sensor bakterier) og analytiske teknikker for å sjekke funksjonen til enhetene og analysere fluorescens signalene innhentet. Protokollen inkluderer også innsamling av rettsmedisinske bevis i form av hånden tørke for å samle GSR fra hendene på en mistenkt eller skure å samle GSR fra en overflate. Resultater fra bly sensor enheten presenteres som eksempel resultater, sammen med en demonstrasjon av en positiv test for GSR ved hjelp av en brukt patron casing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: syntese av E. coli uttrykke RFP presenteres.
1. utarbeidelse av plasmider DNA fra E. coli
- Tin e. coli som inneholder en plasmider med et RFP-gen og Ampicillin motstands gen og Øk e. coli på Luria buljong (LB) agar plater som inneholder 100 μg/ml Ampicillin ved 37 ° c i 24 timer. Bruk for eksempel J10060-plasmider fra registeret av standard biologiske deler som brukes til syntetisk biologi (se tabell over materialer). J10060 plasmider inkluderer et gen for RFP (rødt fluorescerende protein) under kontroll av en pBad promoter region og et Ampicillin motstands gen. Alternativt, transformere E. coli (se trinn 3,2) med plasmider før veksten på lb agar platene.
- Følg en standard miniprep protokoll (se tabell over materialer) for å isolere DNA fra 1 ml av en E. coli -kultur som inneholder J10060-plasmider. Formålet med følgende protokoll er å fjerne pBad promoter og erstatte den med ønsket promoter for enheten.
- Etter plasmider miniprep, Oppbevar DNA i fryseren til du er klar for fordøyelsen.
2. begrensning enzym fordøyelsen
- Sett opp følgende reaksjon i et mikrosentrifugen rør for EcoRI og NheI fordøyelse: 10 μL av J10060 plasmider DNA (isolert i trinn 1), 8 μL av vann, og 1 μL hver av EcoRI-og NheI-enzymer som er forhånds blandet med 1 μL buffer (se tabell over materialer).
- For arrangøren DNA, sette opp følgende reaksjon i et mikrosentrifugen rør for EcoRI og NheI fordøyelsen: 10 μL av glødet promoter DNA-sekvenser (8 μL av vann, og 1 μL hver av EcoRI og NheI enzymer pre-blandet med 1 μL av buffer.
- For SB-, PB-eller TNT-RFP (se tabell over materialer), oppløse oligonukleotider i buffer (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm kalium acetate), ruge i like molar konsentrasjoner, varme til 94 ° c i 2 min, og gradvis avkjøles ved romtemperatur).
- Bland prøvene ved å pipettering forsiktig opp og ned med pipette satt til 10 μL.
- Ruge for 30 min ved 37 ° c.
- Heat deaktivere enzymer ved 80 ° c i 5 min.
- Oppbevar det fordøyd DNA i fryseren til du er klar til neste trinn.
3. ligation og transformasjon
-
Ligation
- Ved hjelp av plasmider og promoter DNA som ble dobbelt fordøyd med EcoRI og NheI i trinn 2, satte du opp reaksjonsblandingen vist i tabell 1 i et mikrosentrifugen rør på isen; Tilsett T4 DNA Ligase sist.
Merk: tabell 1 viser en ligation ved hjelp av en molar ratio på 1:3 vektor for å sette inn for de indikerte DNA størrelser. - Bland reaksjonen forsiktig ved å pipettering opp og ned og mikrosentrifugen kort.
- Ruge ved romtemperatur i 10 min.
- Heat deaktivere ved 65 ° c i 10 min.
- Ved hjelp av plasmider og promoter DNA som ble dobbelt fordøyd med EcoRI og NheI i trinn 2, satte du opp reaksjonsblandingen vist i tabell 1 i et mikrosentrifugen rør på isen; Tilsett T4 DNA Ligase sist.
-
Transformasjon
- Tin et rør med 20 μL av DH5-Alpha kompetente E. coli -celler på isen til de siste iskrystallene forsvinner.
