Summary
Humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet intestinal organoids tilbyr spennende muligheter til å modellere enteric sykdommer in vitro. Vi viser differensiering av hiPSCs i intestinal organoids (iHOs), stimulering av disse iHOs med cytokiner, og microinjection av Salmonella Tyfimurium i iHO lumen, slik at studiet av en epitel invasjon av denne Patogen.
Abstract
Intestinal ' organoid ' (iHO) system, karakterisert ved at 3-D strukturer representant for epitel slimhinnen i den menneskelige tarmen kan produseres fra humane indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) og vedlikeholdes i kultur, gir en spennende mulighet til å tilrettelegge modellering av epitel responsen til enteric infeksjoner. In vivo, intestinal epitelceller (IECs) spiller en nøkkelrolle i å regulere intestinal homeostase og kan direkte hemme patogener, selv om mekanismene som dette skjer er ikke fullt belyst. Den cytokin interleukin-22 (IL-22) har vist å spille en rolle i vedlikehold og forsvar av tarmen epitel barriere, inkludert inducing en utgivelse av antimikrobielle peptider og chemokiner som svar på infeksjon.
Vi beskriver differensiering av sunn kontroll hiPSCs i iHOs via tillegg av spesifikke cytokin kombinasjoner til deres kultur medium før embedding dem inn i en kjeller membran matrise-basert prointestinal kultur system. Når innebygd, er iHOs vokst i Media supplert med noggin, R-spondin-1, epidermal vekstfaktor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, og Y-27632 dihydrochloride monohydrat. Ukentlig passasjer ved manuell forstyrrelse av iHO Ultrastructure føre til dannelsen av budded iHOs, med noen viser en krypten/villus struktur. Alle iHOs demonstrere et differensiert epitel bestående av begeret celler, enteroendocrine celler, Paneth celler, og polarisert enterocytes, som kan bekreftes via immunostaining for bestemte markører for hver celle delsett, overføring elektron mikroskopi (TEM), og kvantitativ PCR (qPCR). Til modell infeksjon, Salmonella ENTERICA serovar tyfimurium SL1344 er microinjected inn i lumen av iHOs og inkubert for 90 min ved 37 ° c, og en modifisert Gentamicin beskyttelse analysen er utført for å identifisere nivåer av intracellulære bakteriell invasjon. Noen iHOs er også forbehandlet med rekombinant Human IL-22 (rhIL-22) før infeksjon for å fastslå om dette cytokin er beskyttende mot Salmonella infeksjon.
Introduction
I de senere årene har studiet av verts-patogen interaksjoner blitt forsterket av utviklingen av ' organoid ' modeller, hvor 3-D representasjoner av tarm epitel kan produseres fra ulike forfedre. ' Primary ' organoids kan genereres direkte fra intestinal stamceller høstes fra intestinal biopsier. I tillegg kan intestinal organoids genereres fra hiPSCs. Det samme kan sies om mange vev, med mage1, lever2, bukspyttkjertelen3,4, Brain5,6, lunge7, og prostata8 organoids brukes av mange forskere til å modellere Sykdom. Det er mange spennende anvendelser av organoid systemet, inkludert modellering kreft9 og Drug screening10, men her fokuserer vi på bruk av iHOs som en infeksjon modell, bruker S. enterica serovar Tyfimurium (S. Tyfimurium) som en eksemplarisk patogen og forbehandling med IL-22 som terapi.
I denne studien, hiPSCs brukes til å generere iHO er ' Kolf2 ' iPSCs, generert fra en sunn individ og tilgjengelig fra Human indusert pluripotent Stem Cells Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), en åpen tilgang referansepanel av preget hiPSC linjer11. En fordel med å bruke hiPSCs som forfedre for organoids er at det nå er omfattende banker av sunn donor iPSC linjer tilgjengelig, noe som betyr at resultatene kan valideres i en rekke cellelinjer med ulike genetiske bakgrunner. I tillegg bør forskerne ønsker å se på spesifikke sykdom-forbundet enkelt nukleotid polymorfismer (SNPs), er det mulig å bruke CRISPR/Cas9 til ingeniør mutasjoner i en sunn cellelinje, og dermed produsere både en mutert linje og beholde isogenic kontroll linje for sammenligning12. I vår erfaring, hiPSC-avledet intestinal organoids er større i størrelse enn sine primære motstykker og mer konsistent i kultur, noe som gjør for en mindre teknisk utfordrende microinjection og potensielt gir et mer mangfoldig spekter av patogener skal Studerte. iHOs kan bli cryogenically bevart, og vi har spredd iHO kulturer i inntil et år for å produsere materiale for eksperimentering.
