Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي

Published: September 13, 2019 doi: 10.3791/59676
Automatic Translation
1, 2, 1, 3,4
1Department of Genetics, Cell Biology and Anatomy, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet, 3Department of Mechanical and Materials Engineering, University of Nebraska-Lincoln, 4Nebraska Center for Materials and Nanoscience, University of Nebraska-Lincoln

Summary

توفر هذه المقالة طرق مفصلة لتلفيق وتوصيف جهاز microfluidic التشغيل الهوائي لضغط الخلايا الغضروفية.

Abstract

ومن المعروف أن المحفزات الميكانيكية لتعديل الوظائف البيولوجية للخلايا والأنسجة. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن الإجهاد الضاغط يغير بنية غضروف لوحة النمو والنتائج في تعديل النمو من عظام طويلة من الأطفال. لتحديد دور الإجهاد الضاغط في نمو العظام، أنشأنا جهاز microfluidic تعمل بواسطة الضغط الهوائي، لضغط ديناميكيا (أو ثابت) خلايا chondrocytes لوحة النمو جزءا لا يتجزأ من اسطوانات هيدروجيل الجينات. في هذه المقالة، ونحن نصف الطرق التفصيلية لتلفيق وتميز هذا الجهاز. مزايا بروتوكولنا هي: 1) خمسة أحجام مختلفة من الإجهاد الضغط يمكن أن تولد على خمسة تكرارات التقنية في منصة واحدة، 2) فمن السهل تصور مورفولوجيا الخلية عن طريق المجهر الضوء التقليدي، 3) يمكن عزل الخلايا بسرعة من الجهاز بعد الضغط لتسهيل الاختبارات المصب، و 4) يمكن تطبيق منصة لدراسة الميكانيكية من أي نوع الخلية التي يمكن أن تنمو في هيدروجيلس.

Introduction

المنصات ذات الهندسة الدقيقة هي أدوات قيمة لدراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية ومستوى الأنسجة لأنها تمكن السيطرة الديناميكية على كل من البيئات الدقيقة الفيزيائية والكيميائية1،2،3 ،4،5،6،7،8. وهكذا، يمكن اختبار فرضيات متعددة في وقت واحد بطريقة تسيطر عليها بإحكام. في حالة نمو الغضروف لوحة، وهناك أدلة متزايدة على دور مهم من الإجهاد الضغط في تحوير نموالعظام من خلال العمل على نمو لوحة الغضروف9،10،11، 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21،22،23،24،25. ومع ذلك، فإن آلية عمل الإجهاد الضغطي - على وجه الخصوص، كيف يوجه الإجهاد تشكيل أعمدة الخلايا الغضروفية في لوحة النمو - غير مفهومة بشكل جيد.

والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء جهاز ضغط chondrocyte microfluidic تعمل هوائيا26 لتوضيح آليات الميكانيكا في الخلايا الغضروفية لوحة النمو (الشكل 1أ-ج). يتكون الجهاز من جزأين: وحدة التشغيل الهوائية وبنية هلام الجينات. يتم تصنيع وحدة التشغيل الهوائية microfluidic باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS) على أساس التصوير والطباعة الحجرية الناعمة. تحتوي هذه الوحدة على مجموعة 5 × 5 من بالونات غشاء PDMS رقيقة والتي يمكن تضخيمها بشكل مختلف على أساس أقطارها. يتكون بناء هلام الجينات من الخلايا الغضروفية المضمنة في مجموعة 5 × 5 من اسطوانات هلام الجينات، ويتم تجميع بنيات الجينات والخلايا الغضروفية بأكملها مع وحدة التدجين. يتم ضغط المنشآت هلام الجينات بواسطة بالونات PDMS تضخم هوائيا(الشكل 1b). الجهاز microfluidic يمكن أن تولد خمسة مستويات مختلفة من الإجهاد الضغط في وقت واحد في منصة واحدة على أساس الاختلافات في قطر بالون PDMS. وهكذا، من الممكن إجراء اختبار عالي الإنتاجية للميكنة في الخلايا الغضروفية في ظل ظروف ضغط متعددة.

