Summary
Um protocolo é apresentado usando técnicas de biologia sintética para sintetizar um conjunto de biossensores bacterianos para a análise de resíduo de pólvora, e para testar o funcionamento dos dispositivos para seu uso pretendido usando espectroscopia de fluorescência.
Abstract
MicRoboCop é um biosensor que foi projetado para uma aplicação única em química forense. O MicRoboCop é um sistema constituído por três dispositivos que, quando utilizados em conjunto, podem indicar a presença de resíduo de pólvora (GSR) produzindo um sinal de fluorescência na presença de três analitos-chave (antimônio, chumbo e componentes orgânicos da GSR). O protocolo descreve a síntese dos biossensores utilizando Escherichia coli (e. coli), e os métodos de química analítica utilizados para avaliar a seletividade e a sensibilidade dos sensores. O funcionamento do sistema é demonstrado usando GSR coletado do interior de uma carcaça gasta do cartucho. Uma vez preparados, os biossensores podem ser armazenados até que seja necessário e podem ser usados como um teste para esses principais analitos. Uma resposta positiva de todos os três analitos fornece um teste positivo presuntivo para o GSR, quando cada dispositivo individual tiver aplicações para detectar os analitos em outras amostras (por exemplo, um detetor para a contaminação da ligação na água bebendo). A principal limitação do sistema é o tempo necessário para um sinal positivo; trabalho futuro pode envolver o estudo de diferentes organismos para otimizar o tempo de resposta.
Introduction
Um biosensor é qualquer dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (tais como proteínas, ácidos nucleicos ou organismos inteiros) que produzem uma resposta que pode ser usada para a detecção de uma substância química ou analito. Como exemplo, a indústria de mineração de carvão usou um biosensor para grande parte do século 20 para detectar a presença de gases tóxicos da mina: o canário na mina de carvão1. A resposta do organismo biológico (canário) (morte ou angústia) a um analito químico (monóxido de carbono) foi observada pelos mineiros, a fim de proteger os trabalhadores. Em um exemplo mais moderno e sofisticado, as bactérias podem ser alteradas usando técnicas de biologia sintética para responder à presença de um determinado analisador químico, exibindo uma resposta específica, como a expressão de uma proteína fluorescente.
A biologia sintética é um termo amplo que se refere à construção de dispositivos e sistemas biológicos que não existem naturalmente, ou o redesenho de sistemas biológicos existentes para uma finalidade específica2. A biologia sintética distingue-se da engenharia genética por uma metodologia padrão e pela existência de peças padronizadas (elementos genéticos de biologia sintética padrão) que podem ser usadas para sintetizar dispositivos e sistemas. Uma parte é introduzida no genoma de um dispositivo, um organismo como uma bactéria, para expressar uma certa característica que servirá como uma indicação de função. Por exemplo, em muitos dispositivos sintéticos, a expressão de uma proteína fluorescente é introduzida em um único organismo unicelulares como uma proteína do repórter. Vários dispositivos podem ser combinados em um sistema. Os genomas dos micro-organismos tais como as bactérias são fáceis de manipular desta maneira. Vários exemplos de biosensores específicos para uma ampla gama de analisadores químicos têm sido relatados na literatura na última década3,4.
Neste trabalho, o sistema MicRoboCop é apresentado como um exemplo de um biosensor projetado usando técnicas de biologia sintética com novas aplicações em química forense e ambiental. MicRoboCop é um sistema de três dispositivos separados que, quando combinados, permitirão que Escherichia coli expresse a proteína vermelha fluorescente (RFP) na presença de resíduo de bala (GSR) que foi coletado das mãos de uma pessoa ou de uma superfície. Cada um dos três dispositivos responde a um analito químico específico que seja sabido para ser um componente de GSR5. Os três analitos aos quais o sistema responde são I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) e compostos relacionados, II. chumbo (sob a forma de íons de chumbo), e III. antimônio (também a forma de íons).