- Tilsett 5 μL av plasmider DNA i celle blandingen. Forsiktig flick røret 4-5 ganger for å blande celler og DNA.
- Plasser blandingen på isen i 2 min.
- Varme sjokk på nøyaktig 42 ° c for nøyaktig 30 s. Ikke bland.
- Plass på isen i 2 min. Ikke bland.
- Pipetter 380 μL av romtemperatur SOC inn i blandingen. Umiddelbart spres på en LB agar plate som inneholder Ampicillin (100 μg/mL) og ruge over natten ved 37 ° c.
- Sjekk platene innen 24 h for vekst.
- Forsegle platene med tetting film og oppbevar i kjøleskapet til klar for neste trinn.
4. kolonien PCR
- Legg til et PCR-rør (satt opp 4 reaksjons rør) reaksjonsblandinger vist i tabell 2.
- Bland reaksjonene forsiktig ved å pipettering opp og ned.
- Ved hjelp av en gul pipette spissen, skrape en koloni (eller svært liten region) av transformert E. coli. Overfør et sveip av denne E. coli til en ny lb/Ampicillin/agar plate som er delt av, og sett deretter pipette spissen inn i PCR røret. Rist pipette spissen for å blande E. coli med PCR mix. Gjenta tre ganger til for flere kolonier. Overfør PCR-rørene til en PCR-maskin og start thermocycling ved hjelp av programmet som er vist i tabell 3.
- Kjør gel elektroforese ved hjelp av en 2% agarose gel i TAE å avgjøre hvilke kolonier har de beste ligation inn i plasmider og dyrke de koloniene på en ny tallerken.
- Oppbevar platene i kjøleskapet til de er klare for testing. Forbered en flytende kultur i Luria buljong med 100 μg/mL Ampicillin tilsettes for kjemisk testing.
5. DNA-sekvensering
- Tilsett 5 μL av plasmider, 4 μL av sekvensering primer og 3 μL av deionisert vann for hver prøve.
- Plasser denne blandingen i et rør og sende den for DNA-sekvensering (se tabell over materialer).
- Analysere DNA sekvens data for å sammenligne forventet og observert DNA-sekvenser ved hjelp av DNA-sekvens analyseprogramvare for å sikre at det ikke er mutasjon og at genene ble riktig satt inn.
Merk: ved hjelp av E. coli som en kjemisk sensor er presentert nedenfor.
6. utarbeidelse av E. coli kulturer
- Forbered LB med 100 μg/mL Ampicillin for flytende kulturer.
- Forbered flytende kulturer av sensoren bakterier, positiv kontroll * bakterier og negativ kontroll * * bakterier.
Merk: * positiv kontroll bakterier: E. coli inneholder en PLASMIDER med RFP genet under kontroll av en konstituerende promoter; plasmider E1010 fra registeret av standard biologiske deler som brukes for syntetisk biologi (se tabell over materialer) ble brukt i dette arbeidet.
* * Negativ kontroll bakterier: E. coli inneholder en PLASMIDER med RFP genet under kontroll av en annen promoter, slik som pBad promoter (plasmider J10060 fra registeret av standard biologiske deler som brukes for syntetisk biologi (se tabell over Materialer)) eller en plasmider som ikke har RFP-genet. - Plasser kulturene i en risting inkubator ved 37 ° c og 220 RPM i minst 8 h, maksimalt 18 h. skyet kjøttkraft indikerer bakteriell vekst.
7. Titrating E. coli å sjekke funksjonen av enheten
Merk: Når sensorene er titrert for å sjekke funksjonen, trenger ikke dette trinnet å gjentas. En positiv kontroll i form av bly, antimon, og 2, 4-DNT eller 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNB) kan sjekke funksjonen til enhetene for hver bruk uten behov for full titrering.