الجهاز microfluidic الموصوفة في هذا البروتوكول لديها العديد من المزايا على جهاز الضغط التقليدية مثل المثبتات الخارجية14،21،23 وأجهزة الضغط العيانية16، 19 سنة , 27 , 28 لدراسة الميكانيكا chondrocyte: 1) الجهاز microfluidic فعالة من حيث التكلفة لأنه يستهلك حجم أصغر من العينات من جهاز ضغط العيان، 2) الجهاز microfluidic هو الوقت الفعال لأنه يمكن اختبار متعددة ظروف الضغط في وقت واحد، 3) الجهاز microfluidic يمكن الجمع بين المحفزات الميكانيكية والكيميائية عن طريق تشكيل تدرج تركيز المواد الكيميائية على أساس خلط محدود في القنوات الدقيقة، و 4) تقنيات الفحص المجهري المختلفة (الفاصل الزمني يمكن تطبيق الفحص المجهري والفلورة المجهرية البؤرية) مع الجهاز microfluidic مصنوعة من PDMS شفافة.

اعتمدنا وعدلنا طريقة Moraes وآخرون7،29 لخلق مستويات ضغط مختلفة في جهاز واحد لتمكين الدراسات الميكانيكية عالية الإنتاجية من ضغط الخلايا الغضروفية. نهجنا مناسب للخلايا (على سبيل المثال، chondrocytes) التي تحتاج إلى بيئة ثقافية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) وللاختبارات البيولوجية بعد ضغط الخلايا. على الرغم من أن بعض أجهزة ضغط الخلايا الدقيقة يمكن ضغط الخلايا المستزرعة على ثنائي الأبعاد (2D) ركائز30،31،32،لا يمكن استخدامها لchondrocytes لأن الخلايا الغضروفية المستزرعة 2D إزالة التمييز. هناك منصات microfluidic لضغط الخلايا المستزرعة 3D في هيدروجيلات ضوئية7،33، لكنها محدودة في عزل الخلايا بعد تجارب الضغط لأن عزل الخلايا من البلمرة الضوئية هيدروجيل ليس من السهل. وبالإضافة إلى ذلك، قد يلزم تقييم آثار التعرض للأشعة فوق البنفسجية وبادئات الربط بين الصور على الخلايا. وعلى النقيض من ذلك، تسمح طريقتنا بالعزل السريع للخلايا بعد تجارب الضغط لاختبارات ما بعد البيولوجيا لأن هيدروجيلات الجينات يمكن أن تكون منزوعة البوليمر بسرعة من قبل مخلب اتلاف الكالسيوم. ويرد في هذا البروتوكول وصف لأساليب تصنيع الأجهزة المفصلة وتوصيفها. يظهر في الشكل 2إجراء موجز لتلفيق جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) مثل القفازات ومعطف المختبر لكل خطوة في هذا البروتوكول.

1. ماجستير تصنيع العفن 2.

ملاحظة: تنفيذ الخطوة 1.1 -1.3 في غطاء محرك الدخان.

