Summary
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ГИПЦ), полученные кишечными органоидами, предлагают захватывающие возможности моделирования кишечных заболеваний в пробирке. Мы демонстрируем дифференциацию ГИПК в кишечном органоиды (ИХОС), стимуляции этих Иос с цитокинов, и микроинъекции сальмонеллы typhimurium в просвет iHOS, что позволяет изучение эпителиального вторжения этого Патогена.
Abstract
Кишечная «органная» (iHO) система, в которой 3-D структуры представитель эпителиальной накладки человеческого кишечника могут быть произведены из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (Гипки) и поддерживается в культуре, предоставляет захватывающие возможности для облегчения Моделирование эпителиального ответа на кишечные инфекции. В естественных условиях, кишечные эпителиальные клетки (IECs) играют ключевую роль в регуляции кишечного гомеостаза и могут непосредственно препятствовать патогенов, хотя механизмы, с помощью которых это происходит, не в полной мере выяснены. Цитокинов интерлейкина-22 (IL-22) было показано, что играет важную роль в поддержании и защите кишечника эпителиального барьера, в том числе индуцировать высвобождение противомикробных пептидов и хемокинов в ответ на инфекцию.
Мы описываем дифференциацию здоровых управления гипс в ИХОС через добавление конкретных цитокинов комбинации их культурной среды до встраивания их в подвале мембраны матричных prointestinal системы культуры. После встраиваемых, Ихоа выращиваются в средствах массовой информации дополняется Ноггин, р-спонден-1, эпидермальный фактор роста (EGF), CHIR99021, простагландин Е2, и Y-27632 моногидрата дигидхлорида. Еженедельные переходы ручным нарушением ультраструктуры iHO приводят к образованию попувского ИХОС, с некоторыми экспонирование склепа/ворса структуры. Все Иос демонстрируют дифференцированный эпителий, состоящий из бокаловидных клеток, энтероэндокринных клеток, клеток Paneth, и поляризованных энтероцитов, которые могут быть подтверждены с помощью иммуноокрашивания для конкретных маркеров каждой ячейки подмножество, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и количественное ЦР (КЦР). Для моделирования инфекции, сальмонеллы энтерика серовар typhimurium SL1344 микровводят в просвет ИХОС и инкубировали для 90 min при температуре 37 ° c, и модифицированный гентамипин анализ защиты выполняется, чтобы определить уровни внутриклеточного бактериального вторжения. Некоторые Ихоа также предварительно обработаны рекомбинантной человеческой IL-22 (Рил-22) до заражения, чтобы установить, является ли этот цитокинов защищает от инфекции сальмонеллы .
Introduction
В последние годы исследования хост-патогена взаимодействий была повышена за счет развития "оргадоидных" моделей, в котором 3-D представлений кишечного эпителия могут быть произведены из различных прародителей. "Первичные" органоиды могут быть получены непосредственно из кишечных стволовых клеток, собранных из кишечной биопсии. Кроме того, кишечные органоиды могут быть получены из ГИПК. То же самое можно сказать о многочисленных тканях, с желудочным1, печень2, поджелудочной железы3,4, мозг5,6, легких7, и простаты8 органоиды используются многими исследователями для моделирования Болезни. Есть множество захватывающих приложений системы органаид, в том числе моделирование рака9 и наркотиков скрининга10, но здесь мы ориентируемся на использование ИХОС в качестве инфекции модели, с использованием S. энтерика серовар Тифимурум (с. Тифимуриум) в качестве образцового патогена и предварительной обработки с IL-22 в качестве терапии.
В этом исследовании, Игипс используется для создания iHO являются "Kolf2 ' iPSCs, созданный из здорового человека и доступны из индуцированной человека плюрипотентных стволовых клеток консорциум инициативы (Гипси, www.hipsci.org), Открытый доступ панель характеризуется линии ГИПЦ11. Одним из преимуществ использования гипс в качестве прародителей для органоидов является то, что в настоящее время обширные банки здоровых доноров iPSC линии доступны, а это означает, что результаты могут быть проверены в ряде клеточных линий с различным генетическим фоном. Кроме того, если исследователи захотят посмотреть на специфические полиморфизмы с единичными заболеваниями (СНПС), можно использовать РКРР/Cas9 для мутаций в здоровой клеточной линии, производя тем самым как мутантную линию, так и сохраняя изогенные контрольной линии для сравнения12. По нашему опыту, ИПК-производные кишечные органоиды крупнее по размеру, чем их первичные аналоги и более последовательны в культуре, что делает для менее технически сложных микроинъекции и потенциально позволяет более разнообразный спектр патогенов, чтобы быть Изучал. ИХОС может быть криогенно сохраненным, и мы распространял культуры iHOS на год для производства материала для экспериментов.