GSR consiste em muitas substâncias químicas diferentes, mas os três usados geralmente para identificar um resíduo como GSR são bário, ligação, e antimônio5. O teste probatório padrão para a identificação de GSR é usar a microscopia de elétron de exploração (sem) com fluorescência dispersiva da energia do raio X (EDX)5. O SEM-EDX permite que os analistas identifiquem a morfologia única e os componentes elementares da GSR. Atualmente, existem poucos testes presumptivos binários amplamente utilizados disponíveis. Um teste presuntivo recentemente publicado utiliza espectroscopia de mobilidade iônica (IMS), que é um equipamento especializado que pode não estar disponível em muitos laboratórios6. Há também alguns testes de cor "Spot" que podem ser usados, embora eles normalmente são usados para determinação de distância ou para identificação de GSR em buracos de bala e feridas5. Adicionalmente, tem havido alguma atenção limitada na literatura para testes eletroquímicos para GSR que empregam a análise voltamétrica, que tem a vantagem de ser potencialmente portátil de campo, ou voltametria de decapagem anódica, que é extremamente método sensível para elementos metálicos7. Há muito pouca menção na literatura de biossensores projetados especificamente para a finalidade de detectar GSR, embora alguns biossensores para outras aplicações forenses foram publicados8.
Os elementos biológicos para cada dispositivo no sistema MicRoboCop e a construção do plasmídeo são ilustrados na Figura 1. A seta curvada na Figura 1b representa a região promotora que é ativada na presença do analyte, o oval é o local de ligação ribossomal que permite a tradução da proteína do repórter, a caixa cinzenta rotulada RFP é o gene que expressa vermelho proteína fluorescente, e o octagon vermelho é o local da terminação da transcrição. Todos os três dispositivos serão usados juntos como um sistema para detectar GSR. Cada dispositivo com um promotor específico (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) será incubado com a amostra que está sendo testada e a fluorescência da RFP será medida. RFP só será expressado se o analisador químico apropriado está presente e ativa a região promotora. Três dispositivos que respondem a algumas das substâncias químicas presentes no GSR foram projetados e são apresentados neste trabalho.
Os promotores utilizados nos três dispositivos microbocop são um promotor sensível ao arsênico e antimônio, sbrfp9,10, um promotor sensível à chumbo, pbrfp11,12 e um promotor sensível TNT, TNT-RFP 13. porque uma busca na literatura não revelou nenhum promotor projetado responder ao bário, o promotor de TNT foi selecionado preferivelmente desde que este promotor é sensível a um número de compostos estruturalmente relacionados (em particular, 2,4-dinitrotoluene e dinitrobenzeno) que são conhecidos por ser uma parte dos compostos orgânicos deixados para trás em GSR. Este promotor foi usado com sucesso para detectar especificamente quantidades minuciosa de TNT e 2,4-dinitrotolueno (2,4-DNT) em minas terrestres enterradas13. Usando os três dispositivos juntos como um sistema, um teste positivo para GSR produzirá fluorescência em todos os três dispositivos. Um sinal de fluorescência em apenas um ou dois dispositivos indicará outra fonte ambiental da (s) analito ou no caso do promotor TNT, ativação por um composto que não é um composto orgânico deixado para trás em GSR. Ao utilizar todos os três dispositivos em conjunto, a possibilidade de resultados falsos positivos devido a fontes ambientais é minimizada. Munição sem chumbo, que está ganhando popularidade, ainda representa apenas cerca de 5% das vendas de munição nos Estados Unidos; daqui, os resultados falsos negativos devido à ausência de chumbo podem ser uma possibilidade mas há ainda uma utilidade em um sensor que use a ligação como um marcador para o GSR14. Além desta aplicação forense específica, cada dispositivo pode ser usado separadamente para fins de detecção de contaminantes ambientais.