  1. علاج الزجاج
    ملاحظة: ارتداء درع الوجه والقفازات ومعطف المختبر للخطوة 1.1.
    1. جعل محلول البيرانا (60 مل) عن طريق خلط حمض الكبريتيك (H2SO4)وبيروكسيد الهيدروجين (H2O2)مع نسبة حجم 3:1.
      تحذير: لا تستخدم محلول بيرانا والأسيتون في نفس غطاء الدخان بسبب خطر الانفجار.
    2. ضع لوحة زجاجية (50.8 مم × 76.2 مم × 1.2 مم) في محلول بيرانا لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
    3. شطف لوحة الزجاج مع الماء منزوع الأيونات (diH2O).
    4. ضع اللوحة الزجاجية في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. شطف لوحة الزجاج مع إيزوبروبانول وتجفيفها مع النيتروجين (N2)الغاز.
    6. تخبز لوحة الزجاج في 200 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على طبق ساخن. تستخدم جميع خطوات الخبز اللاحقة طبقًا ساخنًا.
  2. SU-8 تشكيل طبقة البذور على لوحة زجاجية
    1. نشر SU-8 5 على لوحة زجاجية مع ماصة المتاح لتغطية حوالي 2/3 من مساحة سطح اللوحة.
    2. تدور لوحة الزجاج مع SU-8 5 مقاومة للضوء في 500 دورة في الدقيقة لمدة 35 ق (دورة الغزل الأولية) ثم 2500 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق (دورة الغزل النهائي) باستخدام معطف تدور. وتشمل جميع الخطوات اللاحقة طلاء تدور نفس دورة الغزل الأولية.
    3. خبز SU-8 5 لوحة الزجاج المغلفة في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. فضح SU-8 5 لوحة الزجاج المغلفة إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية (60 mW/cm2،المسافة بين مصباح الأشعة فوق البنفسجية وقناع الضوء هو 20 سم، والمبلغ الإجمالي للطاقة الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة = 60 mJ/cm2)ل1 s.
      ملاحظة: يجب تعديل وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية وفقا لقوة ضوء الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة.
    5. خبز SU-8 5 لوحة الزجاج المغلفة في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وعلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. ضع طبق الزجاج المخبوز في مطور SU-8 لمدة دقيقتين.
    7. خبز SU-8 5 الزجاج المغلفة في 180 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. SU-8 قناة نمط تصنيع باستخدام التصوير الضوئي (الشكل 2a الخطوة 1-3)
    1. صب SU-8 100 على SU-8 5 لوحة الزجاج المصنفة لتغطية حوالي 2/3 من مساحة سطح اللوحة.
    2. تدور لوحة الزجاج مع SU-8 100 في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 38 ثانية (، 90 ميكرومتر سميكة).
    3. خبز SU-8 100 لوحة الزجاج المغلفة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا SU-8 100 لا تزال لزجة بعد هذا الإجراء، خبز لوحة زجاجية لفترة أطول في 95 درجة مئوية حتى SU-8 100 يصبح غير لزجة.
    4. وضع قناع ضوئي عالي الدقة ميكروتشانال (25400 نقطة في البوصة، انظر الشكل التكميلي 1)على لوحة الزجاج المغلفة SU-8 100 وفضح قناع الضوء لوحة الزجاج المغطاة للأشعة فوق البنفسجية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 ق (الكمية الإجمالية للطاقة الخفيفة للأشعة فوق البنفسجية = 240 mJ/cm2).
      ملاحظة: يجب تعديل وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية وفقا لقوة ضوء الأشعة فوق البنفسجية المستخدمة.
    5. إزالة قناع ضوئي من لوحة الزجاج وخبز لوحة زجاجية في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. الحفاظ على لوحة الزجاج المخبوز في وعاء، والتي هي ملفوفة مع رقائق الألومنيوم لمنع أي ضوء، لعلاج بين عشية وضحاها.
    7. تطوير SU-8 100 أنماط قناة على لوحة زجاجية في المطور SU-8 لمدة 15 دقيقة.
    8. اغسل اللوحة الزجاجية المنقوشة SU-8 (القالب الرئيسي) مع كحول الإيزوبروبيل وجففه بغاز N2. إذا بقيت الجسيمات البيضاء أثناء هذه العملية، كرر الخطوة 7 لمدة 5 دقائق.