In vivo, IECs spille en nøkkelrolle i å regulere intestinal homeostase og kan direkte hemme patogener, selv om mekanismene som dette skjer er ikke godt forstått. Den cytokin IL-22 er kjent for å ha en rolle i vedlikehold av tarmen epitel barriere13 og er involvert i induksjon og sekresjon av antimikrobielle peptider og chemokiner som svar på infeksjon14. Det er produsert av aktiverte T-celler (spesielt, Th17 celler) så vel som av Natural Killer (NK) celler og binder seg til en heterodimeric reseptor sammensatt av IL-22R1 og IL-10R2 under enheter15. Reseptoren for IL-22 er uttrykt basally på IECs, noe som betyr at i iHO modellen, er det mulig å forbehandle organoids med rhIL-22 bare ved sitt tillegg til kultur medium16. En ulempe ved organoid systemet er at den mangler den tilhørende immunresponsen normalt levert av andre immun celletyper; Imidlertid, modeller er Emerging det prøve å coculture organoids med intestinal lymfocytter å bedre forestiller denne17,18.
Bruken av microinjection systemet er nøkkelen til å simulere infeksjoner i iHO modellen, siden dette tillater direkte levering av patogener til den apikale overflaten av epitel, som ville skje i tilfelle av in vivo infeksjon. Tillegg av fenol rød til bakteriell løsning injisert i iHO markerer de som har blitt smittet, og dermed unngår gjentatte injeksjoner av samme iHO. Organoids som fartøy for smitte modellering er økende i bruk, med patogener som Helicobacter pylori,19 Norovirus,20 rotavirus,21 Shiga gift-produserende Escherichia coli22, Cryptosporidium23, og det Zika viruset24 har blitt vist å overleve og gjenskape innenfor disse systemene. Denne teknologien kan anvendes på et bredere spekter av patogener, spesielt til organismer som er vanskelig å kultur, for eksempel protozoer, eller menneskelige begrensede patogener, for å få direkte informasjon om den menneskelige epitel respons på infeksjon.
Protocol
1. dyrking og Passaging av indusert Pluripotent stamceller
Merk: Alle metodene som beskrives her, bruker kommersielt tilgjengelige menneskelige cellelinjer. Alle vev kulturarbeid beskrevet nedenfor bør gjøres i en klasse II laminær Flow hette. iPSCs er rutinemessig vedlikeholdt i Stamcelle kulturen medium (se tabell over materialer), i henhold til produsentens instruksjoner, som gjør at en helg-fri kultur av iPSCs. iPSCs kan tilpasses fra andre iPSC kultur systemer med relativ letthet.
- Passage cellene når koloniene dekker ca 80%-90% av plateoverflaten.
- Klargjør platene for passasjen 1 time før bruk ved å tilsette vitronectin 10 μg/mL fortynnet i Dulbecco saltvann (DPBS; uten kalsium [ca] eller magnesium [mg]) til vevs-og kultur behandlede plater. Volumene for belegg er avhengig av plate størrelsen, og finnes i produsentens instruksjoner. I løpet av denne tiden, varm stilk cellen kultur medium til romtemperatur (RT).
- Fjern mediene fra iPSCs klar for passasje og vask cellene 2x med DPBS (uten ca eller mg).
- Legg EDTA-løsning (se tabell over materialer) til platene, og pass på at hele overflaten er belagt og RUGE ved RT i 5 – 8 min. Når hullene begynner å vises i sentrum av iPSC koloniene, aspirer og forkaste EDTA-løsning.
- Legg stilk cellen kultur medium til brønnene; Løsne iPSCs ved å forsiktig vaske Media over plateoverflaten et par ganger. Den iPSCs er passert som klumper og ikke som enkeltceller, så sørg for at EDTA-løsningen ikke er igjen på for lenge. Flytt eventuelle forskyves iPSCs til et 15 mL konisk rør.
- Aspirer vitronectin fra precoated platene og erstatte den med stilk cellen kultur medium. Inverter iPSC suspensjon en rekke ganger for å sikre at iPSCs ikke har avgjort på bunnen av konisk rør, og legge til riktig volum av suspensjon for å gi en 1:10 fortynning av celler på en ny plate. Splitt forholdstall kan justeres avhengig av iPSC vekstrate, som kan variere mellom iPSC linjer.
- Rock platen for å spre iPSCs over overflaten og legg den i en inkubator på 37 ° c/5% CO2. Mate iPSCs dagen etter passaging.
