Summary
人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 衍生的肠道有机体为体外肠道疾病的模型模型提供了令人兴奋的机会。我们展示了高 Psc 分化为肠道有机体 (Iho), 这些 Iho 的刺激与细胞因子, 以及微注射伤寒沙门氏菌到 iho 腔, 使研究上皮入侵的研究通过此病 原 体。
Abstract
肠道 "有机体" (iHO) 系统, 其中代表人类肠道上皮衬里的三维结构可以从人类诱导的多能干细胞 (Hipsc) 产生并保持在培养中, 提供了一个令人兴奋的机会, 以促进对肠道感染的上皮反应的模拟。在体内, 肠道上皮细胞 (Iec) 在调节肠道稳态方面发挥着关键作用, 并可能直接抑制病原体, 尽管这种情况发生的机制尚未得到充分阐明。细胞因子白细胞介素-22 (IL-22) 已被证明在维持和防御肠道上皮屏障, 包括诱导释放抗菌肽和趋化因子以应对感染的作用。
我们描述了健康控制高 Psc 通过在其培养基中添加特定的细胞因子组合, 然后将其嵌入到基底膜基质肠道培养系统中, 从而将其分化为 Iho。一旦嵌入, Iho 在培养基中生长, 辅以 Noggin、R-spondin-1、表皮生长因子 (EGF)、CHR99021、prostaglandin E2 和 y27632 一水。每周通道通过手动破坏 iHO 超微结构导致形成发芽的 Iho, 其中一些显示出一个隐式绒毛结构。所有 Iho 都表现出由杯状细胞、肠内分泌细胞、胰腺细胞和极化肠细胞组成的分化上皮, 可通过免疫染色的方法对每个细胞子集的特定标记、透射电子显微镜进行确认(TEM) 和定量 PCR (qPCR)。为了模拟感染, 将肠炎沙门氏菌 SL1344 微注射到 iho 的腔内, 在37°c 下孵育 90分钟, 并进行改良的庆大辛保护试验, 以确定细胞内的水平. 细菌入侵。一些 Iho 也在感染前使用重组人 IL-22 (rhIL-22) 进行预处理, 以确定这种细胞因子是否能预防沙门氏菌感染.
Introduction
近年来, 通过开发 "有机体" 模型, 可以从不同的祖细胞中产生肠道上皮的三维表达, 从而加强了对宿主-病原体相互作用的研究。"初级" 有机生物可以直接从肠道活检中采集的肠道干细胞中产生。此外, 肠有机会从高 Psc 中生成。许多组织也是如此, 其中胃1、肝脏2、胰腺3、4、大脑5、6、肺7和前列腺8类有机体被许多研究人员用来建模疾病。有机系统有许多令人兴奋的应用, 包括模型癌症9和药物筛选10, 但在这里我们重点讨论使用 iho 作为感染模型, 使用s 。伤寒的肠系膜.伤寒) 作为一种模范病原体, 并以 IL-22 为治疗方法进行预处理。
在这项研究中, 用于生成 iHO 的 Hipsc 是 "Kof2" Ipsc, 由一个健康的个人产生, 可从人类诱导的多能干细胞倡议联盟 (HipSci; www.hipsci.org) 中获得, 这是一个开放获取的参考小组, 该小组的特征第11行.使用高 Psc 作为有机体的祖细胞的一个优点是, 现在有大量的健康供体 iPSC 线可用, 这意味着结果可以在一些不同遗传背景的细胞系中得到验证。此外, 如果研究人员希望研究特定疾病相关的单核苷酸多态性 (SNPs), 则可以使用 CRISPR/Cas9 在健康的细胞系中进行突变, 从而产生突变系并保留同源基因控制线进行比较12。根据我们的经验, hpsc 衍生的肠道有机体比主要的肠道有机体体积更大, 培养也更稳定, 从而使技术上更具挑战性的微注射, 并有可能使更多样化的病原体更多样化。研究。Iho 可以被低温保存, 我们已经传播了长达一年的 iHO 培养物, 以生产用于实验的材料。
在体内, Iec 在调节肠道稳态方面发挥着关键作用, 并可能直接抑制病原体, 尽管人们对这种情况发生的机制并不十分了解。细胞因子 IL-22 是已知的一个作用, 以维持肠道上皮屏障 13, 并参与诱导和分泌抗菌肽和趋化因子, 以应对感染 14.它是由激活 T 细胞 (特别是, Th17 细胞) 以及自然杀手 (NK) 细胞产生的, 并与由 IL-22R1 和 IL-10R2 亚基15组成的异二化受体结合。IL-22 受体在 IECs 上基本表达, 这意味着在 iHO 模型中, 只需将其添加到培养基16即可对有机体进行预处理.有机体系统的一个缺点是, 它缺乏相关的免疫反应通常由其他免疫细胞类型提供;然而, 模型正在出现, 试图与肠道淋巴细胞共培养有机体, 以更好地代表这17,18.