2. وحدة التشغيل الهوائية

  1. طبقة القناة الدقيقة (الطبقة 1)
    ملاحظة: تنفيذ الخطوة 2.1.1 -2.1.2 في غطاء محرك الدخان.
    1. إسقاط 200 درجة مئوية من (Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane على غطاء ووضعها في غرفة فراغ مع القالب الرئيسي.
    2. تطبيق فراغ لمدة 2 دقيقة في الغرفة والانتظار لمدة 6 ساعة (أو بين عشية وضحاها) لsilanization من القالب.
    3. مزيج PDMS مع نسبة الوزن من 10:1 (ما قبل البوليمر: عامل علاج) لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تحتوي كافة خطوة الصب PDMS اللاحقة على نفس نسبة وزن عامل ما قبل البوليمر والمعالجة (10:1).
    4. صب PDMS على القالب الرئيسي وDEGAS PDMS في غرفة فراغ لمدة 30 دقيقة.
    5. ساندويتش PDMS مع قطعة من فيلم الشفافية.
    6. المشبك الجمعية المذكورة أعلاه مع لوحة زجاجية، ومنصات رغوة ولوحات زجاج شبكي(الشكل 2a الخطوة 4).
    7. علاج PDMS في فرن في 80 درجة مئوية لمدة 6 ساعة.
    8. عزل طبقة PDMS (الطبقة 1) مع فيلم الشفافية من هيكل تقع(الشكل 2a الخطوة 5).
    9. قم بتنشيط أسطح الطبقة 1 ولوحة زجاجية نظيفة (لوحة زجاجية 1؛ 50.8 مم × 76.2 مم × 1.2 مم) باستخدام منظف بلازما لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: قد يختلف وقت تنظيف البلازما استنادًا إلى قوة منظف البلازما المستخدم.
    10. طبقة السندات 1 على لوحة زجاجية 1 ووضعها في الفرن في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    11. قم بإزالة فيلم الشفافية من الطبقة 1.
  2. غشاء PDMS رقيقة (طبقة 2)
    1. تدور معطف PDMS غير المعالجة على فيلم الشفافية في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة للحصول على طبقة PDMS سميكة 60 ميكرومتر.
    2. علاج جزئي تدور المغلفة PDMS (طبقة 2) في الفرن في 80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
    3. قم بتنشيط الطبقة 1 على اللوحة الزجاجية 1 والطبقة 2 باستخدام منظف البلازما لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: قد يختلف وقت تنظيف البلازما استنادًا إلى قوة منظف البلازما المستخدم.
    4. ربط الطبقة 2 على الطبقة 1 ووضعها في الفرن في 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. كتلة الأنابيب
    1. وضع أنابيب معدنية عموديا على طبق بيتري.
    2. صب بلطف PDMS في الطبق لغمر حوالي 3/4 من الأنابيب المعدنية.
    3. علاج PDMS في الفرن في 60 درجة مئوية لمدة 6 ساعة (أو بين عشية وضحاها).
    4. قطع قطعة من كتلة PDMS تحتوي على أنبوب معدني واحد.
    5. لكمة حفرة على طبقة 2 للمدخل.
    6. قم بتنشيط كتلة PDMS والطبقة 2 باستخدام منظف البلازما لمدة دقيقة واحدة.
    7. يُرفق كتلة PDMS بجزء مدخل الطبقة 2 ونضع وحدة التدجين بأكملها في الفرن عند درجة حرارة 80 درجة مئوية طوال الليل.

3. الجينات-chondrocyte (أو حبة) يبني

  1. لوحة زجاجية من الأمينية
    1. قطع لوحة زجاجية (50.8 مم × 76.2 مم × 1.2 مم) إلى لوحتين زجاجيتين نصف حجم (50.8 مم × 38.1 مم × 1.2 مم) باستخدام كاتب ألماس.
    2. ضع الصفائح الزجاجية في 0.2 M كلوريد الهيدروجين (حمض الهيدروكلوريك) ويهز بلطف (على سبيل المثال، 55 دورة في الدقيقة) لهم بين عشية وضحاها.
    3. شطف لوحات الزجاج مع diH2O.
    4. هز الصفائح الزجاجية في هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M (هيدروكسيد الصوديوم) لمدة ساعة واحدة في 55 دورة في الدقيقة وشطفها مع diH2O.
    5. هز الصفائح الزجاجية في 1٪ (V / V) 3-أمينوبروبيلتريميثوكسيسيلين (APTES) لمدة ساعة واحدة في 55 دورة في الدقيقة وشطفها مع diH2O.
    6. تجفيف لوحات الزجاج الأمينية silanized في غطاء الدخان بين عشية وضحاها.
  2. قالب جل أغاروز لبنيات جل الجينات
    1. مزيج 5٪ (ث / الخامس) أغاروز و 200 مل كلوريد الكالسيوم (CaCl2)في diH2O.
    2. اغلي محلول جل أغاروز مع فرن ميكروويف (أو طبق ساخن). يختلف وقت الغليان على أساس حجم محلول هلام أغاروز وقوة فرن الميكروويف (أو درجة حرارة الطبق الساخن).
    3. صب محلول هلام أغاروز المسلوق على قالب الألومنيوم (انظر الشكل التكميلي S2)،وشطيرة مع لوحة زجاجية.
    4. انتظر لمدة 5 دقائق وunmold هلام أجاروز الصلبة من قالب الألومنيوم.
  3. حصاد الخلايا الغضروفية لوحة النمو
    1. عزل لوحات النمو من الأطراف الخلفية للفئران حديثي الولادة.
    2. ضع لوحات النمو في 1 مل من 0.25٪ كولاجيناز لمدة 3 ساعة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 8٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2)،لإزالة مصفوفة خارج الخلية (ECM).
    3. طرد مركزي العينة المهضومة لمدة 5 دقائق في 125 × ز لجعل بيليه chondrocyte وإزالة supernatant من العينة. هنا، 1 × ز هو تسارع الجاذبية.
    4. إعادة تعليق بيليه chondrocyte في 1 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM).
    5. عد عدد الخلايا الغضروفية في DMEM باستخدام عداد الخلية.
    6. الطرد المركزي chondrocytes في DMEM لمدة 5 دقائق في 125 × ز لجعل بيليه chondrocyte مرة أخرى وإزالة supernatant من العينة.
    7. اختياريا، إعادة تعليق بيليه chondrocyte في وسائل الإعلام ثقافة chondrocyte (CCM)34 التي تحتوي على 2 μM calcein AM، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. إعادة تعليق بيليه chondrocyte في الحجم المطلوب من CCM والاحتفاظ بها في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 8٪ CO2 قبل الاستخدام.
  4. الجينات-chondrocyte (أو حبة) يبني (الشكل 2ج)
    1. مزيج 1.5٪ (ث / الخامس) الجينات في محلول ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) مع 5 ملغ / مل من سلفو-NHS، 10 ملغ / مل من 1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروكلوريد كاربوديميدي (EDC).
    2. إضافة 8 × 106 chondrocytes في 1 مل من محلول هلام الجينات [أو إضافة 3 ميكرولتر من 1 ميكرومتر قطر الخرز الفلورسنت (542/612 نانومتر) في 1 مل من محلول هلام الجينات (0.3٪ (V / V))].
    3. ضع 150 ميكرولتر من محلول الجينات-chondrocyte (أو حبة) على لوحة الزجاج الأمينية الحلقي ة المصنعة في الخطوة 3.1.
    4. قم بتغطية محلول جل الجينات مع قالب جل أغاروز لمدة 3 دقائق.
    5. إزالة محلول هلام الجينات المفرطة تفيض من قالب هلام أغاروز مع شفرة الحلاقة وإزالة قالب هلام أغاروز. ثم، يتم الحصول على البنايات الجينات-chondrocyte أسطواني (أو حبة) على لوحة الزجاج الأمينية silanized.
    6. ضع البنى الجينات-chondrocyte في حل عبر ربط (50 مل CaCl2 / 140 مل NaCl في diH2O) لمدة دقيقة واحدة لمزيد من البلمرة.