- Forbered en lagerløsning av analytt (e) av interesse ved en konsentrasjon på 10 ppm i vann. Hvis løselighet er et problem, kan du bruke en 50/50 vann/metanol-blanding.
- Bruke Tabell 4 som en guide, etiketten riktig antall sterile kultur rør og sted 2 ml av kultivert kjøttkraft (fra protokoll trinn 6) i hvert rør.
Merk: for å fastslå en generell analytisk rekkevidde, gjør minst tre forskjellige nivåer av en analytt med sensor bakterier, ett nivå med negativ kontroll, og ett nivå med positiv kontroll. Det bør også være en tube av hver av bakteriene som ikke har tilsatt metall (en annen type negativ kontroll). Bruk et større utvalg av analytt konsentrasjoner for å finne analytisk rekkevidde og begrensninger for påvisning mer nøyaktig. - Legg analytt lagerløsning på rørene som inneholder 2 mL buljong som nevnt i Tabell 4, plasser smekk caps på kultur røret slik at de er løse (for å tillate luft strømme inn i røret), og Vortex kulturen røret.
- Hvis du lar smekk lokkene være løst på kultur rørene, legger du dem i en riste inkubator ved 220 RPM og 37 ° c i minst 24 timer.
- Fjern rørene fra inkubator, smekk caps på rørene tett, og oppbevar rørene i kjøleskapet til klar for fluorescens analyse.
8. Bruk av E. coli som kjemisk sensor for GSR
- Ved hjelp av en etanol-basert tørk designet for å fjerne bly (se tabell over materialer), tørk alle overflater av hendene, inkludert mellom fingrene. Bruk en separat tørke for hver hånd. Oppbevar våtservietter i en passende merket sealable baggie til analyse.
- For overflater som skal testes: Bruk en alkoholbasert tørke for store overflater eller en bomullspinne fuktet med etanol for små overflater.
Merk: for å demonstrere sensorene respons på GSR, innsiden av en brukt. 40 kaliber patron casing ble swabbed med en etanol fuktet bomullspinne. - Iført rene hansker og ved hjelp av saks som har blitt rengjort med alkohol, kuttet en ca 1 cm2 delen ut av midten av tørk.
- Plasser kuttet stykke av hånden tørk eller bomullsdott direkte inn i et kultur rør som inneholder 2 mL av sensoren bakterier, slik at det er nedsenket i kjøttkraft.
- Fortsett som beskrevet ovenfor i trinn 7,4 – 7,5.
9. fluorescens analyse ved hjelp av bærbare spektrometer (se tabell over materialer)
- Bruk en Vortex mikser til å riste rørene.
- Forbered spektrometer å samle fluorescens utslipp på riktig bølgelengde for RFP variant med en eksitasjon bølgelengde på 500 NM.
- Bruk Luria kjøttkraft til å spille inn et tomt spektrum.
- Overfør hver supernatanten forsiktig til et lavt volum Cuvette og samle inn utslipps intensiteten.
10. fluorescens analyse med 96-brønn plate leser (se tabell over materialer)
- Bruk en Vortex mikser til å riste rørene.
- Overfør 200 mL av suppen til en brønn i brønn platen. Record hvilke prøver gikk inn i hver brønn av platen.
- Definer fluorimeter for å samle inn utslipps intensiteten ved riktig bølgelengde for RFP-varianten.
11. data analyse
- Bruke signalet innhentet fra alle negative kontroller (RFP negative bakterier eller sensor bakterier uten analytt lagt), beregne en gjennomsnittlig fluorescens signal for bakgrunnen.
- Trekke den gjennomsnittlige bakgrunns signal fra hver fluorescens signal innhentet for sensor bakterier for å få en bakgrunn korrigert fluorescens intensitet.