В естественных условиях, МСЭС играют ключевую роль в регуляции кишечного гомеостаза и могут непосредственно препятствовать патогенов, хотя механизмы, с помощью которых это происходит, не очень хорошо изучены. Цитокинов IL-22, как известно, роль в поддержании кишки эпителиального барьера13 и участвует в индукции и секреции противомикробных пептидов и хемокинов в ответ на инфекцию14. Он вырабатывается активированными т-клетками (в частности, Th17 клетками), а также естественными клетками киллера и связывается с гетеромеридированным рецептором, состоящим из IL-22R1 и IL-10R2 подразделений15. Рецептор для Ил-22 выражается basally на IECs, а это означает, что в модели IECS, можно предварительно лечить органоиды с Рхилем-22 просто его дополнением к культуре среды16. Одним из недостатков системы оргаоида является то, что ей не хватает связанного иммунного ответа, обычно поставляемые другими типами иммунных клеток; Однако, модели появляются, что попытка coculture органоиды с лимфоцитами кишечника, чтобы лучше представлять это17,18.
Использование микроинъекционной системы является ключом к моделированию инфекций в модели iHO, так как это позволяет прямую доставку патогенных микроорганизмов к апокальной поверхности эпителия, как это происходит в случае инфицирования в естественных условиях. Добавление фенола Красного для бактериального раствора, введенного в iHO, обозначает те, которые были инфицированы, таким образом избегая повторных инъекций того же самого iHO. Органоиды в качестве судов для моделирования инфекции растут в использовании, с патогенами, такими как хеликобактер пилори,19 Нуровирус,20 ротавируса,21 Шига токсин-продуцирующий кишечной палочки22, Криптоспоридиум23, и вирус Зика24 было показано, чтобы выжить и воспроизвести в рамках этих систем. Эта технология может быть применена к более широкому спектру патогенов, особенно для организмов, которые трудно культуры, такие как простейшие, или человека ограниченных патогенов, для того, чтобы получить прямую информацию о человеческом эпителиальной реакции на инфекцию.
Protocol
1. культивирование и пассаже индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Примечание: Все методы, описанные здесь, использовать коммерчески доступных человеческих клеточных линий. Все ткани культуры работы подробно описано ниже должно быть сделано в классе II Ламинар потока. iPSCs обычно поддерживается в среде культуры стволовых клеток (см. таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя, что позволяет без выходных культуру iPSCs. iPSCs может быть адаптирован из других систем культуры ИПЦ с относительной легкостью.
- Проход клетки как только колонии покрывают приблизительно 80%-90% из поверхности плиты.
- Подготовка пластин для прохода 1 ч до использования путем добавления vitronectin 10 мкг/мл разбавляют в фосфатно-буферном растворе Дульбекко (DPBS; без кальция [CA] или магния [MG]) в ткань-культуры обработанных пластин. Объемы покрытия зависят от размера пластины и могут быть найдены в инструкциях производителя. За это время, теплая культура стволовых клеток среднего до комнатной температуры (RT).
- Удалите средства от iPSCs, готовых к прохождению, и промойте ячейки 2x с помощью DPBS (без CA или mg).
- Добавить раствор ЭДТА (см. таблицу материалов) на пластины, убедившись, что вся поверхность покрыта и инкубировать на RT для 5-8 мин. Когда отверстия начинают появляться в центре колоний iPSC, аспирин и отбросить раствор ЭДТА.
- Добавьте среду стволовых клеток в скважины; выбить iPSCs, мягко Стиральная СМИ по поверхности пластины несколько раз. IPSCs являются устаревшими, как сгустки, а не одиночные клетки, поэтому убедитесь, что раствор ЭДТА не остается на слишком долго. Перемещение любых выбили iPSCs на 15 мл конической трубки.
- Аспоте vitronectin из плиты с покрытием и заменить его с культурой стволовых клеток среды. Инвертировать суспензию iPSC несколько раз, чтобы убедиться, что МНК не поселились в нижней части конической трубки, и добавить соответствующий объем подвески, чтобы дать 1:10 разбавления клеток на новой пластине. Коэффициенты разделения могут корректироваться в зависимости от темпов роста iPSC, которые могут варьироваться между линиями iPSC.
- Разметать пластины, чтобы разогнать ИППО над поверхностью и поместить его в инкубатор при температуре 37 ° c/5% CO2. Кормите iPSCs на следующий день после старения.
2. дифференциация от iPSCs к Хингуту
- В день 0, Сплит ИППО на 10 см ткань-культуры обработанное блюдо, предварительно покрытием с vitronectin как описано в шаге 1,2, в 10 мл культуры стволовых клеток, дополненные актив (10 нг/мл) + базовый фактор роста фиброзного (bFGF; 12 нг/мл). Добавить факторы роста к средствам массовой информации непосредственно перед использованием; сделать это во всех последующих шагах.