Os protocolos apresentados incluem as técnicas de biologia sintética utilizadas para criar os dispositivos (bactérias do sensor) e as técnicas analíticas para verificar a função dos dispositivos e analisar os sinais de fluorescência obtidos. O protocolo também inclui a coleta de evidências forenses na forma de mão limpando para coletar GSR das mãos de um suspeito ou limpando para coletar GSR de uma superfície. Os resultados do dispositivo do sensor da ligação são apresentados como resultados do exemplo, junto com uma demonstração de um teste positivo para o GSR usando uma carcaça gasta do cartucho.
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Protocol
Nota: a síntese de E. coli expressando RFP é apresentada.
1. preparação do DNA plasmídeo de E. coli
- Thaw e. coli contendo um plasmídeo com um gene RFP e Gene de resistência ampicilina e crescer o e. coli em placas de agar de caldo de Luria (lb) contendo 100 μg/mL ampicilina a 37 ° c por 24 h. Por exemplo, use o plasmídeo J10060 do registro de peças biológicas padrão usadas para a biologia sintética (ver tabela de materiais). O plasmídeo J10060 inclui um gene para RFP (proteína fluorescente vermelha) o controle de uma região do promotor de pBad e de um gene da resistência da ampicilina. Alternativamente, transforme E. coli (refira a etapa 3,2) com o plasmídeo antes do crescimento nas placas do agar da libra.
- Siga um protocolo padrão de miniprep (veja tabela de materiais) para isolar o DNA de 1 ml de uma cultura de E. coli que contenha o plasmídeo J10060. O objetivo do seguinte protocolo é remover o promotor pBad e substituí-lo com o promotor desejado para o dispositivo.
- Após o miniprep plasmídeo, armazene o DNA no congelador até estar pronto para a digestão.
2. digestão da enzima da limitação
- Configurar a seguinte reação em um tubo de microcentrífuga para digestão EcoRI e NheI: 10 μL de DNA plasmídeo J10060 (isolado no passo 1), 8 μL de água e 1 μL de cada uma das enzimas EcoRI e NheI pré-misturadas com 1 μL de tampão (ver tabela de materiais).
- Para o DNA promotor, configurar a seguinte reação em um tubo de microcentrífuga para a digestão de EcoRI e de NheI: 10 μL de seqüências recozidas do ADN do promotor (8 μL da água, e 1 μL cada um de enzimas de EcoRI e de NheI pré-misturados com 1 μL do amortecedor.
- Para SB-, PB-, ou TNT-RFP (veja a tabela de materiais), dissolva os oligonucleotídeos no amortecedor (30 milímetros HEPES, pH 7,5; acetato do potássio de 100 milímetros), incubar em concentrações iguais do molar, aqueça a 94 ° c por 2 minutos, e esfrie gradualmente na temperatura ambiente).
- Misture as amostras introduzindo-as suavemente para cima e para baixo com a pipeta ajustada para 10 μL.
- Incubar durante 30 min a 37 ° c.
- O calor desativar as enzimas em 80 ° c por 5 minutos.
- Guarde o DNA digerido no congelador até estar pronto para o próximo passo.
3. ligadura e transformação
-
Ligadura
- Usando o plasmídeo e o DNA promotor que foram duplos digeridos com EcoRI e NheI na etapa 2, configurar a mistura de reação mostrada na tabela 1 em um tubo de microcentrífuga no gelo; Adicionar a ligase de DNA T4 por último.
Nota: a tabela 1 mostra uma ligadura usando uma razão molar de 1:3 vetor para inserir para os tamanhos de DNA indicados. - Misture suavemente a reacção introduzindo uma pipetagem para cima e para baixo e microcentrífuga brevemente.
- Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
- O calor desativar em 65 ° c por 10 minutos.
- Usando o plasmídeo e o DNA promotor que foram duplos digeridos com EcoRI e NheI na etapa 2, configurar a mistura de reação mostrada na tabela 1 em um tubo de microcentrífuga no gelo; Adicionar a ligase de DNA T4 por último.