4. تجميع الجهاز (الشكل 2D)

ملاحظة: يجب إعداد فواصل PDMS والمشابك المطبوعة ثلاثية الأبعاد بشكل منفصل.

  1. حدد موقع أربعة فواصل PDMS سميكة 1 مم على الزوايا الأربعة للطبقة 2 من وحدة العمليات.
  2. ضع 700 ميكرو لتر من CCM لتغطية غرف الهواء من الطبقة 2.
  3. ضع البناينات-chondrocyte (أو حبة) يبني على الطبقة 2 في حين محاذاة بعناية المنشآت مع غرف الهواء.
  4. المشبك الجهاز مع المشابك المطبوعة 3D(الشكل 1c).

5. تشغيل الجهاز

  1. توصيل منفذ مضخة الهواء (انظر جدول المواد)مع مدخل صمام الملف اللولبي مع أنابيب السيليكون.
  2. قم بتوصيل منفذ الصمام اللولبي بمدخل الجهاز المجمع مع أنابيب السيليكون.
  3. قم بتوصيل الصمام الملف اللولبي بمولد للوظائف.
  4. التعامل مع صمام الملف اللولبي مع موجة مربعة (على سبيل المثال، 1 هرتز) ولدت من قبل مولد وظيفة.
  5. تشغيل مضخة الهواء لتشغيل الجهاز هوائيا.

6. تصوير الخلايا الغضروفية في الجهاز

ملاحظة: للحصول على جودة صورة جيدة، صورة chondrocytes (أو الخرز الفلورسنت) في هلام الجينات من خلال لوحة زجاجية 2 لأن البالونات PDMS الموسعة وغرف الهواء يمكن تشويه الصور البصرية. إذا تم استخدام المجهر المقلوب للتصوير، يحتاج الجهاز إلى الإعداد بحيث يواجه لوحة الزجاج 2 لأسفل.