使用微注射系统是模拟 iHO 模型中感染的关键, 因为这样可以将病原体直接传递到上皮的顶端表面, 就像体内感染的情况一样。在注射到 iHO 中的细菌溶液中加入苯酚红, 标志着被感染的物质, 从而避免了重复注射相同的 iHO。作为感染模型的容器的有机体正在使用中, 病原体如幽门螺杆菌、19种诺如病毒、20例罗塔病毒、 21种生产滋海药的大肠杆菌22,隐孢子虫23和寨卡病毒24已被证明在这些系统中存活和复制。这项技术可应用于更广泛的病原体, 特别是难以培养的生物, 如原生动物或人类受限病原体, 以便获得关于人类上皮对感染反应的直接信息。
Protocol
1. 诱导多能干细胞的培养和转移
请注意:这里描述的所有方法都使用市售的人类细胞系。下面详述的所有组织培养工作都应在 II 类层流罩中完成。根据制造商的说明, Ipsc 通常在干细胞培养基中进行维护 (见材料表), 从而使 Ipsc 能够无周培养。Ipsc 可以相对轻松地从其他 iPSC 培养系统进行调整。
- 一旦菌落覆盖了大约 80%-90% 的板表面, 细胞就会通过。
- 在使用前1小时准备通道板, 在组织培养处理的板材中加入在 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS; 无钙 [Ca] 或镁 [Mg]) 中稀释的 vitronectin 10Μg/ml。涂层的体积取决于板材尺寸, 可在制造商的说明中找到。在此期间, 温暖的干细胞培养基到室温 (RT)。
- 从准备通过的 Ipsc 中取出介质, 并用 DPBS 清洗细胞 2倍 (不含钙或镁)。
- 在板材中添加 EDTA 解决方案 (参见材料表), 确保整个表面被涂覆并在 rt 孵育5-8分钟。当 iPSC 菌落中心开始出现孔时, 吸气并丢弃 EDTA 解决方案。
- 在井中加入干细胞培养基;将 Ipsc 通过在板面上轻轻清洗介质几次来取出。Ipsc 是作为团块而不是单个单元进行传递的, 因此请确保 EDTA 解决方案不会持续太长时间。将任何脱落的 Ipsc 移动到15毫升的锥形管。
- 从预涂板中吸出玻璃体被锡, 并以干细胞培养基代替。多次反转 iPSC 悬架, 以确保 Ipsc 没有在锥形管的底部沉淀, 并添加适当体积的悬浮液, 使新的盘子上的细胞稀释1:10。拆分率可能会根据 iPSC 的增长率进行调整, 而 iPSC 线路之间的增长率可能会有所不同。
- 将板材摇一摇, 将 Ipsc 分散在表面, 并将其放置在 37°c% Co-2的孵化器中。在传代后的第二天给 Ipsc 喂奶。
2. 从 Ipsc 到信古特的区别
- 在第0天, 将 Ipsc 分成10厘米的组织培养处理盘, 如步骤1.2 所述, 用玻璃体被原涂成 vitronectin, 分成 10 ml 的干细胞培养基, 辅以活性蛋白 a (10 ngml) + 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF; 12 ngml)。在使用前将生长因子直接添加到介质中;在所有后续步骤中执行此操作。
- 第1天, 改变培养基 (10 毫升的干细胞培养基与活性蛋白 a [10 ngml] + bfgf [12 ngml])。
- 在第2天, 开始分化, 将培养基改为10毫升的干细胞培养基, 并辅以以下生长因子: 活性蛋白 a (100 ng/ml)、Bfggf (100 ngml)、骨形态发生蛋白 4 (bFGF; 10 ng/ml)、磷酸肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 (10μm) 和 GSK3 抑制剂 CHR99021 (3μm)。