-
Transformação
- Descongelar um tubo com 20 μL de DH5-Alpha células E. coli competentes no gelo até que os últimos cristais de gelo desapareçam.
- Adicionar 5 μL de DNA plasmídeo à mistura celular. Mexa com cuidado o tubo 4-5 vezes para misturar as células e o DNA.
- Coloque a mistura no gelo durante 2 min.
- Choque térmico em exatamente 42 ° c para exatamente 30 s. Não misture.
- Coloque no gelo por 2 min. Não misture.
- Pipetando 380 μL de temperatura ambiente SOC na mistura. Espalhe imediatamente sobre uma placa de agar LB contendo ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante a noite a 37 ° c.
- Verifique as placas dentro de 24 h para o crescimento.
- Sele as placas com película de selagem e armazene no refrigerador até pronto para a etapa seguinte.
4. PCR da colônia
- Adicionar a um tubo de PCR (configurar 4 tubos de reação) as misturas de reação mostradas na tabela 2.
- Misture suavemente as reacções introduzindo pipetagem para cima e para baixo.
- Usando uma ponta amarela da pipeta, raspe uma colônia (ou uma região muito pequena) do E. colitransformado. Transfira um furto deste E. coli em uma placa nova de lb/Ampicillin/Agar que seja seccionada fora, e introduza então a ponta da pipeta no tubo do PCR. Agite a ponta da pipeta para misturar o E. coli com a mistura do PCR. Repita mais três vezes para colônias adicionais. Transfira os tubos do PCR a uma máquina do PCR e comece o termociclagem usando o programa mostrado na tabela 3.
- Funcione a electroforese do gel usando um gel do agarose de 2% em Tae para determinar que colônias têm a melhor ligadura no plasmídeo e crescem aquelas colônias em uma placa nova.
- Guarde as placas no frigorífico até estarem prontas para o teste. Prepare uma cultura líquida no caldo de Luria com 100 μg/mL de ampicilina adicionada para testes químicos.
5. sequenciamento de DNA
- Para cada amostra, adicionar 5 μL de plasmídeo, 4 μL do primer de sequenciamento e 3 μL de água desionizada.
- Coloque esta mistura em um tubo e enviá-lo para o sequenciamento de DNA (ver tabela de materiais).
- Analise os dados da sequência de DNA para comparar as sequências de DNA esperadas e observadas usando o software de análise de sequência de DNA para garantir que não haja mutação e que os genes foram inseridos corretamente.
Nota: o uso de E. coli como sensor químico é apresentado abaixo.
6. preparação de culturas de E. coli
- Prepare LB com 100 μg/mL de ampicilina para culturas líquidas.
- Prepare culturas líquidas das bactérias do sensor, o controle positivo * bactérias e o controle negativo * * bactérias.
Nota: * bactérias de controle positivo: E. coli contendo um plasmídeo com o gene RFP controle de um promotor constitutivo; o plasmídeo E1010 do registro de peças biológicas padrão utilizadas para a biologia sintética (ver tabela de materiais) foi utilizado neste trabalho.
* * Bactérias de controle negativo: E. coli contendo um plasmídeo com o gene RFP controle de um promotor diferente, como o promotor de pbad (plasmídeo J10060 do registro de peças biológicas padrão usadas para a biologia sintética (ver tabela de Materiais)) ou um plasmídeo que não tenha o gene RFP. - Coloque as culturas em uma incubadora de agitação em 37 ° c e 220 rpm por um mínimo de 8 h, máximo de 18 h. caldo nublado indica crescimento bacteriano.
7. titular E. coli para verificar a função do dispositivo
Nota: uma vez que os sensores foram titulados para verificar a função, este passo não precisa ser repetido. Um controle positivo na forma de adição de chumbo, antimônio, e 2,4-DNT ou 1,3-dinitrobenzeno (1,3-DNB) pode verificar a função dos dispositivos para cada uso sem a necessidade de titulação completa.