2. differensiering fra iPSCs til baktarm
- På dag 0, Split iPSCs på en 10 cm vev-kultur-behandlet parabol, precoated med vitronectin som beskrevet i trinn 1,2, i 10 ml av stilk cellen kulturen medium supplert med activin a (10 ng/ml) + grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF; 12 ng/ml). Legg vekst faktorene til mediene direkte før bruk; gjøre dette i alle etterfølgende trinn.
- På dag 1, endre Media (10 ml av Stamcelle kulturen medium med activin A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
- På dag 2, begynner differensiering ved å endre Media til 10 ml av stilk cellen kultur medium supplert med følgende vekstfaktorer: activin A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), bein Morfogenetiske protein 4 (BMP-4; 10 ng/ml), phosphoinositol 3- kinase inhibitor LY294002 (10 μM) og GSK3-hemmer CHIR99021 (3 μM).
- På dag 3, endre Media til 10 ml av stilk cellen kultur medium supplert med activin A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml), og LY294002 (10 μM). Endoderm spesifikasjon indusert av dette mediet bør resultere i synlige endringer i iPSC koloni morfologi over de neste 24 h.
- På dag 4endrer du mediene til 10 ml RPMI/B27-medier supplert med activin A (100 ng/ml) og bFGF (100 ng/ml).
Merk: RPMI/B27 Media inneholder 500 mL av RPMI medium med L-glutamin supplement (se tabell 1), 10 ml av B27 supplement (50x, serum gratis), og 5 ml av unødvendige aminosyrer. Valgfritt: tilsett 5 mL penicillin-Streptomycin (10 000 U/mL). Filter-sterilisering før bruk. - På dag 5, endre Media til 10 ml RPMI/B-27 Media supplert med activin A (50 ng/ml).
- På dag 6, for å begynne å mønstre de bakre endoderm til baktarm, endrer du mediene til 10 ml RPMI/B27-medier SUPPLERT med CHIR99021 (6 μm) + retinoic yre (3 μm).
- På dag 7, 8og 9gjentar du trinn 2,7. Under disse trinnene, synlige 3-D strukturer av baktarm skal bli tydelig, dekker overflaten av platen.
- På dag 10, legge inn den resulterende baktarm i kjelleren membran matrise (se tabellen av materialer).
3. embedding av baktarm i Basement membran Matrix
- Utgjør iHO base vekst Media (500 mL av avansert Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium [DMEM]/F12, 10 mL av B27 supplement [50x, serum gratis], 5 mL N2 supplement [100 M, serum gratis], 5 mL 1 meter 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), og 5 mL av ikke-nødvendige aminosyrer [100]. Valgfritt: tilsett 5 mL penicillin-Streptomycin [10 000 U/mL]; filter-steriliseres før bruk. Se tabell 1).
-
Fjern mediene fra baktarm platen, og vask platen 1x med DPBS (uten ca eller mg). Tilsett 5 mL kollagenase løsning på platen og ruge ved 37 ° c i 5 min.
- Produser kollagenase løsning ved å legge til 500 mg kollagenase IV pulver til 400 mL avansert DMEM/F12. Etter dette, tilsett 100 mL serum erstatning (se tabell av materialer), 5 ml L-glutamin (200 mm), og 3,5 μL av 2-mercaptoethanol, og virvel løsningen å blande. Filter-sterilisere oppløsningen når det kollagenase pulveret er helt oppløst.
Merk: Dette kan oppbevares ved-20 ° c i opptil 6 måneder i mindre alikvoter.
- Produser kollagenase løsning ved å legge til 500 mg kollagenase IV pulver til 400 mL avansert DMEM/F12. Etter dette, tilsett 100 mL serum erstatning (se tabell av materialer), 5 ml L-glutamin (200 mm), og 3,5 μL av 2-mercaptoethanol, og virvel løsningen å blande. Filter-sterilisere oppløsningen når det kollagenase pulveret er helt oppløst.
- Deaktiver kollagenase ved å legge til 5 mL iHO base vekst Media til platen og skrape av baktarm celler ved hjelp av en celle skraper, samle baktarm suspensjon i en 15 mL konisk rør.
- Sentrifuger på 240 x g for 1 min og Pipetter av supernatanten.
- Tilsett 10 mL Media, bryte opp baktarm i mindre biter ved forsiktig pipettering, og sentrifuger igjen ved 95 x g i 1 min.
- Vask cellene 2x i iHO base vekst Media ved å gjenta trinn 3,5. Resuspend cellene i et lite volum av basen vekstmedium (~ 300 – 500 μL) og tilsett rundt 100 μL av denne løsningen til 1,5 mL av kjelleren membran matrise. Matrisen må forbli på isen i løpet av denne tiden som det vil begynne å stivne raskt ved RT.