  1. إعداد الجهاز مع chondrocytes (أو الخرز الفلورسنت) كما هو مبين في الأقسام السابقة.
  2. التقاط صور z-كومةمن chondrocytes (أو الخرز الفلورسنت) مع المجهر البؤري قبل وتحت الضغط، على التوالي. اختر حجم خطوة zاستنادًا إلى عمق حقل نظام التصوير البؤري المستخدم.
  3. يمكن قياس ارتفاع chondrocytes (أو بناء حبة الجينات) مع طريقة معالجة الصور التلقائية المبينة في الكتابات السابقة26،35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تُظهر هذه المقالة خطوات تفصيلية لتصنيع جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة(الشكل 2). يحتوي الجهاز على صفائف 5 × 5 من البنيات الجناجية-chondrocyte أسطواني، ويمكن ضغط هذه المنشآت مع خمسة أحجام مختلفة من الضغط(الشكل 1، الشكل 3 والشكل 4). ويبلغ ارتفاع القناة الدقيقة الهوائية حوالي 90 ميكرومتر، وتكون أقطار بالون PDMS 1.2 و1.4 و1.6 و1.8 و2.0 مم على التوالي. تم تحديد أداء الجهاز كمياً بالفحص المجهري البؤري مع ظروف الضغط الثابت ة ومعالجة الصور. تم استخدام ضغط ثابت للتصوير المجهري لأن التصوير z-stackمع الفحص المجهري البؤري يستغرق بضع دقائق، لذلك فهو بطيء جدا ً للتصوير الكمي أثناء الضغط الديناميكي.

الشكل 3a يظهر 5 × 5 صفائف من أعمدة هيدروجيل الجينات (القطر: ~ 0.8 ملم، الارتفاع: ~ 1 مم) يلقي على لوحة زجاجية 2. وقد تم تصوير هذه المنشآت هلام عن طريق إضافة الخرز الفلورسنت في هلام. ويبين الشكل 3ب حالة مثال على أن عمود الجل قد تم ضغطه بنسبة 33.8 في المائة في الارتفاع بواسطة أكبر بالون PDMS. زادت السلالة الضاغطة الناتجة من البنى الهلامية بحوالي 5% لكل زيادة قدرها 0.2 مم في قطر بالون PDMS كما هو موضح في الشكل 3c.

تم تحديد تشوه ضغط يُظهر الخلايا الغضروفية من خلال تصوير الخلايا في 613 ميكرومتر × 613 ميكرومتر × 40-55 ميكرومتر(x × y × z)حجم بالقرب من مركز بناء الجل كما هو موضح في الشكل 4a. يظهر الشكل 1d صورة على سبيل المثال من chondrocyte التي تم ضغطها بنسبة 16٪ من قبل أكبر بالون PDMS. ويبين الشكل 4ب توزيع قيم إجهاد ضغط الخلايا المقاسة، وتم ضغط الخلايا الإجمالية بمزيد من البالونات PDMS. لذلك، تم التحكم في كمية هلام الجينات وضغط chondrocyte من قبل قطر بالونات PDMS(الشكل 3 والشكل 4)مع ضغط مستمر من 14 كيلوباسكال.

Figure 1
الشكل 1 جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة.
(أ)مخطط الجهاز المجمع. وهناك مجموعة 5 × 5 من البنى الجينات-chondrocyte محاذاة على بالونات PDMS مع 5 أقطار مختلفة(D = 1.2، 1.4، 1.6، 1.8 و 2.0 ملم)، حيث D هو قطر بالون PDMS (أو غرفة الهواء). (ب)مخطط عملية الجهاز. يتم تشغيل الجهاز عن طريق الضغط الهوائي الذي يوسع بالونات PDMS. (ج)صورة جهاز فعلي (قطر العملة = 19 مم). (د)المقاطع العرضية العمودية للخلايا الغضروفية قبل (يسار) وتحت (يمين) الضغط على أكبر بالون PDMS(D = 2.0 مم) (سلالة ضغط الخلية،الخلية = |تغيير ارتفاع الخلية/ارتفاع الخلية الأولي | x 100 = 16٪). هذا الرقم مستنسخ من 26.