- Prepare uma solução conservada em estoque do (s) analyte do interesse em uma concentração de 10 ppm na água. Se a solubilidade é um problema, use uma mistura de água/metanol 50/50.
- Usando a tabela 4 como guia, identifique o número apropriado de tubos de cultura estéreis e coloque 2 ml do caldo cultivado (do passo 6 do protocolo) em cada tubo.
Nota: a fim determinar uma escala analítica geral, faça pelo menos três níveis diferentes de um analito com as bactérias do sensor, um nível com o controle negativo, e um nível com o controle positivo. Também deve haver um tubo de cada uma das bactérias que não tem metal adicionado (outro tipo de controle negativo). Para determinar com mais precisão a faixa analítica e os limites de detecção, use uma maior variedade de concentrações de analito. - Adicione a solução conservada em estoque do analito aos tubos que contêm 2 ml do caldo de carne como observado na tabela 4, coloc os tampões de pressão no tubo de cultura de modo que estejam frouxos (para permitir o fluxo de ar no tubo), e Vortex o tubo da cultura.
- Deixando as tampas de encaixe frouxamente nos tubos da cultura, coloc em uma incubadora de agitação em 220 rpm e em 37 ° c por pelo menos 24 h.
- Retire os tubos da incubadora, encaixe os tampões nos tubos firmemente, e armazene os tubos no refrigerador até que esteja pronto para a análise da fluorescência.
8. usando E. coli como sensor químico para GSR
- Usando uma limpeza baseada em etanol projetada para remover chumbo (veja tabela de materiais), limpe todas as superfícies das mãos, incluindo entre os dedos. Use uma limpeza separada para cada mão. Armazene os toalhetes em um saquinho selável apropriadamente rotulado até a análise.
- Para superfícies a serem testadas: Use uma limpeza à base de álcool para superfícies grandes ou um cotonete umedecido com etanol para pequenas superfícies.
Nota: para demonstrar a resposta dos sensores ao GSR, o interior de um gasto. 40 cartucho do calibre do Caliber foi limpei com um cotonete umedecido etanol do algodão. - Vestindo luvas limpas e usando tesouras que foram limpas com álcool, corte uma seção de aproximadamente 1 cm2 fora do centro da limpeza.
- Coloque a parte cortada da limpeza da mão ou o cotonete diretamente em um tubo de cultura que contenha 2 mL das bactérias do sensor, assegurando-se de que esteja submergido no caldo de carne.
- Proceda conforme descrito acima nas etapas 7,4 – 7,5.
9. análise de fluorescência usando espectrómetro portátil (ver tabela de materiais)
- Use um misturador vórtice para agitar os tubos.
- Prepare o espectrómetro para coletar a emissão da fluorescência no comprimento de onda apropriado para sua variação de RFP com um comprimento de onda da excitação de 500 nm.
- Use o caldo Luria para gravar um espectro em branco.
- Transfira cuidadosamente cada sobrenadante para uma cubeta de baixo volume e colete a intensidade da emissão.
10. análise da fluorescência usando o leitor da placa 96-well (veja a tabela de materiais)
- Use um misturador vórtice para agitar os tubos.
- Transferir 200 mL do caldo para um poço na placa de poço. Registre quais amostras foram em cada poço da placa.
- Configurar o fluorímetro para coletar a intensidade de emissão no comprimento de onda apropriado para a variante RFP.
11. análise dos dados
- Usando o sinal obtido de todos os controles negativos (bactérias negativas RFP ou bactérias do sensor sem o analito adicionado), calcule um sinal médio da fluorescência para o fundo.
- Subtrair o sinal de fundo médio de cada sinal de fluorescência obtido para as bactérias do sensor para obter uma intensidade de fluorescência corrigida de fundo.
- Estime a relação sinal-ruído (S/N) dividindo a intensidade de fluorescência corrigida pelo fundo pelo sinal de fundo médio. Se a relação S/N for maior que 3, o teste é positivo.