- 第3天, 将培养基改为10毫升的干细胞培养基, 辅以活性蛋白 a (100 ngml)、bfgf (100 ngml)、bFGF (10ngml) 和 y294002 (10μm)。这种介质诱导的内皮规范应导致在接下来的24小时内 iPSC 菌落形态发生明显变化。
- 第4天, 将培养基改为10毫升的 RPMI/B27 介质, 辅以活性蛋白 a (100 ngml) 和 bfgf (100 ngml)。
请注意:RPMI/B27 培养基含有500毫升 RPMI 培养基, 含 l-谷氨酰胺补充剂 (见表 1)、b27 补充剂10毫升 (50x, 不含血清) 和5毫升非必需氨基酸。可选: 添加5毫升青霉素链霉素 (10, 000 u l)。使用前进行过滤消毒。 - 第5天, 将培养基改为10毫升的 RPMI/27 介质, 并辅以活性蛋白 a (50 ng/ml)。
- 在第6天, 开始将后部的后部内皮模式改变为 RPMI\ b27 培养基的 10ml, 再加上 chir99021 (6μm) + 维甲酸 (3μm)。
- 在第7、 8和9天, 重复步骤2.7。在这些步骤中, 后肠的可见三维结构应该会变得明显, 覆盖在板的表面。
- 在第10天, 将产生的后肠嵌入地下室膜基质中 (参见材料表)。
3. 在基底膜基质中嵌入下肠
- 组成 iHO 基地增长媒体 (500 毫升的先进杜尔贝克的修改鹰的媒体 [DMEM]/F12, B27 补充剂10毫升 [50x, 无血清], N2 补充剂5毫升 [100x, 无血清], 5 毫升 1 mL-(2-羟乙基)-1-吡嗪磺酸 (HEPES), 和5毫升的非必需氨基酸 [100x]。可选: 添加5毫升青霉素链霉素 [10, 000 U/mL];使用前进行过滤消毒。见表 1)。
-
从后肠板上取出介质, 用 DPBS 清洗 1 x 的介质 (不含 Ca 或 Mg)。在板上加入5毫升胶原酶溶液, 在37°c 孵育5分钟。
- 将500毫克胶原酶 IV 粉加入400毫升的先进 DMMS/F12 中, 生产胶原酶溶液。接下来, 加入100毫升的血清置换剂 (见材料表)、5毫升的 l-谷氨酰胺 (200 mm) 和3.5μl 的 2-硫醇, 并旋流溶液混合。一旦胶原酶粉末完全溶解, 对溶液进行过滤消毒。
请注意:这可以在-20°c 下储存长达 6个月, 在较小的等价物中。
- 将500毫克胶原酶 IV 粉加入400毫升的先进 DMMS/F12 中, 生产胶原酶溶液。接下来, 加入100毫升的血清置换剂 (见材料表)、5毫升的 l-谷氨酰胺 (200 mm) 和3.5μl 的 2-硫醇, 并旋流溶液混合。一旦胶原酶粉末完全溶解, 对溶液进行过滤消毒。
- 通过在板中加入5毫升的 iHO 基部生长介质, 并使用细胞刮刀刮掉后肠细胞, 在15毫升锥形管中收集后肠悬浮液, 从而激活胶原酶。
- 以 240 x g 离心 1分钟 , 上清液下移液器。
- 加入10毫升介质, 轻轻移液将后肠分解成较小的块, 并以 95 x g 的速度再次离心1分钟。
- 通过重复步骤 3.5, 在 iHO 基生长介质中清洗细胞2倍。将细胞重新注入少量的碱基生长介质 (~ 300-500Μl), 并将该溶液的约100Μl 添加到 1.5 mL 的基底膜基质中。在这段时间里, 基质必须停留在冰上, 因为它将在 RT 开始快速凝固。
-
在37°c 的板加热器上设置一个24孔板, 并将60Μl 发现到24孔板的一个井中。让它短暂设置, 并在显微镜下检查密度。
- 如果需要, 以增量的方式在基底膜基质中添加更多的后肠溶液, 直到达到所需的浓度, 并将溶液发现到剩余的井中。