- В день 1, изменение средств массовой информации (10 мл стволовых клеток культуры среды с актив [10 нг/мл] + bFGF [12 нг/мл]).
- В день 2, начать дифференциацию путем изменения средств массовой информации до 10 мл стволовых клеток культуры среды дополнены следующими факторами роста: актив (100 нг/мл), bFGF (100 нг/мл), костный морфогенетический белок 4 (БМП-4; 10 нг/мл), фосфолиинозитол 3- ингибитор киназы LY294002 (10 мкм) и GSK3 ингибитор CHIR99021 (3 мкм).
- На 3-ем день измените средства массовой информации на 10 мл средней культуры стволовых клеток, дополненную актив (100 нг/мл), Бфбп (100 нг/мл), МП-4 (10 нг/мл) и LY294002 (10 мкм). Эндодермы спецификации индуцированных этого средства массовой информации должны привести к видимым изменениям в морфологии колонии iPSC в течение ближайших 24 ч.
- На 4-го дня, изменение средств массовой информации до 10 мл RPMI/B27 Media дополнено актив (100 нг/мл) и bFGF (100 нг/мл).
Примечание: RPMI/B27 Media содержит 500 mL из RPMI среды с дополнением L-глютамина (см. таблицу 1), 10 мл дополнения B27 (50x, сыворотка бесплатно) и 5 мл незаменимых аминокислот. Дополнительно: добавьте 5 мл пенициллина-стрептомицина (10 000 U/mL). Фильтр-стерилизовать перед использованием. - В день 5, измените СМИ до 10 мл RPMI/B-27 СМИ дополнены актив a (50 нг/мл).
- На 6 день, чтобы начать кучность задней эндодермы к задней части, изменить средства массовой информации до 10 мл RPMI/B27 СМИ дополнены CHIR99021 (6 мкм) + ретиноевой кислоты (3 мкм).
- В дни 7, 8и 9повторите шаг 2,7. Во время этих этапов видны видимые 3-D структуры заднего кишечника, покрывающие поверхность пластины.
- На 10 деньвстроить результирующий задний кишечник в матрице фундамента мембраны (см. таблицу материалов).
3. вложение Хингута в матрице фундамента мембраны
- Составляют iHO базы роста средств массовой информации (500 mL из среды развитых Дульбекко в модифицированной орла [ДМЭМ]/F12, 10 мл дополнения B27 [50x, сыворотка свободная], 5 мл дополнения NO2 [100X, сыворотка свободная], 5 мл 1 м 4-(2-гидрокезитил)-1-пипиазиненефоновая кислота (HEPES) и 5 мл незаменимые аминокислоты [100X]. Дополнительно: добавьте 5 мл пенициллина-стрептомицина [10 000 U/mL]; фильтр-стерилизовать перед использованием. См. таблицу 1).
-
Снимите носитель с плиты заднего и промойте пластинку 1x с помощью DPBS (без CA или mg). Добавить 5 мл раствора коллагеназы к пластине и инкубировать при температуре 37 ° c в течение 5 мин.
- Производить коллагеназы раствор путем добавления 500 мг коллагеназы IV порошка до 400 mL из передовых ДМЕМ/F12. После этого, добавить 100 мл сыворотки замены (см. таблицу материалов), 5 мл L-глютамина (200 mm), и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола, и вихревые раствор перемешать. Фильтр-стерилизовать раствор после полного растворения порошка коллагеназы.
Примечание: Это может храниться при температуре-20 ° c до 6 месяцев в небольших аликутс.
- Производить коллагеназы раствор путем добавления 500 мг коллагеназы IV порошка до 400 mL из передовых ДМЕМ/F12. После этого, добавить 100 мл сыворотки замены (см. таблицу материалов), 5 мл L-глютамина (200 mm), и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола, и вихревые раствор перемешать. Фильтр-стерилизовать раствор после полного растворения порошка коллагеназы.
- Инактивировать коллагеназы путем добавления 5 мл iHO базы роста средств массовой информации к пластине и соскрести клетки заднего ряда с помощью скребком ячейки, собирая подвески задних конечностей в 15 мл конической трубки.
- Центрифуга на 240 x g в течение 1 мин и пипетки от supernatant.
- Добавьте 10 мл носителя, разбить задний кишечник на более мелкие кусочки, аккуратно петтинг, и центрифуга снова на 95 x g в течение 1 мин.
- Вымойте клетки 2x в медиа базы роста iHO, повторяя шаг 3,5. Ресуспензируем клетки в небольшом объеме базового роста среды (~ 300 – 500 мкл) и добавьте около 100 мкл этого раствора в 1,5 мл матричной мембраны матрицы. Матрица должна оставаться на льду в течение этого времени, как он начнет укрепляться быстро RT.