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Representative Results
Os espectros de fluorescência para a variante RFP utilizados neste trabalho são mostrados na Figura 2. Estes dados são do dispositivo de PbRFP enquanto responde à ligação e ao dispositivo de TNT-RFP enquanto responde a dois analytes, 2,4-DNT e 1,3-DNB. Esta figura mostra o espectro de um controle negativo (nenhum analito adicionado), e os espectros em dois níveis diferentes de analito adicionado. O sinal de fluorescência máximo para a variante RFP utilizado foi observado em 575 nm (comprimento de onda de excitação 500 nm). Os dados da Figura 3 são representativos de uma única experiência de titulação (portanto, não são incluídas barras de erro) do dispositivo PbRFP, tituladas como na etapa 7 do protocolo. A Figura 3a mostra os dados coletados do espectrómetro portátil, enquanto a Figura 3B mostra os dados coletados do fluorímetro (do mesmo conjunto de soluções). Há uma tendência geral de aumentar a fluorescência como a concentração de aumentos de metal. Vale a pena notar que em altas concentrações, maior do que cerca de 800 ppb, a resposta cai devido à toxicidade do metal em uma concentração tão alta. Este nível máximo de resposta pode variar consoante o analisador utilizado. Nosso trabalho anterior com o SbRFP mostrou que as bactérias podiam tolerar níveis mais elevados (pelo menos até 1.000 ppb) do arsênico e do antimónio10. A literatura sobre os níveis desses analitos coletados de cotonetes manuais indica que esses níveis de chumbo e antimônio são consistentes com o que pode ser coletado de um swab de mão15. Adicionalmente, os resultados apresentados na Figura 4 demonstram que as bactérias podem tolerar as quantidades de analitos presentes em um swab de caixa de cartucho sem morte celular, o que será significativamente maior do que o coletado de um swab de mão.
Usando os valores S/N calculados para esses dados, o menor nível de chumbo detectável foi 12 ppb (detectável como definido por um S/N maior que 3). Em contrapartida, o S/N para os dados do espectrómetro portátil é apenas 2 no nível mais alto testado. Entretanto, a tendência de aumentar a fluorescência com concentração crescente do analito é anotada ainda claramente.
A figura 4a mostra um teste positivo para GSR. Para obter este resultado, os cotonetes de etanol foram coletados a partir do interior de um gasto. 40 cartucho do calibre da carcaça e adicionado às três bactérias do sensor, como na etapa 8 do protocolo. Esta figura também mostra um controle positivo (bactérias que expressam constitutivamente RFP) e um controle negativo na forma do dispositivo SbRFP sem nenhum analisador adicionado. Os cotonetes do caso do cartucho foram usados como resultados da prova--princípio. No trabalho futuro, os cotonetes da mão serão recolhidos das pessoas que são conhecidas para ter disparado uma arma para mostrar que os sensores são responsivos aos cotonetes da mão também.
| Componente | 20 μL de reacção |
| Tampão da ligase do ADN de 10X T4 | 2 μL de |
| DNA plasmídeo (3 KB) | 3 μL de |
| Promotor DNA (0.7 KB) | 10 μL de |
| Água sem nuclease | 4 μL de |
| Ligase do ADN T4 | 1 μL de |
Tabela 1. Mistura da reação para a ligadura, etapa 3.1.1 do protocolo.
| Componente | 25 μL de reacção |
| Primer dianteiro de 10 μM | 0,5 μL |
| Primer reverso de 10 μM | 0,5 μL |
| Um mix masterTaq 2x | 12,5 μL |
| Água sem nuclease | 11 μL de |
Tabela 2. Misturas da reação para o PCR da colônia, etapa 4,1 do protocolo.
| Passo | Temp | Tempo |
| Desnaturação inicial | 94 ° c | 30 de s |
| 30 ciclos | 94 ° c | 30 de s |
| 55 ° c | 45 s | |
| 68 ° c | 60 s | |
| Extensão final | 68 ° c | 5 minutos |
| Segurar | 4 ° c |
Tabela 3. Parâmetros do termociclagem do PCR para a etapa 4,3 do protocolo.