-
Sett opp en 24-brønn plate på en plate varmer ved 37 ° c og spot ut 60 μL i en brønn av 24-brønn plate. La den sette kort og sjekke tettheten under et mikroskop.
- Om nødvendig, tilsett mer baktarm løsning til kjelleren membran matrise i trinn til ønsket konsentrasjon er oppnådd, og spot ut løsningen i de resterende brønnene.
- Ruge ved 37 ° c i 10 min; Tilsett deretter 800 μL av iHO base vekst medier som inneholder vekstfaktorer til hver brønn av 24-brønn platen ved følgende konsentrasjoner (se tabell 1): 500 ng/ml R-spondin-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml epidermal vekstfaktor (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μm prostaglandin E2 og 10 μM Y-27632 dihydrochloride monohydrat (ROCK-hemmer).
-
Endre iHO base vekst Media hver 2-3 dager, eller umiddelbart hvis mediene begynner å misfarges. Etter den første seeding i kjelleren membran matrise, la iHOs å utvikle i 7 dager før splitte dem. Etter dag 3 – 4 bør forskjellige sfærer være synlige i kulturen.
- For medie endring alene, utelater Y-27632, da dette er bare nødvendig når splitting/seeding.
4. vedlikehold og passering av iHOs
- For å tillate gradvis tine, legge ut det nødvendige volumet av kjelleren membran matrise i en overbygd is bøtte ved 4 ° c over natten, 24 timer før splitting.
-
Fjern mediene fra iHOs og erstatte den med 500 μL av celle-løfting løsning (se tabell over materialer) per brønn. Ruge ved 4 ° c i 40 – 50 min, noe som peker iHOs skal flyte i løsningen.
- Valgfritt: Bruk en in-Hood Imaging system for å velge bare iHOs med ønsket morfologi (se tabell over materialer).
- Pipetter forsiktig iHO/Cell løfte løsning suspensjon i 15 mL koniske rør, prøver ikke å bryte opp iHOs. La IHOs å bosette for 3-5 min og fjerne supernatanten og enkeltceller.
- Resuspend den iHOs i 5 mL av iHO base vekstmedium og Pipetter dem forsiktig til å vaske. Sentrifuger på 95 x g for 2 min.
- Sett opp en 24-brønn plate på en plate varmer ved 37 ° c innenfor panseret.
- Fjern supernatanten og resuspend iHOs i ~ 300 – 500 μL av base vekst medier, ved hjelp av en P1000 pipette for å bryte opp iHOs i mindre biter. Merk at kraften som må brukes vil variere avhengig av iHO linje og modnings tilstand, så Start forsiktig, øke kraften hvis nødvendig.
- Plasser ~ 100 μL av iHOs (volumet er avhengig av tettheten av løsningen) i 1,5 mL kjeller membran matrise og pipette kort for å blande.
- Spot ut 1 x 60 μL av kjelleren membran matrise i ett godt av 24-brønn plate, la den stivne i ~ 30 s, og deretter sjekke tettheten under mikroskopet. Hvis tettheten er for lav, legge til flere iHOs til matrisen.
- Gjenta trinn 4,8 til riktig tetthet er ervervet, og deretter spot ut resten av matrisen i en 24-brønn plate.
- Plasser den i en inkubator ved 37 ° c i 10 min, og deretter overlay den med 800 μL av base vekstmedium med vekstfaktorer, som beskrevet i trinn 3,7.
-
For å forberede iHOs for en invasjon analysen eksperiment (skissert nedenfor), passasje på iHOs 4-5 dager før eksperimentet som beskrevet i trinn 4.1-4.10, men sted 120 μL av matrisen iHO løsning generert i trinn 4,7 i 5 mm glassbunn microinjection retter.
- Snarere enn å forlate iHO suspensjonen i en dråpe som med rutinemessige passaging, spre dråpe over bunnen av fatet for å skape et tynt lag med matrise. Dekk den med 2,5 mL base vekstmedium pluss vekstfaktorer.
Merk: Hvis antibiotika har vært brukt i kultur medium, må disse fjernes og erstattes med nonantibiotic supplert Media for microinjection eksperimenter.
- Snarere enn å forlate iHO suspensjonen i en dråpe som med rutinemessige passaging, spre dråpe over bunnen av fatet for å skape et tynt lag med matrise. Dekk den med 2,5 mL base vekstmedium pluss vekstfaktorer.
5. Prestimulation av iHOs med rhIL-22
- Aspirer mediene fra iHOs og erstatte den med frisk base vekst Media (som ikke må inneholde antibiotika) 18 timer før invasjonen analysen.
- Legg rhIL-22 til kultur Media til en endelig konsentrasjon av 100 ng/mL.