-
Установите 24-хорошо пластины на плите нагреватель на 37 ° c и пятно из 60 мкл в один колодец из 24-хорошо пластины. Позвольте ему установить кратко и проверить плотность под микроскопом.
- При необходимости добавить больше заднего раствора к матрице базальной мембраны с шагом до достижения желаемой концентрации и обнаружить раствор в оставшихся скважинах.
- Инкубировать при температуре 37 ° c в течение 10 мин; Затем добавьте 800 мкл ихо базы роста СМИ, содержащие факторы роста для каждого колодца 24-хорошо пластины в следующих концентрациях (см. таблицу 1): 500 нг/мл р-спонден-1, 100 нг/мл Ноггин, 100 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 3 мкм CHIR99021, 2,5 мкм простагландин Е2, и 10 мкм Y-27632 моногидрата дигидхлорида (ингибитор ROCK).
-
Изменение iHO базы роста СМИ каждые 2-3 дней, или сразу же, если средства массовой информации начинает обесцвету. После первоначального посева в матрице базальной мембраны, позволяют Иос развиваться в течение 7 дней до расщепления их. В день 3 – 4, различные сферы должны быть видны в культуре.
- Для средств массовой информации изменения в одиночку, опустить Y-27632, как это требуется только при расщеплении/посев.
4. техническое обслуживание и прохождение Иос
- Чтобы позволить постепенное оттаивание, потушить необходимый объем фундамента матрицы мембраны в крытом ведре льда на 4 ° c на ночь, 24 ч до расщепления.
-
Удалите средства от Iхоа и замените его 500 мкл раствора для снятия клеток (см. таблицу материалов) на хорошо. Инкубировать при температуре 4 °C в течение 40 – 50 минут, после чего МИОС должен быть плавающим в растворе.
- Дополнительно: Используйте систему визуализации в капюшоне, чтобы выбрать только Иос с желаемой морфологии (см. таблицу материалов).
- Аккуратно пипетки iHO/Cell подъема решение подвеска в 15 мл конические трубы, стараясь не разбить Иос. Разрешить ИХОС, чтобы поселиться в течение 3-5 мин и удалить супернатант и одиночные клетки.
- Ресуспензируем в ИХОС в 5 мл среднего роста iHOS и пипетки их мягко мыть. Центрифуга на 95 x g для 2 мин.
- Настройка 24-хорошо пластины на плите нагреватель при температуре 37 ° c в капюшоне.
- Удалите супернатант и ресуспензируем ИХОС в ~ 300 – 500 мкл базовых средств роста, используя пипетку P1000, чтобы разбить Иос на более мелкие куски. Обратите внимание, что сила, которая должна быть применена будет варьироваться в зависимости от линии iHO и созревания состояния, так что начинайте осторожно, увеличивая силу, если требуется.
- Место ~ 100 мкл из Иос (объем зависит от плотности раствора) в 1,5 мл матрицы фундамента мембраны и пипетки кратко перемешать.
- Spot из 1 х 60 мкл из подвала мембраны матрицы в один колодец из 24-хорошо пластины, оставьте его закрепить за ~ 30 с, а затем проверить плотность под микроскопом. Если плотность слишком низкая, добавьте больше Иос в матрицу.
- Повторите шаг 4,8 до тех пор, пока не будет получена правильная плотность, а затем пятно из остальной матрицы в 24-хорошо пластины.
- Поместите его в инкубатор при температуре 37 ° c в течение 10 минут и затем наложи на него 800 мкл базового роста среды с факторами роста, как описано в шаге 3,7.
-
Для подготовки iHOs для эксперимента анализа вторжения (изложенным ниже), прохождение ИХОС 4-5 дней до эксперимента, как описано в шагах 4,1-4.10, но место 120 МКН матрицы ихо решение, сгенерированный в шаге 4,7 в 5 мм стеклянным дном микроинъекции блюд.
- Вместо того, чтобы оставлять подвеску iHO в капельке, как с обычным проходным возрастом, распределите капельку по дну тарелки, чтобы создать тонкий слой матрицы. Накройте его 2,5 мл базового роста среднего плюс факторы роста.
Примечание: Если антибиотики были использованы в среде культуры, то эти необходимо извлечь и заменить с неантибиотическими дополненные средства для экспериментов микроинъекций.
- Вместо того, чтобы оставлять подвеску iHO в капельке, как с обычным проходным возрастом, распределите капельку по дну тарелки, чтобы создать тонкий слой матрицы. Накройте его 2,5 мл базового роста среднего плюс факторы роста.