| ID do tubo | Bactérias | Concentração de solução de analito adicionada (ppm) | Metal adicionado | Volume de solução de analito adicionado a 2.000 μL de caldo | [analyte], PPB |
| 1 | O PbRFP | 10 | Pb | 2,5 | 12 |
| 2 | O PbRFP | 10 | Pb | 75 | 361 |
| 3 | O PbRFP | 10 | Pb | 150 | 698 |
| 4 | O PbRFP | 0 | Nenhum | 0 | 0 |
| 5 | RFP neg | 10 | Pb | 10 | 50 |
| 6 | Pos RFP | 10 | Pb | 10 | 50 |
Tabela 4. Experimento geral configurado para titulação de biossensores, etapa de protocolo 7,2.
Figura 1. Elementos biológicos dos dispositivos MicRoboCop. (a) diagrama do dispositivo geral para MicRoboCop em um plasmídeo com um gene da resistência da ampicilina. (b) diagrama de cada dispositivo que é combinado para criar o sistema MicRoboCop. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Espectros de fluorescência de bactérias PbRFP e TNT-RFP na presença e ausência de analito. Dados coletados em fluorímetro. a) espectros de fluorescência de bactérias PbRFP na presença e ausência de analito (PB). (b) espectros de fluorescência de bactérias TNT-RFP na presença e ausência de dois analitos (2,4-dnt e 1,3-DnB). Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação do sistema portátil do espectrómetro e do fluorímetro para a deteção dos espectros da fluorescência de bactérias de pbrfp na presença e na ausência de analito (ligação). (a) dados de titulação de chumbo para as bactérias do sensor PbRFP coletadas no sistema de espectrómetro portátil. (b) dados de titulação de chumbo (mesmas amostras) para as bactérias do sensor PbRFP coletadas em fluorímetro. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Cotonetes de etanol retirados do interior de um calibre. 40 cartucho de pistola gasto para mostrar a resposta dos três dispositivos para GSR. S/N para todos os sinais foi maior que 3, indicando um teste positivo para GSR. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modificações e resolução de problemas
O experimento descrito na tabela 4 pode ser modificado de qualquer forma adequada aos sensores que foram projetados. O aspecto mais importante de um sensor químico é avaliar sua sensibilidade e especificidade. É benéfico assegurar-se de que uma escala larga das concentrações do analito esteja analisada para determinar a escala analítica útil do sensor. Também vale a pena determinar um nível máximo de analito para as células. Como os analitos utilizados neste estudo são metais tóxicos (PB e SB) ou compostos orgânicos em uma solução de metanol (para os derivados da TNT), há um nível superior no qual ocorrerá a morte celular devido à toxicidade do analito ou solução (geralmente maior que 500 – 1,0 00 ppb para os experimentos conduzidos até o momento).
Limitações da técnica
Os resultados apresentados neste trabalho são de natureza qualitativa, mas destinam-se a demonstrar as capacidades quantitativas da RFP modificada E. coli. A sensibilidade do sensor pode variar significativamente entre os lotes cultivados, dependendo da densidade das células do caldo. Se forem necessários resultados quantitativos, a concentração celular deve ser estimada medindo-se a densidade óptica das culturas líquidas antes da análise. Se a densidade óptica das culturas é determinada, então as células podem ser diluídas adequadamente para reduzir a variabilidade entre experimentos. Como um teste presuntivo para os analitos desejados, no entanto, a resposta qualitativa "presente/não presente" é aceitável para as aplicações discutidas aqui. A vida útil das células na placa de agar também deve ser notado-o trabalho anterior indicou que as placas podem ser armazenadas na geladeira por até 2 semanas, mas os dispositivos não funcionam muito bem para o final do período e além.