6. Microinjection av iHOs og intracellulære Invasion analyser
- På dagen før eksperimentet, sett opp S. Tyfimurium SL1344 kultur i 10 mL Luria-Bertani buljong og ruge ved 37 ° c over natten med risting.
- På dagen for eksperimentet, hvis et mikroskop med et lukket varme kammer er tilgjengelig, slå den på og la temperaturen til nå 37 ° c før du starter analysen.
- Fortynne over natten bakteriell kulturen inne DPBS (inneholder ca og mg) å en optisk tettheten av 2 for 600 NM (OD600) og, så, blande den 1:1 med fenol rød.
- Legg microinjection parabolen inneholder iHOs på mikroskopet scenen, ta av lokket, og bringe iHOs i fokus, klar for injeksjon å begynne.
- Drei injeksjons-og arm kontroll stasjonene på. Sørg for at injeksjonsstedet er satt til et trykk på 600 kPa og en injeksjons tid på 0,5 s. Hvis den ikke allerede er støttet bort fra mikroskopet, roterer du injeksjons armen for å være sikker på at den er.
- Sett opp en 6 μm microinjection bore spissen ved å fjerne emballasjen og plast sylinderen fra nålen. Fjern gripe hodet fra injeksjons armen.
- Legg bore spissen med 10 μL av inokulum, og sett bore spissen forsiktig på den butte enden. Sett bore spissen inn i gripe hodet og fest den til microinjection armen.
-
Beveg armen forsiktig i posisjon slik at nålen ligger 1 – 2 cm over microinjection parabolen. Bruk arm kontrollen til å posisjonere nålespissen i midten av fatet og senk den til den er like over overflaten av Media.
- Program armen kontrollstasjon for å returnere nålen til dette punktet etter alle injeksjoner.
- Fokuser mikroskopet på iHOs, og Velg målet du vil injisere. Plasser nålen like over og til høyre for iHO som skal injiseres og beveg nålen nedover og sidelengs inn i iHO lumen.
- Trykk på knappen Injiser på microinjector. den fenol-beiset bakteriell blanding vil dukke opp fra nålen. Injiser hver iHO 3x. Injiser minst 30 iHOs per betingelse.
Merk: På grunn av heterogenitet i iHO størrelse og struktur innenfor en kultur, er det nødvendig å injisere et stort antall iHOs å kontrollere for variasjon. - Når alle nødvendige iHOs injiseres, Fjern microinjection platen fra scenen, Bytt lokket og ruge platen ved 37 ° c i 90 min.
- Etter 90 min, aspirer vekst mediene og erstatte den med 3 mL av celle løfte løsning; ruge ved 4 ° c i 45 min.
- Flytt iHOs/celle løfte løsningen forsiktig til et 15 mL konisk rør som inneholder 5 mL DPBS. Sørg for at alle injisert iHOs har blitt fjernet fra platen (skyll platen med 1 mL av DPBS om nødvendig). Sentrifuger på 370 x g i 3 min.
- Fjern supernatanten og resuspend iHOs i basen vekst medier som inneholder Gentamicin på 0,1 mg/mL (Tilsett 1 mL Media; deretter bruke en P1000 pipette ~ 50x å bryte opp iHOs, og legge til 4 mL ytterligere Media).
- Ruge ved 37 ° c for 1 time å drepe ekstracellulære bakterier.
- Sentrifuger iHOs på 370 x g for 3 min og aspirer supernatanten, etterlot så lite som mulig. Vask iHOs 1x med DPBS og sentrifuger igjen.
Merk: Dette trinnet fjerner Gentamicin, noe som er viktig som eventuelle gjenværende Gentamicin kan drepe intracellulære bakterier når cellene er lysert. - Resuspend iHOs i 500 μL av lyseringsbuffer (se tabell over materialer) og distansere manuelt organoids av pipettering ~ 50x. La denne blandingen i 5 min på RT.
- Serielt fortynne den resulterende løsningen 10-Fold i DPBS å generere 10-1, 10-2, og 10-3 konsentrasjoner. Pipetter 3 x 20 μL dråper av ryddig og utvannet løsninger på prewarmed LB agar plater.
- Ruge over natten ved 37 ° c og utføre koloni telling og beregning av koloni-forming enheter (CFU). Colony teller vil gjenspeile antall intracellulære bakterier som ble utgitt i løpet av cellen lysering prosessen.
7. celle frysing og gjenoppretting
Merk: Som nevnt tidligere, er det mulig å cryogenically bevare iHOs og Rekonstituer dem når det er ønskelig. De frysing og tine prosessene er skissert nedenfor.