- 在37°c 下孵化 10分钟;然后, 在24井板的每口井中加入800μl 的 iHO 基生长介质, 在以下浓度下添加生长因子 (见表 1): 500 ngml r-boadine-1, 100 ngml noggin, 100 ngml 表皮生长因子 (egf), 3ΜM chir99021, 2.5μm前列腺素 E2 和 10μm y-27632 一水 (ROCK 抑制剂)。
-
每2-3天更改一次 iHO 基生长介质, 如果介质开始变色, 则立即更改。在最初播种到基底膜基质后, 让 Iho 发育 7天, 然后将其分裂。到第3-4 天, 不同的球体应该在文化中可见。
- 仅对于介质更改, 请省略 Y-27632, 因为这只在分裂/播种时需要。
4. Iho 的维护和通过
- 为了允许逐渐解冻, 在裂开前 24小时, 在4°c 的冰桶中, 在裂隙前 24小时, 将所需体积的基底膜基质放在覆盖的冰桶中。
-
从 Iho 中取出介质, 每口用500μl 的细胞提升液 (参见材料表) 代替介质。在4°c 下孵化 40-50分钟, 此时 Iho 应漂浮在溶液中。
- 可选: 使用引擎盖成像系统仅选择具有所需形态的 Iho (参见材料表)。
- 轻轻将 iHO/cell 提升液悬浮到15毫升锥形管中, 尽量不将 Iho 拆散。让 Iho 沉淀 3-5分钟, 取出上清液和单细胞。
- 将 iHO 基培养基5毫升中的 Iho 重新拔回, 轻轻将其移液清洗。以 95 x g 离心 2分钟 。
- 在引擎盖内37°c 的板加热器上设置一个24孔板。
- 去除上清液, 并在 ~ 300-500μl 的基础生长介质中重新悬浮 Iho, 使用 P1000 移液器将 Iho 分解成较小的块。请注意, 需要应用的力将根据 iHO 线和成熟状态而有所不同, 因此请轻轻开始, 在需要时增加力。
- 将约100Μl 的 Iho (体积取决于溶液的密度) 放入基底膜基质的 1.5 mL 中, 并将移液器短暂混合。
- 将基底膜基质的1x60μl 发现24孔板的一个井, 使其凝固约 30秒, 然后在显微镜下检查密度。如果密度太低, 则在矩阵中添加更多的 Iho。
- 重复步骤 4.8, 直到获得正确的密度, 然后将矩阵的其余部分发现为24孔板。
- 将其放置在37°c 的孵化器中 10分钟, 然后用800μl 的基础生长介质覆盖它, 并具有生长因子, 如步骤3.7 所述。
-
为了准备 Iho 的入侵试验 (概述如下), 通过 iho 实验前4-5天如步骤4.1-4.10 中所述, 但放置120μl 的基质 iHO 溶液产生到5毫米玻璃底微注射盘。
- 与其把 iHO 悬浮液放在一个带有常规传递的液滴中, 不如将液滴铺在盘子的底部, 形成一层薄薄的矩阵。用2.5 毫升的基础生长培养基加生长因子覆盖它。
请注意:如果抗生素已在培养基中使用, 则必须将其去除, 代之以用于微注射实验的非抗生素补充培养基。
- 与其把 iHO 悬浮液放在一个带有常规传递的液滴中, 不如将液滴铺在盘子的底部, 形成一层薄薄的矩阵。用2.5 毫升的基础生长培养基加生长因子覆盖它。
5. 用 rhIL-22 对 Iho 进行刺激
- 在入侵试验前18小时将介质从 Iho 中吸收, 并将其替换为新鲜的碱基生长培养基 (不得含有抗生素)。
- 在培养基中加入 rhIL-22, 最终浓度为 100 ngml。
6. 微注射 Iho 和细胞内入侵检测
- 在实验的前一天, 设置s。在卢里亚-伯谷汤10毫升培养, 并在37°c 孵育与晃动。
- 在实验当天, 如果有带有封闭热室的显微镜, 请将其打开, 并在开始检测之前使温度达到37°c。