Figure 2
الشكل 2 خطوات مفصلة من تصنيع جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة.
(أ)التصوير الضوئي لتوليد قالب رئيسي SU-8 وبعد الطباعة الحجرية الناعمة لإنشاء طبقة PDMS مع القنوات الدقيقة الهوائية (الطبقة 1). (ب)غشاء PDMS رقيقة (طبقة 2) على فيلم الشفافية التي تولدها طلاء تدور. (ج)أسطواني الجينات هلام طريقة الصب على الزجاج (لوحة زجاجية 2). (د)الجمعية من جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة. هذا الرقم مستنسخ من 26. الرجاء النقر هنا لتحميل نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 قياس تشوه هلام الجينات تحت ضغط ثابت.
(أ)5 × 5 صفائف من المنشآت هلام الجينات أسطواني (قطرها: ~ 800 درجة مئوية، الارتفاع: ~ 1 ملم). (ب)جل الجينات مضغوط بواسطة أكبر بالون PDMS(D = 2.0 مم). السلالة الضاغطة من هلام الجينات هو 33.8٪. (ج)سلالة الضغط من هلام الجينات(هلام)يزيد حوالي 5٪ لكل زيادة 0.2 ملم من قطر بالون PDMS(D). شريط الخطأ: الانحراف المعياري. الخط الأحمر: خط تركيب خطي هذا الرقم مستنسخ من 26.

Figure 4
الشكل 4 قياس تشوه الخلايا الغضروفية تحت ضغط ثابت.
(أ)تم الحصول على صورة z-stack[613 μm × 613 μm × 40-55 μm(x × y × z)]في منتصف بناء الجل، 300-400 ميكرومتر من قاع الجل. (ب)أدت أحجام مختلفة من سلالةضغط الخلايا الغضروفية(الخلية)كدالة لقطر بالون PDMS(D). Icon يعني القيم. Icon كل نقطة بيانات. أعلى (أو أسفل) والخطوط الوسطى من المربع هي الانحراف المعياري والقيمة الوسيطة، على التوالي. هذا الرقم مستنسخ من 26.

الشكل S1. تصميم قناع ضوئي ميكروتشانت للخطوة 1.3.4 (وحدة = مم). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S2. الألومنيوم تصميم قالب للخطوة 3.2.3 (وحدة = مم). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل S3. تشوه دائم من هلام الجينات (1.5٪، ث / الخامس) تحت 1 ح طويلة ديناميكية (1 هرتز) وضغط ثابت. هذا الرقم مستنسخ من 26. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لاختبار آثار الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية لوحة النمو، قمنا بتطوير جهاز ضغط الخلايا الغضروفية الدقيقة(الشكل 1)لتطبيق مستويات مختلفة من الإجهاد الضاغط على الخلايا الغضروفية في سقالة هيدروجيل الجينات ل3D الثقافة بطرق الإنتاجية العالية. لمساعدة الباحثين الآخرين على اعتماد جهازنا أو تطوير أجهزة مماثلة، قدمنا تفاصيل خطوات تصنيع الجهاز في هذه المقالة البروتوكولية.

الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي 1) تلفيق طبقة PDMS مع microchannels الهوائية (الطبقة 1) دون أي فقاعات الهواء منذ فقاعات الهواء في الطبقة 1 قد تضر القنوات الصغيرة الهوائية في حين يتم تقشير فيلم الشفافية دعم قبالة، 2) الحفاظ على درجة حرارة ثابتة (على سبيل المثال، 80 درجة مئوية) لعلاج بالونات PDMS (الطبقة 2) لأن مرونة PDMS من المعروف أن تعتمد على درجة حرارة المعالجة36،3) محاذاة المنشآت هلام الجينات مع بالونات PDMS، و 4) باستخدام الزجاج الطازجة الأمينية silanized لوحة (لوحة زجاجية 2) لربط أعمدة هلام الجينات على لوحة زجاجية 2 في غضون يومين بعد العلاج الملوحة.

الحد الرئيسي من هذا البروتوكول هو أنه من كثيف العمالة نسبيا لتلفيق الجهاز لأن العملية تنطوي على التصوير الضوئي وخطوات متعددة من الطباعة الحجرية لينة. بالإضافة إلى ذلك، فإن أداء أجهزة ضغط الخلايا الدقيقة الملفقة على أساس بروتوكولنا يحتاج إلى تقييم كلما تم استخدام أنواع مختلفة من هيدروجيلز والخلايا. ويرجع ذلك إلى أن أي اختلافات في الخصائص الميكانيكية للهيدروجيلات والخلايا سوف تؤثر على أداء الجهاز.