Outra consideração é a escolha do equipamento utilizado para analisar o sinal de fluorescência. Usando um espectrofotômetro da classe da pesquisa com um leitor da placa 96-well permite a seleção da excitação exata e dos comprimentos de onda da emissão, que podem aumentar a sensibilidade. Usando este sistema, os resultados de até 96 experimentos podem ser coletados simultaneamente. A fluorescência de RFP pode igualmente ser analisada usando um sistema portátil do espectrómetro. Instrumentos portáteis normalmente permitem bandas de excitação selecionadas, que podem ou não coincidir com a excitação Maxima da variante RFP que está sendo usada. Entretanto, contanto que o comprimento de onda da excitação estiver dentro de uma escala razoável do Maxima da excitação, o instrumento portátil será geralmente útil (embora com uma perda na sensibilidade). O custo dos sistemas portáteis é significativamente menor do que o Espectrofotômetro de grau de pesquisa, e a portabilidade pode certamente ser uma vantagem. Com base na aplicação potencial das bactérias, o analista pode decidir se o custo adicional e a perda de portabilidade com o sistema de espectrofotômetro é justificado.
Importância em relação aos métodos existentes
O sistema MicRoboCop de três partes descrito neste trabalho destina-se a ser utilizado como um teste qualitativo e presuntivo para a presença de GSR. Atualmente, o teste probatório "padrão ouro" para GSR requer análise de especialistas por sem-EDX. O equipamento SEM-EDX é caro e normalmente operado por analistas altamente especializados. Além disso, a evidência de GSR é altamente variável no casos forense e muitas variáveis contribuem para a deposição de GSR nas mãos e superfícies16. Um teste presuntivo para GSR pode ser útil aos investigadores como fornecendo a causa provável para uma busca da pessoa ou da propriedade. Quando comparados a testes eletroquímicos ou testes como a espectroscopia de mobilidade iônica, este método oferece instrumentação simples e prontamente disponível para a qual a maioria dos laboratórios analíticos deve ter acesso.
Outras aplicações
Os dispositivos descritos neste manuscrito são projetados para serem combinados em um sistema de três partes para a identificação presuntiva de GSR. No entanto, cada dispositivo no sistema MicRoboCop (SbRFP, PbRFP e TNT-RFP) também pode ser usado individualmente para detectar contaminação química em alimentos, água ou amostras ambientais. O trabalho anterior demonstrou que o dispositivo TNT-RFP pode ser usado como um sensor in situ para minas terrestres13,14. Os resultados apresentados aqui e em nosso trabalho anterior10 mostraram que os dispositivos Sbrfp e pbrfp podem detectar concentrações baixas o suficiente para rivalizar com equipamentos mais caros e sofisticados, como espectroscopia de emissão atômica de plasma indutivamente acoplado ( ICP-AES) e espectroscopia de absorção atômica (AAS). O sensor SbRFP é sensível ao arsênico, bem como ao antimônio. Estes dispositivos podem fornecer uma opção de baixo custo para análise de contaminação por metais pesados tóxicos.
O protocolo de biologia sintética para a preparação do e. coli aqui apresentado é aplicável a qualquer sistema que utilize peças genéticas de biologia sintética padrão para sintetizar E. coli que expressam RFP. O método analítico é aplicável a qualquer sistema que expresse RFP, e assim pode ser usado para analisar qualquer sistema de biosensor bacteriano que foi criado usando métodos de biologia sintética.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer os alunos da Universidade de Longwood em BIOL 324 (genética) e os alunos em CHEM 403 (Advanced Chemical laboratório resolução de problemas) que estiveram envolvidos na preparação inicial e testes dos biosensores de antimônio e chumbo. A idéia para MicRoboCop foi concebida no workshop GCAT SynBIO (verão 2014), que é financiado pela NSF e Howard Hughes Medical Institute e hospedado pela Universidade de Maryland Baltimore County. Os autores também reconhecem o financiamento recebido da escola de artes e Ciências Cook-Cole, da Universidade Longwood, e do GCAT SynBio Alumni Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
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