- 将 DPBS 中的隔夜细菌培养物 (含钙和镁) 稀释至2至600纳米 (OD600) 的光学密度, 然后将其与苯酚红色混合1:1。
- 将含有 Iho 的微注射盘加载到显微镜下, 取下盖子, 并将 Iho 聚焦, 准备开始注射。
- 打开喷射器和手臂控制站。确保喷油器设置为600千帕的压力和0.5秒的喷射时间。如果它还没有从显微镜阶段退去, 旋转注射臂, 以确保它是。
- 通过从针头上取下包装和塑料筒, 设置6μm 微注射钻头。从注射臂上取下手柄头。
- 用接种器的10Μl 装入钻头, 轻轻抓住钻头的钝端。将钻头放在手柄头上, 然后将其重新连接到微注射臂上。
-
轻轻地将手臂移动到位置, 使针头位于微注射盘上方1-2 厘米处。使用手臂控制将针尖放置在盘子的中心, 并将其降低, 直到它刚刚超过介质表面。
- 在所有注射后, 编程手臂控制站将针头返回到这一点。
- 将显微镜对准 Iho, 然后选择要注射的目标。将针头放置在要注射的 iHO 的正上方和右侧, 并将针头向下和侧向移动到 iHO 流明中。
- 按下微喷射器上的注射按钮;被酚状染色的细菌混合物会从针头中出现。注入每个 iHO 3x。每个条件至少注入 30个 Iho。
请注意:由于一个培养体内的 iHO 的大小和结构的异质性, 有必要注入大量的 Iho 来控制变化。 - 当所有必需的 Iho 被注入时, 将微注射板从舞台上取出, 更换盖子, 并在37°c 下孵育板90分钟。
- 90分钟后, 吸入生长介质, 代之以3毫升的细胞提升液;在4°c 孵育45分钟。
- 轻轻地将 Ihos/细胞提升溶液移动到含有5毫升 DPBS 的 15 mL 锥形管。确保所有注射的 Iho 都已从盘子中取出 (如有需要, 请用 DPBS 的1毫升冲洗板)。在 370 x g离心3分钟。
- 在 0.1 Mg/ml 时取出上清液并重新悬浮含有庆大霉素的基础生长介质中的 Iho (添加 1 mL 介质; 然后使用 P1000 移液器 ~ 50x 分解 Iho, 并添加4毫升的进一步培养基)。
- 在37°c 时孵化 1小时, 杀死细胞外细菌。
- 以 370 x g 离心 Iho 3分钟, 并吸入上清液, 留下的越少越好。用 DPBS 和离心机再次清洗 Iho 1x。
请注意:这一步去除庆大霉素, 这一点很重要, 因为任何剩余的庆大霉素一旦细胞被裂解, 都可能杀死细胞内细菌。 - 在500μl 的裂解缓冲液中重新使用 Iho (见材料表), 并通过移液 ~ 50x 手动分离有机体。将此混合物在 RT 停留5分钟。
- 在 DPBS 中将产生的溶液串行稀释 10倍, 产生10-fold、10-fold和10-fold 浓度. 将整齐和稀释的溶液滴入预热的 lb 琼脂板上的液滴3X20μl 液滴。
- 在37°c 下过夜, 对菌落形成单位 (CFU) 进行菌落计数和计算。菌落计数将反映细胞内细菌的数量, 这些细菌是在细胞裂解过程中释放的。
7. 细胞冻结和恢复
请注意:如前所述, 有可能在低温保存 Iho 并在需要时对其进行重组。冻结和解冻过程概述如下。
- 选择要冻结的 Iho 井。将细胞提升液添加到井中, 在4°c 下孵育40-50分钟。Iho 应该漂浮在解决方案中。
- 轻轻将 Iho 移入15毫升的锥形管, 使其安顿下来。取出介质, 用基础生长介质清洗 Iho 1x (无生长因子)。
-
以 95 x g离心 2分钟, 取出上清液, 并将其替换为适当体积的细胞冷冻介质 (见《材料表》; 按照制造商的说明使用该介质), 将 iho 分解成低温小瓶。
- 将小瓶存放在-80°c 的冰柜中过夜, 以便更逐步地冷冻;然后, 将它们转移到液氮储存。
-