- Anslå signal-til-støy (S/N) ratio ved å dele bakgrunnen korrigert fluorescens intensitet av gjennomsnittlig bakgrunns signal. Hvis S/N-forholdet er større enn 3, er testen positiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens Spectra for RFP-varianten som brukes i dette arbeidet, er vist i figur 2. Disse dataene er fra PbRFP enheten som den reagerer på bly og TNT-RFP enheten som den reagerer på to analytter, 2, 4-DNT og 1, 3-DNB. Denne illustrasjonen viser spekteret av en negativ kontroll (ingen analytt lagt til), og Spectra på to ulike nivåer av analytt lagt. Det maksimale fluorescens signalet for RFP-varianten som ble brukt ble observert ved 575 NM (eksitasjon bølgelengde 500 NM). Dataene i Figur 3 er representative for et enkelt titrering eksperiment (derav ingen feil barer er inkludert) av PbRFP enheten, titrert som i trinn 7 av protokollen. Figur 3a viser data som er samlet inn fra den bærbare spektrometer, mens figur 3b viser data som er samlet inn fra fluorimeter (fra samme sett med løsninger). Det er en generell trend med økende fluorescens som konsentrasjonen av metall øker. Det er verdt å merke seg at ved høye konsentrasjoner, større enn ca 800 ppb, faller responsen av på grunn av toksisitet av metallet på en så høy konsentrasjon. Dette maksimale respons nivået kan variere avhengig av hvilken analytt som brukes. Vårt tidligere arbeid med SbRFP viste at bakteriene kunne tåle høyere nivåer (i hvert fall opp til 1 000 ppb) av arsen og antimon10. Litteratur om nivåer av disse analytter samlet inn fra hånd servietter indikerer at disse nivåene av bly og antimon er konsistent med hva som kan samles inn fra en hånd serviett15. I tillegg viser resultatene som presenteres i Figur 4 at bakteriene kan tolerere mengder av analytter til stede i en patron veske uten celle død, som vil bli betydelig høyere enn det som er samlet inn fra en hånd serviett.
Ved hjelp av de beregnede S/N-verdiene for disse dataene, var det laveste nivået på kundeemnet 12 ppb (gjenkjennes som definert av en S/N-verdi større enn 3). I kontrast er S/N for den bærbare spektrometer data bare 2 på høyeste nivå testet. Imidlertid er trenden med økende fluorescens med økende analytt konsentrasjon fortsatt tydelig bemerket.
Figur 4a viser en positiv test for GSR. For å oppnå dette resultatet, ble etanol servietter samlet inn fra innsiden av en brukt. 40 kaliber patron casing og lagt til de tre sensor bakterier, som i trinn 8 av protokollen. Dette tallet viser også en positiv kontroll (bakterier som constitutively uttrykker RFP) og en negativ kontroll i form av SbRFP enheten uten analytt lagt. Kassetten tilfelle servietter ble brukt som proof-of-prinsippet resultater. I fremtidig arbeid, vil hånd servietter samles fra personer som er kjent for å ha avfyrt en pistol for å vise at sensorene er responsive til hånd servietter også.
| Komponent | 20 μL reaksjon |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | 2 μL |
| Plasmider DNA (3 KB) | 3 μL |
| Promoter DNA (0,7 KB) | 10 μL |
| Nuklease-fritt vann | 4 μL |
| T4 DNA Ligase | 1 μL |
Tabell 1. Reaksjons blanding for ligation, protokoll trinn 3.1.1.
| Komponent | 25 μL reaksjon |
| 10 μM forover primer | 0,5 μL |
| 10 μM omvendt primer | 0,5 μL |
| EnTaq 2X Master Mix | 12,5 μL |
| Nuklease-fritt vann | 11 μL |
Tabell 2. Reaksjonsblandinger for koloni PCR, protokoll trinn 4,1.
| Trinn | Temp | Tid |
| Første denaturering | 94 ° c | 30 s |
| 30 sykluser | 94 ° c | 30 s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| Endelig utvidelse | 68 ° c | 5 min |
| Holde | 4 ° c |
Tabell 3. PCR-thermocycling parametere for protokoll trinn 4,3.