5. престикуляция ИХОС с Рхилем-22
- Аспирин средств массовой информации из ИХОС и заменить его на свежие базы роста средств массовой информации (которая не должна содержать антибиотики) 18 ч до вторжения анализа.
- Добавить Рил-22 к культуре СМИ к конечной концентрации 100 нг/мл.
6. микроинъекции ИХОС и внутриклеточного вторжения анализы
- В день перед экспериментом установите S. Typhimurium SL1344 культуры в 10 мл бульона Лурия-Бертани и инкубировать при температуре 37 ° c на ночь с встряхивания.
- В день эксперимента, если имеется микроскоп с закрытой тепловой камерой, включите его и дайте температуре достичь 37 ° c до начала анализа.
- Развести ночь бактериальных культур в DPBS (содержащие CA и Mg) к оптической плотности 2 на 600 Нм (OD600) и, затем, смешайте его 1:1 с фенолом красного.
- Загрузите блюдо microвпрыска, содержащее ИХОС на стадии микроскопа, снимите крышку и приведите в фокус Иос, готовые для начала инъекции.
- Включите инжектор и станции управления рукой на. Убедитесь, что инжектор настроен на давление 600 КНА и время инъекции 0,5 s. Если он не уже отступил от стадии микроскопа, поверните руку инъекции, чтобы убедиться, что это.
- Настройка 6 мкм дрель сверло наконечник, удалив упаковку и пластиковый цилиндр из иглы. Удалите головку сцепления с инъекционный рычаг.
- Загрузите наконечник сверла с 10 мкл инокулята, захватывая буровые наконечника мягко на его тупой конец. Поместите наконечник бурового наконечника в головку сцепления и прикрепи его к микроинъекционной руке.
-
Аккуратно переместите руку в положение так, чтобы игла находилась на 1 – 2 см выше микроинъекционного блюда. Используйте рычаг управления рукой, чтобы расположить кончик иглы в центре тарелки и опустить его, пока он не будет просто над поверхностью средств массовой информации.
- Программа управления рукой станции, чтобы вернуть иглу в этот момент после всех инъекций.
- Фокус микроскопа на ИХОС и выберите цель, чтобы придать. Позиция иглы чуть выше и справа от iHO будет введен и переместить иглу вниз и сбоку в iHO просвет.
- Нажмите кнопку впрыснуть на микроинжектор; фенола-окрашенных бактериальной смеси выйдет из иглы. Впрыснуть каждый iHO 3x. Впрыснуть по крайней мере 30 Iхос в состоянии.
Примечание: Из-за гетерогенности в размере и структуре iHO в рамках культуры необходимо вводить большое количество Иос для контроля за вариациями. - Когда все требуемые Ихоа вводятся, удалите пластину микроинъекции со сцены, замените крышку и Инкубируйте плиту при температуре 37 ° c в течение 90 мин.
- После 90 мин, аспирин роста средств массовой информации и заменить его 3 мл раствора ячейки подъема; инкубации при температуре 4 °C за 45 мин.
- Аккуратно переместите раствор ИХОС/Cell для подъема на коническую трубку 15 мл, содержащую 5 мл DPBS. Убедитесь в том, что все вводинных Иос были удалены из пластины (промыть пластины с 1 мл DPBS при необходимости). Центрифуга на 370 x g в течение 3 мин.
- Удалите супернатант и ресуспензируем в средства массовой информации базового роста, содержащие гентамипин в 0,1 мг/мл (добавьте 1 мл средств массовой информации; затем используйте пипетку P1000 ~ 50x, чтобы разбить ИХОС и добавить 4 мл дополнительных носителей).
- Инкубировать при температуре 37 ° c для 1 ч, чтобы убить внеклеточных бактерий.
- Центрифуга ИХОС на 370 x g в течение 3 мин и аспирин supernatant, оставляя как можно мало. Промойте ИХОС 1x с DPBS и центрифуги снова.
Примечание: Этот шаг удаляет гентаталин, что важно, так как любой оставшийся гентаталин может убить внутриклеточные бактерии после того, как клетки будут лизированы. - Ресуспензируем в 500 мкл лизиса буфер (см. таблицу материалов) и вручную отделить органоиды по пипеттинг ~ 50x. Оставьте эту смесь на 5 минут на RT.
- Серийно разбавляют получившийся раствор в 10 раз в DPBS для генерации 10-1, 10-2и 10-3 концентраций. Пипетка 3 х 20 мкл капель аккуратно и разбавленных растворов на предварительно подогреваемых LB агар пластин.
- Инкубировать на ночь при температуре 37 ° c и выполнить подсчет колоний и расчет колонии формирования единиц (CFU). Колонии рассчитывает будет отражать количество внутриклеточных бактерий, которые были освобождены во время процесса lysing ячейки.