要重建 Iho, 可在37°c 时使用水珠浴快速解冻低温小瓶;然后, 轻轻将其内容移入10毫升的基础生长介质 (无生长因子)。允许 Iho 将介质固定在约300μl 的新鲜基培养基中并将其替换。
- 不要手动离解 Iho。将 Iho 添加到基底膜基质中, 并按照第3节的描述将其装出。
Representative Results
在分化过程开始后, 细胞应通过最终内皮形成的阶段, 然后在嵌入基底膜基质之前的后肠模式。随着 Iho 的成熟, 将形成含有大量污染物质的材料的物质, 并在几周内清除含有大量污染物质的培养物。图 1显示了微分、嵌入和传递过程的典型图像。
微注射系统的设置如图 2所示。Iho 被微注射苯酚红/菌液, 并保留其红色, 允许识别受感染的 Iho, 以防止重复注射。在改良庆大霉素保护试验后, 进行细胞内细菌的计数;用 Il-22 进行预调限制s.伤寒感染, 在 rhIL-22 治疗后观察到的细胞内细菌较少 (图 3)。我们还定期处理感染的 Iho 进行免疫染色 (TEM), 以促进宿主 iec-细菌相互作用的可视化 (图 4)。
图 1: 定向 Ipsc 与 Iho 的区别.从 Ipsc 到 Iho 的代表性分化序列, 显示所观察到的形态变化和推动这些变化所需的生长因子。在分化的第4天, 在接触到活性 a、FGF、BMP-4、LY294002 和 CHR99021 的特定浓度组合后, 确定的内皮形成。8天后, 这种最终的内皮与异性浓度的智利99021和维甲酸的模式导致后肠形成。在嵌入后, 观察球体形成。在持续通过后, 在支持的基底膜基质中, 以培养基覆盖, 辅以 r-海绵菌素1、诺金、EGF、CHR99021 和前列腺素 E2, 使球体进入萌发 Iho。(图像是在4x–10x 放大倍率下拍摄的)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 微注入带有s的 iho。伤寒。(A)封闭在环境室内的微注射系统 (见材料表);这允许在受控环境 (37°c% Co-2) 中注入 Iho.(B) 细菌接种使用连接在微注射系统上的微细管直接输送到 iho 腔中。(C) 通过将细菌接种与苯酚红色混合, 可以清楚地看到哪些 iho 已被感染, 从而避免重复注射相同的 iho。这些图像是以10倍的放大倍率拍摄的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:用 Ril-22 对 Kof2 细胞系产生的 Iho 进行预处理限制了 s.伤寒 SL1344 侵入肠道上皮细胞.对于庆大霉素的保护检测, Iho 在感染前使用 100 ngml rhIL-18小时进行治疗, 或不经治疗, 并孵育90分钟。该数据是三个生物复制±扫描电镜的三个技术复制的方法。对于意义测试, 使用了曼诺-惠特尼 U 测试;p < 0.0001。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: iec 与 s. 伤寒 SL1344 的相互作用.这些面板演示注入s 的iho。伤寒 SL1344 孵育 3小时, 在固定和加工 (a) 免疫荧光或 (b)透射电子显微镜之前。在a 组中, 细菌出现在 iho 腔内, 并与上皮相互作用。核被 4 ', 6-二胺-2-苯丁酯 (DAPI) 膨胀胶 (蓝色), 细胞膜与药物蛋白 (红色), 细菌与 CSA-1 (绿色) 染色。图像以20x 的放大倍率拍摄。B小组展示了入侵后沙门氏菌的三种不同的细胞内处理途径;细菌被看见 (a) 在含沙门氏菌的液泡中, (b) 自由在细胞质之内, 和 (c) 正在接受自体吞噬。请点击这里查看此图的较大版本.