| Tube-ID | Bakterier | Konsentrasjon av analytt løsning lagt (ppm) | Metal lagt | Volum av analytt løsning lagt til 2 000 μL buljong | [analytt], ppb |
| 1 | PbRFP | 10 | Pb | 2,5 for alle | 12 |
| 2 | PbRFP | 10 | Pb | 75 for alle | 361 for alle |
| 3 | PbRFP | 10 | Pb | 150 for alle | 698 for alle |
| 4 | PbRFP | 0 | Ingen | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 for alle |
| 6 | RFP POS | 10 | Pb | 10 | 50 for alle |
Tabell 4. Generelt eksperiment satt opp for titrering av biosensors, protokoll trinn 7,2.
Figur 1. Biologiske elementer av MicRoboCop enheter. (a) diagram over den generelle enheten for MicRoboCop i en plasmider med et Ampicillin motstands gen. (b) diagram for hver enhet som kombineres for å opprette MicRoboCop-systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fluorescens Spectra av PbRFP og TNT-RFP bakterier i nærvær og fravær av analytt. Data samlet inn på fluorimeter. (a) fluorescens Spectra av PbRFP bakterier i nærvær og fravær av analytt (Pb). (b) fluorescens SPECTRA av TNT-RFP bakterier i nærvær og fravær av to analytter (2, 4-DNT og 1, 3-DnB). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av det bærbare spektrometer systemet og fluorimeter for påvisning av fluorescens Spectra av PbRFP bakterier i nærvær og fravær av analytt (bly). (a) Lead titrering data for PbRFP sensor bakterier samlet på bærbart spektrometer system. (b) føre titrering data (samme prøver) for PbRFP sensor bakterier samlet på fluorimeter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Etanol pinner tatt fra innsiden av en. 40 kaliber brukt pistol kassetten for å vise responsen på de tre enhetene til GSR. S/N for alle signaler var større enn 3, noe som indikerer en positiv test for GSR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modifikasjoner og feilsøking
Eksperimentet beskrevet i Tabell 4 kan endres på en hvilken som helst måte som passer til sensorene som er utformet. Det viktigste aspektet ved en kjemisk sensor er å evaluere sin følsomhet og spesifisitet. Det er fordelaktig å sikre at et bredt spekter av konsentrasjoner av analytt analyseres for å fastslå den nyttige analytiske rekkevidden til sensoren. Det er også verdt å bestemme et maksimalt nivå av analytt for cellene. Fordi analytter som brukes i denne studien er giftige metaller (Pb og SB) eller organiske forbindelser i en metanol løsning (for TNT derivater), det er et øvre nivå der cellen død på grunn av toksisitet av analytt eller løsning vil skje (generelt høyere enn 500-1, 0 00 ppb for forsøkene gjennomført så langt).
Begrensninger av teknikken
Resultatene som presenteres i dette arbeidet er kvalitative i naturen, men er ment å demonstrere den kvantitative evnene til RFP modifisert E. coli. Følsomheten av sensoren kan variere betydelig mellom kultivert batcher avhengig av tettheten av cellene i suppen. Hvis kvantitative resultater er nødvendig, bør celle konsentrasjonen anslås ved å måle den optiske tettheten av de flytende kulturene før analysen. Hvis den optiske tettheten av kulturene bestemmes, så cellene kan fortynnes hensiktsmessig for å redusere variasjon mellom eksperimenter. Som en Presumptive test for ønsket analytter, men den kvalitative "nåværende/ikke tilstede" svar er akseptabelt for programmene diskutert her. Levetiden til cellene på agar platen bør også bemerkes-tidligere arbeid har indikert at platene kan lagres i kjøleskapet i opptil 2 uker, men enhetene fungerer ikke veldig bra mot slutten av den tidsrammen og utover.