- Velg brønnene til iHOs du ønsker å fryse. Legg til celle løfte løsning i brønnene og ruge i 40 – 50 min ved 4 ° c. IHOs skal flyte i løsningen.
- Forsiktig Pipetter iHOs i en 15 mL konisk rør og tillate dem å bosette seg. Fjern mediene og vask iHOs 1x med base vekst medier (ingen vekstfaktorer).
-
Sentrifuger på 95 x g for 2 min, fjerne supernatanten, og erstatte den med et passende volum av celle frysing medium (se tabell over materialer; bruk mediet i henhold til produsentens instruksjoner), decanting iHOs i kryogene hetteglass.
- Oppbevar hetteglassene i en-80 ° c fryser over natten for å tillate mer gradvis frysing; overføre dem til lagring av flytende nitrogen.
-
For å Rekonstituer iHOs, tine raskt et kryogene hetteglass ved 37 ° c ved hjelp av et vann/perle bad; deretter forsiktig pipette innholdet i 10 mL base vekst Media (ingen vekstfaktorer). La iHOs bosette seg og erstatte mediene med ~ 300 μL av ferske base vekst medier.
- IKKE distansere iHOs manuelt. Legg til iHOs for å legge til en kjeller membran og plate dem ut som beskrevet i avsnitt 3.
Representative Results
Etter begynnelsen av differensiering prosessen, cellene skal passere gjennom stadiet av definitive endoderm formasjon etterfulgt av baktarm mønstre før embedding inn i kjelleren membran matrise. Spheroids vil danne og kulturer med store mengder forurensende materiale vil klare over en periode på flere uker som iHOs modne. Eksempel bilder av differensiering, innebygging og passaging prosessen er vist i figur 1.
Oppsettet av microinjection systemet er som demonstrert i figur 2. De iHOs er microinjected med fenol rød/bakteriell løsning og beholde sin røde farge, slik at identifisering av infiserte iHOs å hindre dupliserte injeksjoner. Tellinger av belagt intracellulære bacteria er utført fulgte det modifisert Gentamicin sikringen analysen; prestimulation med rhIL-22 begrenser S. Tyfimurium infeksjon, med færre intracellulære bakterier blir observert etter rhIL-22 behandling (Figur 3). Vi har også rutinemessig behandle infiserte iHOs for immunostaining, eller TEM, for å lette visualisering av verten IEC-bakterielle interaksjoner (Figur 4).
Figur 1: rettet differensiering av iPSCs til iHOs. Representative sekvens av differensiering fra iPSCs til iHOs, demonstrere morfologiske endringer observert og vekstfaktorer som kreves for å drive disse endringene. Definitive endoderm dannes ved dag 4 av differensiering, etter eksponering for spesifikke konsentrasjoner av kombinasjoner av activin A, FGF, BMP-4, LY294002 og CHIR99021. Etter 8 dager resulterer mønsteret i denne definitive endoderm med spesifikke konsentrasjoner av CHIR99021 og retinoic syre i baktarm formasjon. Postembedding, spheroid formasjon er observert. Etter vedvarende passaging ved hjelp av en støtte kjelleren membran matrise kledde med medium supplert med prointestinal spredning faktorer R-spondin 1, noggin, EGF, CHIR99021, og prostaglandin E2, spheroids fremgang i budded iHOs. (Bilder ble tatt på 4X-10x forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microinjection av en iHO med S. Tyfimurium. (A) microinjection systemet (se tabellen av materialer) vedlagt i miljøkammeret; Dette tillater injeksjon av iHOs i et kontrollert miljø (37 ° c/5% CO2). (B) bakteriell inokulum leveres direkte inn i iHO lumen ved hjelp av en microcapillary festet til microinjection systemet. (C) ved å blande bakteriell inokulum med fenol rød, er det klart hvilken iHOs har blitt smittet, og dermed unngår dupliserte injeksjoner av samme iHO. Bildene ble tatt ved 10x forstørrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Forbehandling av iHOs avledet fra Kolf2 cellelinjen med rhIL-22 begrenser S. Tyfimurium SL1344 invasjon i intestinal epitelceller. For Gentamicin beskyttelse analysene ble iHOs behandlet med 100 ng/mL rhIL-22 18 h før infeksjon, eller venstre ubehandlet, og inkubert for 90 min postinfection. Dataene er midler av tre tekniske replikerer for tre biologiske replikerer ± SEM. For signifikante