7. Замораживание и восстановление клеток
Примечание: Как отмечалось ранее, возможно криогенно сохранить Иос и воссоздать их по желанию. Ниже приведены процессы замораживания и оттаивания.
- Выберите колодцы, которые вы хотите заморозить. Добавление ячейки подъема раствора к скважинами и инкубировать для 40-50 мин при температуре 4 ° c. ИХОС должен быть плавающим в растворе.
- Аккуратно пипетки Иос в 15 мл конической трубки и дать им возможность урегулировать. Удалите средства массовой информации и промойте Iхос 1x с базой роста средств массовой информации (без факторов роста).
-
Центрифуга на 95 x g для 2 мин, удалить supernatant, и заменить его на соответствующий объем ячейки замораживания среды (см. таблицу материалов; использование среды в соответствии с инструкциями производителя), декантинг Иос в криогенные флаконы.
- Храните флаконы в морозильной камере с-80 °C на ночь, чтобы обеспечить более постепенное замораживание; Затем перенесите их в хранилище жидкого азота.
-
Для воссоздания Ихоа, быстро размораживания криогенного флакона при температуре 37 ° с с использованием водяной/бисерного ванны; затем аккуратно пипетки его содержимое в 10 мл базового роста средств массовой информации (без факторов роста). Разрешить ИХОС для урегулирования и замены средств массовой информации с ~ 300 мкл свежего базового роста средств массовой информации.
- НЕ отделить ИХОС вручную. Добавьте Iхос в матрицу мембраны фундамента и тарелку их, как описано в разделе 3.
Representative Results
После начала процесса дифференциации, клетки должны пройти через стадию окончательного формирования эндодермы, а затем задний кишечник кучность до вложения в матрицу фундамента мембраны. Сфероиды образуют и культур с большим количеством загрязняющих материалов будет ясно в течение нескольких недель, как Иос Зрелые. Образец изображения дифференциации, вложения, и процесс проходки показаны на рисунке 1.
Установка системы микроинъекций, как показано на рисунке 2. ИХОС вводят микроинъекцию фенолом/бактериальным раствором и сохраняют свой красный цвет, что позволяет идентифицировать зараженные Иос для предотвращения повторяющихся инъекций. Подсчет покрытых внутриклеточных бактерий выполняется после модифицированного анализа гентамицинно защиты; пресляции с Рил-22 ограничивает S. Инфекция тифимуриум, при которой наблюдается меньшее количество внутриклеточных бактерий после лечения Рил-22 (рис. 3). Мы также регулярно обрабатываем зараженные Иос для иммуноокрашивания или ТЕА, чтобы облегчить визуализацию принимающих бактериальных взаимодействий (рис. 4).
Рисунок 1: направленная дифференциация ИППО на ИХОС. Репрезентативная последовательность дифференцировки от Ипмск до ИХОС, демонстрирующая наблюдаемые морфологические изменения и факторы роста, необходимые для изменения этих изменений. Окончательный эндодермы формируется на 4-м дне дифференциации, после воздействия на конкретные концентрации комбинаций актив а, FGF, БМП-4, LY294002 и CHIR99021. После 8 дней, кучность этого окончательного эндодермы с конкретными концентрациями CHIR99021 и ретиноевой кислоты приводит к образованию задних конечностей. Наблюдается поствложения, формирование сфероидов. После длительного проходного использования с помощью поддерживающего фундамента мембранной матрицы, наложенных со средним дополненным факторами пролиферации R-спонданом 1, Ноггин, EGF, CHIR99021, и простагландин Е2, сфероиды прогрессив в волнистую ИХОС. (Изображения были сделаны на 4X-10x увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2: микроинъекции ихо с с. Typhimurium. А) система микроинъекций (см. таблицу материалов) прилагается в экологической камере; Это позволяет инъекции Иос в контролируемой среде (37 ° c/5% CO2). B) бактериальный инокулям доставляется непосредственно в просвет iho с помощью микрокапилляра, прикрепленной к системе микроинъекций. (C) путем смешивания бактериальных инокуляр с фенолем, ясно, какие иоос были инфицированы, таким образом избегая дубликатов инъекций одного и того же iHOS. Изображения были взяты на 10 x увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3: Предварительная обработка Иос, выведенные из клеточной линии Kolf2 с рхил-22, ограничивает S. Typhimurium SL1344 вторжение в клетки эпителия кишечника. Для анализа гентамимина защиты, ИХОС лечили с 100 нг/мл Рхиля-22 18 ч до заражения, или не лечить, и