| RPMI/B27 中 | |
| 组件： | 量： |
| RPMI 1640 培养基, 补充谷氨酰胺 | 500毫升 |
| B27 无血清补充50x | 10毫升 |
| iHO 基地增长介质 | |
| 组件： | 量： |
| 先进的 DMEMM/F12 | 500毫升 |
| B27 无血清补充50x | 10毫升 |
| N2 无血清补充 100 x | 5毫升 |
| HEPES 1 M | 5毫升 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | 5毫升 |
| IHO 基础增长介质的生长因子 | |
| 组件： | 量： |
| 重组人 r-bo固定1 | 500 ngml |
| 重组人诺金 | 100 ngml |
| 表皮生长因子 (EGF) | 100 ngml |
| 前列腺素 E2 | 2.5μm |
| 智利99021 | 3微米 |
| 一水 y-27632 盐酸盐 | 10μm |
表 1: 媒体食谱。
Discussion
该协议概述了 Hipsc 与 Iho 的区别及其作为模拟肠道感染模型的效用。下面, 我们概述了协议中的关键步骤以及我们所做的任何修改或改进。
与以前出版的作品25相比, 该协议简化了 Hipsc 的差异化过程.以前使用的方法要求将 hiPSC 从其他 hiPSC 培养系统 (例如, 依赖弱的 Hapsc 培养系统) 转移到化学定义的介质----聚乙烯醇 (CDM-PVA)。这种转移到 CDM-PVA 通常需要2-3周的时间, 需要每天喂养 Hpsc。该议定书也不总是有效的, 一些区分失败;因此, 我们使用相同的生长因子进行分化试验, 但从在干细胞培养基 (而不是 CDM-PVA) 中生长的 Hpsc 开始, 并在分化天0-3 用干细胞培养基取代 CDM-PVA。这对于迄今试验的5条独立的 hiPSC 生产线来说是成功的, 使差异化过程变得更快、更高效。这也允许在分化之前对高 Psc 进行无周培养, 从而使 hiPSC 培养具有更大的灵活性。这种方法生产的 iHO 线已经表型的肠道上皮标记, 正如我们之前所描述的 Hepsc 线 Klof Klof, Yemz1 和 Lise116,似乎表型无法区分从使用前一个生产的 iho协议。
播种后, Iho 需要至少1个月的常规传代, 每4-7天进行一次分裂, 以促进成熟。请注意, 根据所使用的 iPSC 线路和初始培养的密度, iHO 的开发会有一些变化。在前几个通道中, 会有明显的污染细胞, 而这些细胞不是 Iho。这些最终会死亡, 留下一个干净的球形文化, 大约4周后, 萌发 Iho。此外, 引擎盖内成像系统可用于选择和通过所需的形态学 Iho。随着 Iho 的成熟, 它们将需要每6-7天拆分一次, 这取决于生长速度和密度。如果发生以下任何一种情况, Iho 应该在这一点之前被分割: Iho 的腔开始充满死细胞, 基底膜基质开始解体, Iho 开始从基底膜基质中生长出来, 或者培养太多 密集和媒体开始变黄非常快。
一旦 iHO 培养建立, 如果在任何时候 Iho 的外观改变或不同 (例如, 培养物仍然是球形的, 而不是发芽), 通过免疫组织化学和 qPCR 的表型细胞标记应该是重复以确保 Iho 中细胞类型 (如杯状细胞、Paneth 细胞) 的分化保持不变。如果 Iho 不再区分, 则应丢弃 iho 并对其进行重新区分或较早的 Iho 通道应解冻和重组。如果 Iho 停止区分, 潜在的原因是文化的年龄 (如果超过 6个月), 生长因子的活动 (确保这些都按照制造商的指示重组, 并冻结在小的脂肪, 以避免多个冻融周期), 过于频繁或暴力通道 (一般情况下, 通过应只发生每周一次, 如果 Iho 手动离解过于激烈的定期, 他们将停止完全区分)。
我们通过 RNA 测序确定, IL-22 在感染前18小时刺激可刺激抗菌基因和那些参与屏障防御表型的基因。在使用新的 iHsO 进行涉及白细胞介素-22 预调量的检测之前 (如果系统用于此类检测, 则使用替代细胞因子), 最好检查已知由细胞因子增强的基因的活性 (在 IL-22 的情况下), 我们使用 duox2 和lcn2) 后, 通过 qpcr 刺激 iho, 以确保受体的表达和完整的信号。在首次使用 IL-22 之前, 我们还进行了免疫组织化学, 以确定 IL-22 受体在 Iho 上的 LI-22 受体, 以确定 IL-22 受体的表达是基础的, 这意味着只需在 iHO 培养中添加 Il-22 即可实现预调。中。然而, 如果受体是顶部表达, 这个协议可能必须适应提供脂质顶部。
微注射系统的陷阱通常与注射所需针头的细腻有关。在这里, 我们使用市售的钻头, 带有6μm 流明。有可能从玻璃毛细血管26中拔出注射针, 尽管这可能不太均匀, 导致针尖泄漏或注入 iho 的体积不一致。重要的是要确保注射已经发生在 iHO 腔, 这是使用苯酚红色作为染料的原因之一;Iho 将明显地扩大和持有红色接种器, 使确定注射了哪些 Iho。偶尔针头会堵塞 iHO 墙上的碎片;如果是这种情况, 请从 iHO 内部取出针尖, 然后按微注射系统上的清洁按钮。这将产生一个短暂的较高的气压, 这应该可以清除堵塞。这也会导致细菌接种物在板上出现一些泄漏;因此, 如果发生这种情况, 应在所有板材上重复清洁操作, 以确保每个板材的细菌接种平等。Hispc 衍生 Iho 的一个大优点是它们的尺寸。来自小鼠的肠道有机体和原代人的有机体要小得多 (分别测量约100μm 和 100-300μm, 27, 而对 hipscc 衍生的 iho 为250-1500 微米), 这意味着大量注射有机体的速度会变慢。这使得在高 pscc 衍生的 Iho 中进行了更大规模的注射实验。还可以通过在感染后采集 Iho 并手动将其分离到 DPBS 中, 释放其腔内内容来研究 Iho 的腔内内容。对于微注射, 我们建议使用高浓度的细菌。我们发现, 浓度较低不足以从构成 Iho 的 IHOs 中产生反应。此外, 很难随后使用显微镜定位内化细菌。可能需要针对不同的细菌菌株进行优化。
总之, hiPSC-derived 衍生的 Iho 提供了一个很有希望的模型, 直接剖析上皮反应对肠道感染, 无论是通过研究细胞内的侵袭计数, 成像, 测量细胞因子水平在 iHO 上清液, 或收获 RNA研究接触病原体后的转录变化。它们在未来的效用将更加明显, 以建立人类受限病原体的感染模型, 并通过研究与疾病有关的具体基因突变, 利用利用这一技术进行个性化研究的可能性和药物反应。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了威康信托、盖茨基金会和剑桥生物医学研究中心的资助。E. a. l. 是由 Wellcome 信托基金支持的临床博士生。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 5 mm glass bottom injection dishes | MatTek corporation | P50G-0-14-F | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Alexa fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A22287 | Use at 1:1,000 concentration |
| B27 serum-free supplement | Life Technologies | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| BMP-4 recombinant human protein | R&D | PHC9534 | Stock concentration 10 μg/mL, final concentration 10 ng/mL |