tester ble mann-Whitney U-tester brukt; p < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: interaksjon av IECs med S. TYFIMURIUM SL1344. Disse panelene demonstrere iHOs injisert med S. Tyfimurium SL1344 og inkubert for 3 h, før fiksering og prosessering for (A) immunofluorescence eller (B) overføring elektron mikroskopi. I panel A, bakterier er sett i iHO lumen og samspill med epitel. Kjerner er beiset med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactate (blå), cellemembraner med phalloidin (rød), og bakterier med CSA-1 (grønn). Bildene er tatt på 20x forstørrelse. Panel B demonstrerer tre ulike intracellulære behandling trasé av Salmonella følgende invasjon; bakterier er sett (a) innenfor en Salmonella-inneholder vacuole, (b) gratis innenfor cytoplasma, og (c) gjennomgår autofagi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| RPMI/B27 medium | |
| Komponent: | Beløpet: |
| RPMI 1640 medier med glutamin supplement | 500 mL |
| B27 serum-gratis supplement 50x | 10 mL |
| iHO base vekstmedium | |
| Komponent: | Beløpet: |
| Avansert DMEM/F12 | 500 mL |
| B27 serum-gratis supplement 50x | 10 mL |
| N2 serum fritt supplement 100 | 5 mL |
| HEPES 1 M | 5 mL |
| L-glutamin 200 mM | 5 mL |
| Vekstfaktorer for iHO base vekstmedium | |
| Komponent: | Beløpet: |
| Rekombinant Human R-spondin1 | 500 ng/mL |
| Rekombinant humant noggin | 100 ng/mL |
| Epidermal vekstfaktor (EGF) | 100 ng/mL |
| Prostaglandin E2 | 2,5 μM |
| CHIR99021 | 3 μM |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrat | 10 μM |
Tabell 1: Media oppskrifter.
Discussion
Denne protokollen skisserer differensiering av hiPSCs i iHOs og deres nytte som en modell for å simulere enteric infeksjoner. Nedenfor skisserer vi de kritiske trinnene i protokollen og eventuelle modifikasjoner eller forbedringer vi har gjort.
Denne protokollen effektiviserer differensiering prosessen med hiPSCs sammenlignet med tidligere publisert arbeid25. Tidligere brukte metoder krevde overføring av hiPSCs fra andre hiPSC kultur systemer (f. eks, mater-avhengige hiPSC kultur) til kjemisk definert medium-polyvinylklorid (CDM-PVA). Denne overføringen til CDM-PVA tar vanligvis 2 – 3 uker og krever daglig fôring av hiPSCs. Denne protokollen var heller ikke konsekvent effektiv, med noen differentiations sviktende; Derfor trialed vi differensiering ved hjelp av de samme vekst faktorene, men starter med hiPSCs vokst i Stamcelle kulturen medium (i stedet for CDM-PVA) og utskifting av CDM-PVA med stilk cellen kulturen medium under differensiering dager 0 – 3. Dette har vært vellykket for de fem uavhengige hiPSC linjer trialed så langt, noe som gjør differensiering prosessen mye raskere og effektiv. Dette gjør det også mulig Helge fri dyrking av hiPSCs før differensiering, slik at mer fleksibilitet i hiPSC kulturen. iHO linjer produsert av denne metoden har vært phenotyped for markører av intestinal epitel som vi tidligere har beskrevet for hiPSC linjene Kolf2, Yemz1, og Lise116 og vises phenotypically skilles fra iHOs produsert ved hjelp av forrige Protokollen.
Etter seeding, iHOs krever minst 1 måned rutinemessig passaging, med splitting hver 4-7 dager for å lette modning. Merk at det vil være noen variasjon i iHO utvikling avhengig av iPSC linjen som brukes og tettheten av den opprinnelige kulturen. I løpet av de første avsnittene, vil det være synlig forurensende celler som ikke er iHOs. Disse vil til slutt dø, etterlot en ren kultur av sfærisk og, etter ca 4 uker, budded iHOs. I tillegg kan en in-Hood Imaging system brukes til å velge og passasje bare iHOs med ønsket morfologi. Som iHOs eldre, vil de kreve splitting hver 6-7 dager, avhengig av vekst og tetthet. Hvis noen av følgende oppstår, iHOs bør deles før dette punktet: den luminal hulrom i iHOs begynner å fylle opp med døde celler, begynner kjelleren membran matrise å oppløses, den iHOs begynner å vokse ut av kjelleren membran matrise, eller kulturen er for tett og Media begynner å gå gult svært raskt.