инкубировали для 90 мин постинфекции. Данные являются средствами трех технических реплицирует для трех биологических реплицирует ± Рэм. Для тестирования значимости были использованы тесты Манн-Уитни у; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4: взаимодействие МСЭИ с с. Тифимуриум SL1344. Эти панели демонстрируют, что Иос вводится с с . Typhimurium SL1344 и инкубировали для 3 h, до фиксации и обработки для (A) иммунофлуоресценции или (B) просвечивающей электронной микроскопии. В панели а, бактерии видны в просвет iho и взаимодействующих с эпителия. Ядра окрашиваются 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндоле (DAPI) дилактата (синий), клеточных мембран с фалалидин (красный), и бактерии с ККА-1 (зеленый). Изображения взяты при 20x увеличении. Группа B демонстрирует три различных внутриклеточных процессингового пути сальмонеллы после вторжения; бактерии видны (а) в сальмонеллы-содержащие вакуол, (b) бесплатно в цитоплазме, и (с) проходит аутофагии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
| RPMI/B27 средний | |
| Компонент: | Сумма: |
| RPMI 1640 мультимедиа с добавкой глютамина | 500 мл |
| B27 сыворотка-бесплатная добавка 50x | 10 мл |
| iHO базовый рост среды | |
| Компонент: | Сумма: |
| Расширенный ДМЕ/F12 | 500 мл |
| B27 сыворотка-бесплатная добавка 50x | 10 мл |
| N сыворотки-бесплатная добавка 100X | 5 мл |
| HEPES 1 M | 5 мл |
| L-глютамин 200 mM | 5 мл |
| Факторы роста для среды базового роста iHO | |
| Компонент: | Сумма: |
| Рекомбинантный человек R-spondin1 | 500 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий Гногин | 100 нг/мл |
| Эпидермальный фактор роста (EGF) | 100 нг/мл |
| Простагландин Е2 | 2,5 мкм |
| CHIR99021 | 3 мкм |
| Y-27632 моногидрат дигидхлорид | 10 мкм |
Таблица 1: рецепты для СМИ.
Discussion
Этот протокол описывает дифференциацию ГИПК в Иос и их полезность в качестве модели для имитации кишечных инфекций. Ниже мы очертить критические шаги в протоколе и любые изменения или усовершенствования, которые мы сделали.
Этот протокол упрощает процесс дифференциации Игипс по сравнению с ранее опубликованной работой25. Ранее использованные методы требовали переноса ГИПК из других систем культуры ГИПЦ (например, питатель-зависимая ГИПЦ-культура) к химически определяемой среде – поливиниловому спирту (МЧР-PVA). Эта передача в МЧР-PVA обычно занимает 2 – 3 недели и требует ежедневного кормления гипс. Этот протокол также не был последовательно эффективным, при этом некоторые дифференциаций не было; Таким образом, мы тройной дифференцировки с использованием тех же факторов роста, но, начиная с ГИПК, выращенных в культуре стволовых клеток среды (а не МЧР-PVA) и замена МЧР-PVA с культурой стволовых клеток среды во время дифференциации дней 0-3. Это было успешным для пяти независимых линий ГИПЦ, которые были опробы до сих пор, что делает процесс дифференциации гораздо более быстрым и эффективным. Это также позволяет без выходных культивирования ГИПЦ до дифференциации, что позволяет большую гибкость в культуре ГИПЦ. iHO линии, производимые этим методом были фенотибированный для маркеров кишечного эпителия, как мы ранее описали для ГИПЦ линий Kolf2, Yemz1, и Lise116 и появляются фенотипо неотличимо от iхос производства с использованием предыдущего Протокол.
После посева, ИХОС требуется не менее 1 месяца рутинных проходов, с расщеплением каждые 4-7 дней для облегчения созревания. Обратите внимание, что будет некоторая вариация в развитии iHO в зависимости от используемой линии iPSC и плотности исходной культуры. В течение первых нескольких отрывков будут заметно загрязняющие клетки, которые не являются ИХОС. Они будут в конечном итоге умирают, оставив чистую культуру сферической и, примерно через 4 недели, будили ИХОС. Кроме того, система визуализации в капюшоне может использоваться для выбора и прохода только ИХОС с желаемой морфологией. Поскольку Иос созревают, они будут нуждаться в расщеплении каждые 6 – 7 дней, в зависимости от темпов роста и плотности. Если какой-либо из следующих произойти, ИХОС должны быть разделены до этого момента: светональных полостей ИХОС начинают заполнять с мертвыми клетками, матрицы фундамента мембраны начинает распадаться, ИХОС начинают расти из матрицы мембраны фундамента, или культура слишком плотной и средств массовой информации начинает идти желтый очень быстро.