| Cell recovery solution (cell lifting solution) | BD | 354253 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890-5mg | Stock concentration 3 mM, final concentration 3 µM |
| Collagenase, type IV powder | Life Technologies | 17104019 | Reconstitute at 0.1% |
| Corning cryogenic vials | Corning | 430487 | |
| Costar TC treated 24 well culture plates | Corning | CLS3527 | |
| DAPI dilactate | Sigma-Aldrich | D9564-10MG | Use at 10 nM concentration |
| Dulbecco’s PBS (No MgCl2 or CaCl2) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Dulbecco’s PBS (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662-100ML | |
| Epidermal growth factor | R&D | 236-EG-200 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system) | Eppendorf | 920000011 | |
| Eppendorf Femtojet express (microinjection system) | Eppendorf | 5248 000.017 | |
| Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium) | Life Technologies | A2858501 | |
| EVOS XL imaging system (in-hood imaging system) | |||
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272-10ML | Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL |
| Goat anti-Salmonella, CSA-1 | Insight Biotechnology | 02-91-99 | Use at 1:20 concentration |
| HEPES 1 M | Life Technologies | 15630056 | |
| KnockOut Serum Replacement (setrum replacment) | Gibco | 10828010 | |
| GlutaMAX supplement (glutamine supplement | ThermoFisher | ||
| L-glutamine | Life Technologies | A2916801 | Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM |
| LY294002 | Promega UK | V1201 | Stock concentration 50 mM, final concentration 10μM |
| Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 | |
| MEM non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140035 | |
| N2 serum-free supplement | Life Technologies | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140163 | Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25° tip angle, 6 µm inner diameter | Eppendorf | 5195000087 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma | P0409-1MG | Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM |
| Recombinant human FGF basic | R&D | 233-FB-025 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human IL-22 | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | R&D | 6057-NG-100 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recombinant human R-spondin1 | R&D | 4645-RS-025 | Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | R&D | 338-AC-050 | Stock concentration 100 μg/mL, final concentration 100 ng/mL |
| Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium) | Gibco | 12648010 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Stock concentration 3 μM, final concentration 3 mM |
| RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement) | Life Technologies | 61870010 | |
| Triton X-100 (cell lysis buffer) | Sigma-Aldrich | RES9690T-A101X | Use at 1% concentration |
| Versene (EDTA solution) | Life Technologies | 15040066 | |
| Vitronectin XF | Stemcell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 dihydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM |
References
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
- Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
- Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
- Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
- Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K.
- Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
- Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
- Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