Når iHO kulturen er etablert, hvis noen gang utseendet på iHOs endringer eller er annerledes enn forventet (for eksempel kulturer forblir sfærisk, snarere enn spirende), bestemmelse av fenotype via immunhistokjemi og qPCR for celle markører bør gjentas for å sikre at differensiering av celletyper i iHOs (f. eks, begeret celler, Paneth celler) forblir intakt. Hvis iHOs ikke lenger er unike, så de bør kastes og redifferentiated eller en tidligere passasje av iHOs bør Tint og rekonstituert. Hvis iHOs opphøre å skille, de potensielle årsakene er en alder av kulturen (hvis det er over 6 måneder gammel), aktiviteten av vekstfaktorer (sikre at disse er tilberedt i henhold til produsentens instruksjoner og holdt frosset i små alikvoter å unngå flere fryse-tine sykluser), for hyppige eller voldelige passasjer (generelt, passaging bør bare forekomme en gang i uken, og hvis iHOs er manuelt dissosiert for kraftig med jevne mellomrom, vil de slutte å fullt differensiere).
Vi etablerte via RNA sekvensering at IL-22 stimulering 18 h før infeksjon upregulates antimikrobielle gener og de som er involvert i barriere forsvaret fenotype. Før bruk av nye iHsO for analyser som involverer prestimulation med rhIL-22 (eller en alternativ cytokin hvis systemet blir brukt til dette), er det tilrådelig å sjekke aktiviteten av gener kjent for å være upregulated av cytokin (i tilfelle av IL-22 , brukte vi DUOX2 og LCN2) via QPCR etter stimulering av iHOs, for å sikre reseptor uttrykk og intakt signal. Før den første bruk av IL-22, vi også gjennomført immunhistokjemi å finne IL-22 reseptor på iHOs å fastslå at uttrykket av IL-22 reseptoren var basal, noe som betyr at prestimulation kan oppnås ved å legge rhIL-22 til iHO kulturen Medium. Men hvis en reseptor er apically uttrykt, kan denne protokollen må tilpasses for å levere ligander apically.
Fallgruver om microinjection systemet er generelt knyttet til delikatesse av nålene som kreves for injeksjon. Her bruker vi kommersielt tilgjengelige bore spisser med 6 μm lumen. Det er mulig å trekke injeksjon nåler fra glass blodkar26 selv om dette kan være mindre ensartet, fører til lekkasjer fra nålen spissen eller inkonsekvent volumer blir injisert i iHOs. Det er viktig å være sikker på at injeksjonen har funnet sted i iHO lumen, som er en årsak til bruk av fenol rød som et fargestoff; den iHOs vil synlig utvide og holde den røde inokulum, slik at sikkerhet om hvilke iHOs har blitt injisert. Noen ganger nåler vil tette med rusk fra iHO veggen; Hvis dette er tilfelle, fjerner du nålespissen fra innsiden av iHO og trykker på Clean -knappen på microinjection systemet. Dette vil produsere en kort periode med høyere lufttrykk som skal fjerne blokkeringen. Det vil også indusere noen lekkasje av bakteriell inokulum på tallerkenen; Derfor, hvis dette skjer, bør ren handling gjentas på alle platene for å sikre likestilling av bakteriell inokulum per plate. En stor fordel med den hiPSC-avledede iHOs er deres størrelse. Intestinal organoids fra mus og primære menneskelige organoids er mye mindre (måle opp til ~ 100 μm og 100-300 μm, henholdsvis27, versus 250-1500 μm for hiPSC-avledet iHOs), noe som betyr at injeksjoner av store mengder organoids vil bli tregere. Dette gjør at sprøyte eksperimenter med større skala kan trialed i det hiPSC-avledede iHOs. Det er en likeledes mulig å studere det luminal innholdet av det iHOs av innhøsting seg postinfection og manuelt dissociating det iHOs i DPBS, frigir deres luminal innholdet. For microinjection, anbefaler vi å bruke en høy konsentrasjon av bakterier. Vi fant at lavere konsentrasjoner ikke var tilstrekkelig til å generere et svar fra IECs bestående av iHOs. I tillegg var det vanskelig å senere finne internalisert bakterier ved hjelp av mikroskopi. Inokulum må kanskje optimaliseres for ulike bakteriestammer.
Oppsummert hiPSC-avledet iHOs gi en lovende modell for direkte dissekere epitel responsen til enteric infeksjoner, enten ved å studere intracellulære invasjon teller, Imaging, måle cytokin nivåer i iHO supernatanter, eller høsting RNA til studere transcriptional endringer etter eksponering for patogener. Deres nytte vil bli enda mer tydelig i fremtiden for å etablere smitte modeller for Human-begrensede patogener og i å utnytte mulighetene for å bruke denne teknologien til å tilpasse forskning ved å studere spesifikke sykdom-relaterte genetiske mutasjoner og narkotika responser.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra The Wellcome Trust, The Gates Foundation, og Cambridge Biomedical Research Centre. E.A.L. er en klinisk Ph.D. student som støttes av Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
- Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
- Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K.
- Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
- Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
- Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