En annen vurdering er valg av utstyr som brukes til å analysere fluorescens signalet. Ved hjelp av en spektrofotometer med en 96 brønn plate leser kan du velge nøyaktige eksitasjon-og utslipps bølgelengder, som øker følsomheten. Ved hjelp av dette systemet, kan resultatene av opp til 96 eksperimenter samles samtidig. RFP fluorescens kan også bli analysert ved hjelp av en bærbar spektrometer system. Portable instrumenter tillater vanligvis utvalgte eksitasjon band, som kan eller ikke kan falle sammen med eksitasjon Maxima av RFP varianten som brukes. Men så lenge eksitasjon bølgelengde er innenfor et rimelig utvalg av eksitasjon Maxima, vil det bærbare instrumentet generelt være brukbare (men med et tap i følsomhet). Kostnaden for den bærbare systemer er betydelig mindre enn forskningen karakteren spektrofotometer, og portabilitet kan sikkert være en fordel. Basert på den potensielle anvendelsen av bakterier, kan analytikeren bestemme om den ekstra kostnaden og tap av portabilitet med spektrofotometer systemet er berettiget.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
De tre-del MicRoboCop system beskrevet i dette arbeidet er ment å bli brukt som en kvalitativ, presumptive test for tilstedeværelsen av GSR. Foreløpig krever "gull standard" bevismessige test for GSR ekspert analyse av SEM-EDX. SEM-EDX utstyr er dyrt og vanligvis drives av høyt spesialiserte analytikere. I tillegg er GSR bevis svært variabel i rettsmedisinske saksbehandling og mange variabler bidra til deponering av GSR på hender og overflater16. En Presumptive test for GSR kan være nyttig for undersøkere som gir sannsynlige årsaken til et søk på person eller eiendom. Når sammenlignet med elektrokjemiske prøver eller prøver som ion transportabel spektroskopi, denne metoden tilbyder enkel, lett anvendelig instrumentering til hvilke høyst analytisk laboratorium burde ha adgang.
Andre programmer
Enhetene som er beskrevet i dette manuskriptet er utformet for å kombineres til et tre-delsystem for presumptive identifisering av GSR. Imidlertid, hver apparat inne det MicRoboCop system (SbRFP, PbRFP, og TNT-RFP) kanne likeledes bli brukt hver for seg å merker kjemikalie forurensning inne næringen, vann, eller miljømessig eksemplar. Tidligere arbeid har vist at TNT-RFP enheten kan brukes som en in situ sensor for land gruver13,17. Resultatene som presenteres her og i vårt tidligere arbeid10 har vist at SbRFP og PbRFP enheter kan oppdage konsentrasjoner lav nok til rivaliserende dyrere og sofistikert utstyr som Induktivt kombinert plasma Atomic utslipp spektroskopi ( ICP-AES) og Atomic absorpsjon spektroskopi (AAS). SbRFP-sensoren er følsom for arsen og antimon. Disse enhetene kan gi en rimelig alternativ for analyse av giftige heavy metal forurensning.
Den syntetiske biologi protokollen for å forberede E. coli presenteres her er aktuelt for alle systemer som bruker standard syntetisk biologi genetiske deler til å syntetisere E. COLI som uttrykker RFP. Den analytiske metoden gjelder for alle systemer som uttrykker RFP, og så kan brukes til å analysere eventuelle bakterielle Biosensor system som er opprettet ved hjelp av syntetiske biologi metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne studentene ved Longwood University i BIOL 324 (genetikk) og studentene i CHEM 403 (Advanced kjemisk Laboratory problem løsning) som var involvert i den første forberedelse og testing av antimon og bly biosensors. Ideen til MicRoboCop ble unnfanget ved GCAT SynBIO workshop (sommer 2014), som er finansiert av NSF og Howard Hughes Medical Institute og drives av University of Maryland Baltimore County. Forfatterne erkjenner også finansiering mottatt fra Longwood University ' s Cook-Cole College of Arts and Sciences og GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
- The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