Как только культура iHO установлена, если в любое время возникновение изменений Iхоа или различно чем предпологаемо, то (например, культуры остают сферически, rather than отпочковываясь), фенотипирование через иммуногистохимию и qPCR для маркеров клетки должно быть повторялись, чтобы убедиться, что дифференцирование типов клеток в пределах ИХОС (например, бокаловидных клеток, клеток Paneth) остается неизменным. Если ИХОС больше не дифференцируются, то они должны быть отброшены и передифференцированы или более ранний проход ИХОС должен быть разморожен и восстановлен. Если Иос перестанет различать, потенциальными причинами являются возраст культуры (если она составляет более 6 месяцев), активность факторов роста (убедитесь, что они воссозданы в соответствии с инструкциями производителей и хранятся замороженные в небольших аликотов, чтобы избежать Множественные циклы замораживания-оттаивания), слишком частые или насильственные проходы (в целом, проходное старение должно происходить только один раз в неделю, и если Iхос будут вручную разъединять слишком энергично на регулярной основе, они перестанут полностью дифференцироваться).
Мы установили через РНК секвенирования, что IL-22 стимуляции 18 ч до заражения upregulates противомикробных генов и тех, кто участвует в барьер обороны фенотипа. Перед использованием нового Ихсо для анализов, включающих в себя Рил-22 (или альтернативный цитокинов, если система используется для этого), желательно, чтобы проверить активность генов, известных как upregulated цитокинов (в случае IL-22 , мы использовали DUOX2 и LCN2) через КЦР после стимуляции iхос, чтобы обеспечить экспрессию рецептора и неповрежденными сигнализации. До первого использования IL-22, мы также проводили иммуногистохимию, чтобы определить местонахождение рецептора IL-22 на ИХОС, чтобы установить, что экспрессия IL-22 рецептора была базальной, что означает, что престикуляция может быть достигнута просто путем добавления Рхил-22 к культуре iHOS Средний. Однако, если рецептор в апономической выражается, этот протокол, возможно, придется адаптировать для доставки лигандов ачески.
Подводные камни относительно системы микроинъекций обычно связаны с деликатностью игл, необходимых для инъекции. Здесь, мы используем коммерчески доступные сверла советы с 6 мкм просвет. Можно вытащить иглы из стеклянных капилляров26 хотя это может быть менее равномерным, что приводит к протечек от кончика иглы или непоследовательных объемов вводится в ИХОС. Важно быть уверенным, что инъекция произошла в просвет iHO, который является одной из причин использования фенола красный как краситель; ИХОС будет заметно расширять и удерживать красный инокулят, что позволяет определенности, в отношении которой были введены Иос. Изредка иглы засоряют с обломками от стены iHO; Если это так, удалите наконечник иглы изнутри ихо и нажмите кнопку " чистая " на микроинъекционной системе. Это произведет кратко период более высокого давления воздуха которое должно очистить засорение. Это также вызовет некоторую утечку бактериального инокулята на тарелку; Поэтому, если это произойдет, чистое действие должно быть повторено на всех листах, чтобы обеспечить равенство бактериальной инокулята на тарелку. Одним из больших преимуществ Ихоос, полученных в ГИПЦ, является их размер. Кишечные органоиды от мышей и первичных человеческих органоидов гораздо меньше (размером до ~ 100 мкм и 100-300 мкм, соответственно27, по сравнению с 250-1500 мкм для ГИПЦ-производных ИХОС), а это означает, что инъекции большого количества органоидов будет медленнее. Это позволяет делать эксперименты по инъекционной инъекции в ИХОС, полученных на основе ГИПЦ. Кроме того, можно изучить содержание в ИХОС, собирая их постинфекции и вручную дисотделения Iхос в DPBS, выпуская их содержание. Для микроинъекций, мы рекомендуем использовать высокую концентрацию бактерий. Мы обнаружили, что более низкие концентрации недостаточны для выработки ответных мер со стороны МСЭС, составляющих Иос. Кроме того, было трудно впоследствии найти внутреннюю бактерию с помощью микроскопии. Инокуляты могут быть оптимизированы для различных бактериальных штаммов.
В целом, Ихоос-производные iHOs обеспечивают перспективную модель для прямого рассечения эпителиального ответа на кишечные инфекции, будь то путем изучения внутриклеточного вторжения рассчитывает, визуализации, измерение уровня цитокинов в ихо супернатанты, или уборки РНК, чтобы изучение транскрипционных изменений после контакта с патогенными микроорганизмами. Их полезность будет еще более очевидной в будущем для создания моделей инфекции для человека ограниченных патогенов и использования возможностей использования этой технологии для персонализации исследований путем изучения конкретных связанных с болезнью генетических мутаций и реакции на лекарства.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из Велком Траст "," Гейтс ", и Кембриджский Биомедицинский исследовательский центр. Е.А.Л. является клиническим аспирантом, поддерживаемый «Уэллком траст».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
- Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
- Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K.
- Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
- Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
- Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