على الرغم من أن جهاز ضغط الخلايا الدقيقة لدينا هو لتطبيق الضغط الديناميكي على الخلايا الغضروفية، تم تقييم أدائها عن طريق تصوير المواد الهلامية والخلايا الجينات المضغوطة بشكل ثابت. ويرجع ذلك إلى أنه كان من الصعب صورة المواد الهلامية والخلايا تحت ضغط ديناميكي مع الفحص المجهري البؤري التقليدي. قارنا ثابت (14 كيلوباسكال، 1 ساعة) وضغط ديناميكي (14 كيلوباسكال، 1 هرتز، 1 ساعة) من حيث تشوه دائم من هلام الجينات ووجدت أن تشوه دائم من هلام تحت ضغط ديناميكي كان لا يذكر بالمقارنة مع ضغط ثابت (انظر الشكل التكميلي S3).

ميزة واحدة من طريقتنا هو أنه يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى التي تحتاج إلى بيئة الثقافة 3D. يمكن تعديل الضغط الناتج للجهاز اعتمادا على التطبيقات عن طريق تغيير قطر وسمك بالونات PDMS و / أو الضغط في البالون. ومن الممكن أيضا تعديل مرونة بالون PDMS عن طريق ضبط نسبة الخلط بين ما قبل البوليمر وعامل المعالجة. يمكن تصوير الخلايا في هذا الجهاز في الوقت الحقيقي باستخدام الفحص المجهري الخفيف/الفلوري، ويمكن تفكيك الجهاز بسرعة لحصاد الخلايا لتمكين التحليل في المصب. ميزة أخرى هي القدرة على توليد خمسة مستويات الإجهاد الميكانيكية متميزة مع خمسة تكرار التقنية لكل مستوى الإجهاد باستخدام جهاز واحد. الجمع بين النسخ المتماثل وتحليل الجرعة والاستجابة يضمن درجة عالية من الصرامة والتكرار في النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتورين كريستوفر مورايس وستيفن أ. مورين على دعمهما لتصميم الأجهزة وتصنيعها. وقد تم دعم هذه الدراسة بمنحة الهندسة الحيوية للصحة البشرية من جامعة نبراسكا لينكولن (UNL) والمركز الطبي لجامعة نبراسكا (UNMC)، ومنحة AR070242 من المعهد الوطني للصحة/نظام المعلومات الوطني. نشكر جانيس أ. تايلور وجيمس ر. تالاسكا من المرفق الأساسي للميكروسكوب المتقدم في المركز الطبي لجامعة نبراسكا على تقديم المساعدة في الفحص المجهري البؤري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) Sigma-Aldrich 741442-100ML
(Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane United Chemical Technologies T2492-KG
Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K354
Air pump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use.
Alginate powder FMC Corporation Pronova UP MVG
Barb Straight Connectors (Metal tube) Pneumadyne EB40-250
Calcein AM Invitrogen C3100MP
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Dyed red aqueous fluorescent particles Thermo Fisher Scientific R0100
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) Thermo Fisher Scientific 22980
Foam pad GRAINGER Item # 5GCE8
Function / Arbitrary Waveform Generator Keysight Technologies 33210A
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500
Hydrogen peroxide Fisher BioReagents BP2633500
Isopropyl alcohol BDH1174-4LP VWR
Microscope slides Thermo Fisher Scientific 22-267-013
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Power supply Keysight Technologies E3630A
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium hydroxide Fisher Chemical S318-1
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Solenoid valve Pneumadyne S10MM-30-12-3
Spin coater Laurell Technologies WS-650Mz-23NPPB
SU8 Developer MicroChem Corp. Y020100 4000L1PE
SU8-100 MicroChem Corp. Y131273 0500L1GL
SU8-5 MicroChem Corp. Y131252 0500L1GL
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) Thermo Fisher Scientific 24510
Sulfuric acid EMD Millipore MSX12445

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
  2. Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
  3. Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
  4. García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  5. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  6. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
  7. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
  8. Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
  9. Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
  10. Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
  11. Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
  12. Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
  13. Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
  14. Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
  15. Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
  16. Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
  17. Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
  18. Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
  19. Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
  20. Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
  21. Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
  22. Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
  23. Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
  24. Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
  25. Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
  26. Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
  27. Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
  28. Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
  29. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
  30. Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
  31. Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
  32. Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
  33. Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
  34. Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
  35. Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
  36. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية العدد 151 Microfluidics التصوير الضوئي الطباعة الحجرية الناعمة خلايا الكوندريبات لوحة النمو علم الميكانيكا ميكانيكا الخلايا هيدروجيل الجينات مجهرية البؤرية تحليل الصور
منصة ميكروفلويديك لتحفيز الخلايا الغضروفية مع الضغط الديناميكي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A.… More

Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression. J. Vis. Exp. (151), e59676, doi:10.3791/59676 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter