Summary
이 문서에서는 연골 세포 압축을 위한 공압 작동 미세 유체 장치를 제조하고 특성화하기 위한 자세한 방법을 제공합니다.
Abstract
기계적 자극은 세포와 조직의 생물학적 기능을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 연구는 압축 스트레스 성장 플레이트 연골 아키텍처를 변경 하 고 어린이의 긴 뼈의 성장 변조 결과 제안. 뼈 성장에 압축 응력의 역할을 결정하기 위해, 우리는 알긴산 하이드로 겔 실린더에 내장 된 동적으로 (또는 정적으로) 압축 성장 판 연골 세포에, 공압 압력에 의해 작동 미세 유체 장치를 만들었습니다. 이 문서에서는 이 장치를 조작하고 특성화하는 자세한 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜의 장점은 : 1) 압축 응력의 다섯 가지 크기는 하나의 플랫폼에서 다섯 개의 기술적 복제에 생성 될 수있다, 2) 기존의 빛 현미경을 통해 세포 형태를 시각화하기 쉽습니다, 3) 세포는 신속하게 분리 될 수있다 압축 후 디바이스로부터 다운스트림 어노세를 용이하게 하고, 4) 플랫폼은 하이드로겔에서 성장할 수 있는 임의의 세포 유형의 메카노생물학을 연구하기 위해 적용될 수 있다.
Introduction
마이크로 엔지니어링 플랫폼은 물리적 및 화학적 미세 환경모두의동적 제어를 가능하게하기 때문에 분자, 세포 및 조직 수준 생물학을 연구하기위한 귀중한 도구입니다1,2,3 ,4,5,6,7,8. 따라서, 여러 가설은 동시에 엄격하게 통제된 방식으로 시험될 수 있다. 성장판 연골의 경우,성장판 연골9,10,11에대한 작용을 통해 뼈 성장을 조절하는 데 있어 압축 스트레스의 중요한 역할에 대한 증거가 증가하고있다. 12,13,14,15,16 ,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. 그러나, 압축 응력의 작용의 메커니즘 - 특히, 스트레스가 성장 판에 연골 세포 기둥의 형성을 안내하는 방법 - 제대로 이해되지 않습니다.
이 프로토콜의 목적은 성장판 연골세포에서 메카노바이오틱의 메커니즘을 해명하기 위해 공압작동 미세유체 연골세포압축장치(26)를 만드는것이다(도 1a-c). 이 장치는 공압 작동 장치와 알긴산 겔 구조의 두 부분으로 구성됩니다. 미세 유체 공압 작동 장치는 사진 및 연리소그래피에 기초하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 제작됩니다. 이 장치에는 직경에 따라 다르게 팽창 할 수있는 얇은 PDMS 멤브레인 풍선의 5 x 5 배열이 포함되어 있습니다. 상기 알긴산 겔 구조는 5 x 5 배열의 알긴산 겔 실린더에 내장된 연골세포로 구성되며, 전체 알긴산-콘드로시트 구조는 작동 장치와 함께 조립된다. 알긴산 겔 구문은 공압적으로 팽창된 PDMS 풍선에 의해 압축된다(도1b). 미세 유체 장치는 PDMS 풍선 직경의 차이에 따라 단일 플랫폼에서 동시에 다섯 가지 수준의 압축 응력을 생성할 수 있습니다. 따라서, 다중 압축 조건 하에서 연골세포 메카노생물학의 고처리량 시험이 가능하다.
본 프로토콜에 기재된 미세유체 장치는 외부픽서(14,21,23 및 거시적 압축장치)와같은 종래의 압축 장치에 비해 많은 장점을갖는다. 19세 , 27세 , 28 연골세포 메카노생물학을 연구하기 위한: 1) 미세유체 장치는 거시적 압축 장치보다 적은 양의 샘플을 소비하기 때문에 비용 효과적이며, 2) 미세 유체 장치는 여러 개의 샘플을 테스트할 수 있기 때문에 시간 효율적입니다. 압축 조건 동시에, 3) 미세 유체 장치는 마이크로 채널의 제한된 혼합에 기초하여 화학 물질의 농도 구배를 형성하여 기계적 및 화학적 자극을 결합 할 수 있으며, 4) 다양한 현미경 기술 (시간 경과) 현미경 검사법 및 형광 공초점 현미경 검사법)은 투명 PDMS로 만들어진 미세 유체 장치로 적용 할 수 있습니다.
우리는 Moraes 등7,29의 방법을 채택하고 개정하여 연골 세포 압박의 고처리량 메카노생물학 연구를 가능하게하기 위해 단일 장치에서 다른 압축 응력 수준을 생성합니다. 우리의 접근법은 3차원(3D) 배양 환경을 필요로 하는 세포(예를 들어, 연골세포)와 세포를 압축한 후생물학적 세포학적 인 세포에 적합합니다. 일부 미세 유체 세포 압축 장치는 2 차원 (2D) 기판(30,31,32)에배양 된 세포를 압축 할 수 있지만 2D 배양 연골 세포이기 때문에 연골 세포에 사용할 수 없습니다. 차별화. 광중합체 하이드로겔7,33에서3D 배양 세포를 압축하기 위한 미세 유체 플랫폼이 있지만 광중합체로부터 세포를 분리하기 때문에 압축 실험 후 세포를 분리하는 데 제한이 있습니다. 하이드로겔은 쉽지 않습니다. 추가적으로, 세포에 자외선 (UV) 노출 및 사진 가교 개시자의 효력은 평가될 필요가 있을 지도 모릅니다. 대조적으로, 우리의 방법은 알긴산 하이드로겔이 칼슘 킬레이트에 의해 신속하게 중합될 수 있기 때문에 포스트 생물학적 분석실험에 대한 압축 실험 후 세포의 신속한 분리를 허용합니다. 자세한 장치 제작 및 특성화 방법은 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 미세유체 연골세포 압축 장치를 제조하기 위한 간략한 절차는 도 2에나타내고 있다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜의 모든 단계에 장갑과 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
1. 마스터 금형 제작
참고: 연기 후드에서 1.1단계 - 1.3단계를 수행합니다.
- 유리 처리
참고: 1.1단계에서는 얼굴 보호막, 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오.- 피라냐 용액(60 mL)을 황산(H2SO4)과과산화수소(H2O2)를부피비 3:1로 혼합하여 만듭니다.
주의: 폭발 위험으로 인해 동일한 연기 후드에 피라냐 용액과 아세톤을 사용하지 마십시오. - 40°C에서 30분 동안 피라냐 용액에 유리판(50.8mm × 76.2 mm × 1.2 mm)을 놓습니다.
- 탈이온수(diH 2O)로 유리판을헹구다.
- 유리 판을 실온에서 아세톤에 넣고 10분 동안 놓습니다.
- 유리판을 이소프로판올로 헹구고질소(N2)가스로 건조시면 됩니다.
- 유리판을 200°C에서 20분간 핫 플레이트에 굽습니다. 이후의 모든 베이킹 단계는 핫 플레이트를 사용합니다.
- 피라냐 용액(60 mL)을 황산(H2SO4)과과산화수소(H2O2)를부피비 3:1로 혼합하여 만듭니다.
- 유리 판에 SU-8 종자 층 형성
- 일회용 파이펫이 있는 유리 판에 SU-8 5를 분산하여 플레이트 표면적의 약 2/3을 덮습니다.
- 35초(초기 회전 사이클)에 대해 500rpm에서 SU-8 5 포토레지스트로 유리 판을 돌린 다음 스핀 코터를 사용하여 40초(최종 회전 주기)에 대해 2,500rpm을 회전시면 됩니다. 모든 후속 스핀 코팅 단계에는 동일한 초기 회전 사이클이 포함됩니다.
- SU-8 5 코팅 유리 판을 65°C에서 2분간 구운 다음 95°C에서 5분간 굽습니다.
- UV 광에 SU-8 5 코팅 유리 플레이트를 노출 (60 mW / cm2,UV 램프와 포토 마스크 사이의 거리는 20cm, UV 광 에너지의 총 량 = 60 mJ / cm2)1 s.
참고: 사용된 UV 광선의 힘에 따라 UV 노출 시간을 조정해야 합니다. - SU-8 5 코팅 유리 판을 65°C에서 2분, 95°C에서 5분간 굽습니다.
- 구운 유리 판을 SU-8 개발자에 2 분 동안 놓습니다.
- SU-8 5 코팅 유리를 180°C에서 20분간 굽습니다.
- 포토리소그래피를 이용한 SU-8 채널 패턴 제작(그림 2a 단계 1-3)
- SU-8 5 시드 유리 플레이트에 SU-8 100을 부어 플레이트 표면적의 약 2/3을 덮습니다.
- 3,000rpm에서 SU-8 100으로 유리 판을 38s(두께 90μm)로 돌이면서 회전시면 됩니다.
- SU-8 100 코팅 유리 판을 65°C에서 10분 간 구운 다음 95°C에서 30분간 굽습니다. 이 시술 후에도 SU-8 100이 여전히 끈적끈적한 경우, 95°C에서 유리판을 구우고 SU-8 100이 끈적거리지 않게 됩니다.
- SU-8 100 코팅 유리 판에 고해상도 마이크로채널 포토마스크(25,400 dpi, 추가 그림 1참조)를 놓고 포토마스크 덮인 유리판을 4초 동안 UV 광에 노출시다(총 자외선 에너지 량 = 240 mJ/cm2).
참고: 사용된 UV 광선의 힘에 따라 UV 노출 시간을 조정해야 합니다. - 유리판에서 포토마스크를 제거하고 유리판을 65°C에서 2분간 굽은 다음 95°C에서 20분간 굽는다.
- 구운 유리 판을 알루미늄 호일로 감싼 용기에 보관하여 빛을 차단하여 밤새 경화하십시오.
- 15 분 동안 SU-8 개발자의 유리 판에 SU-8 100 채널 패턴을 개발합니다.
- SU-8 패턴 유리 플레이트(마스터 몰드)를 이소프로필 알코올로 세척하고N2 가스로 건조시면 됩니다. 이 과정에서 백색 입자가 남아 있으면 7단계를 5분 동안 반복합니다.
2. 공압 작동 장치
- 마이크로채널 층(레이어 1)
참고: 연기 후드에서 2.1.1 - 2.1.2 단계를 수행합니다.- 커버 슬립에 (Tridecafluoro-1,1,2,2-테트라 하이드로 옥틸)-1-트리클로로실란의 200 μL을 드롭하고 마스터 금형진공 챔버에 배치합니다.
- 챔버에서 2 분 동안 진공을 적용하고 금형의 실란화를 위해 6 시간 (또는 하룻밤)을 기다립니다.
- PDMS를 10:1(프리폴리머:경화제)의 중량비로 5분 동안 혼합합니다.
참고: 이후의 모든 PDMS 캐스팅 단계는 동일한 전합체 및 경화제 중량비(10:1)를 포함합니다. - 마스터 몰드에 PDMS를 붓고 진공 챔버에서 PDMS를 30 분 동안 탈기하십시오.
- 투명 필름의 조각으로 샌드위치 PDMS.
- 위의 샌드위치 어셈블리를 유리 판, 폼 패드 및 플렉시 유리 플레이트로 고정합니다(그림 2a 단계 4).
- 6 시간 동안 80 °C에서 오븐에서 PDMS를 치료하십시오.
- PDMS 층(레이어 1)을 샌드위치 구조로부터 투명 필름으로분리합니다(도 2a 단계 5).
- 플라즈마 클리너를 사용하여 1층 및 깨끗한 유리 판(유리판 1, 50.8 mm × 76.2 mm × 1.2 mm)의 표면을 1 분 동안 활성화하십시오.
참고: 플라즈마 세척 시간은 사용된 플라즈마 클리너의 전력에 따라 달라질 수 있습니다. - 유리판 1에 1층을 결합시키고 오븐에 30분 동안 80°C로 놓습니다.
- 레이어 1에서 투명필름을 제거합니다.
- 얇은 PDMS 멤브레인 (층 2)
- 1,000 rpm에서 1,000 rpm에서 경화되지 않은 PDMS를 1분 동안 스핀 코팅하여 60 μm 두께의 PDMS 층을 얻었다.
- 부분적으로 20-30 분 동안 80 °C에서 오븐에서 스핀 코팅 PDMS (층 2)를 경화.
- 플라즈마 클리너를 사용하여 유리 판 1과 레이어 2의 레이어 1을 1분 동안 활성화합니다.
참고: 플라즈마 세척 시간은 사용된 플라즈마 클리너의 전력에 따라 달라질 수 있습니다. - 레이어 2를 레이어 1에 결합하고 밤새 80°C에서 오븐에 놓습니다.
- 튜브 블록
- 금속 튜브를 페트리 접시에 수직으로 놓습니다.
- 금속 튜브의 약 3/4을 담그기 위해 접시에 PDMS를 부드럽게 붓습니다.
- 60°C에서 6시간(또는 하룻밤)에 오븐에서 PDMS를 경화합니다.
- 하나의 금속 튜브를 포함하는 PDMS 블록의 조각을 잘라.
- 입구에 대한 레이어 2에 구멍을 펀치.
- 플라즈마 클리너를 사용하여 PDMS 블록과 레이어 2를 1분 동안 활성화합니다.
- PDMS 블록을 레이어 2의 입구 부분에 부착하고 전체 작동 장치를 오븐에 80°C로 하룻밤 동안 놓습니다.
3. 알지네이트 콘드로 시테 (또는 비드) 구조
- 아미노 실란화 유리 판
- 다이아몬드 스크리버를 사용하여 유리 판(50.8mm × 76.2 mm × 1.2 mm)을 두 개의 반크기 유리 판(50.8mm × 38.1 mm × 1.2 mm)으로 자른다.
- 유리판을 0.2M 염화수소(HCl)에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어줍니다(예: 55rpm).
- diH2O로 유리 판을 헹구다.
- 유리판을 0.1M 수산화나트륨(NaOH)에서 55rpm에서 1시간 동안 흔들고 diH2O로헹구십시오.
- 유리판을 1% (v/v) 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTES)에서 55rpm에서 1시간 동안 흔들고 diH2O로 헹구세요.
- 아미노 실란화 유리 판을 밤새 연기 후드에 말립니다.
- 알긴산 젤 구조용 아가로즈 젤 몰드
- diH2O에 5% (v) 아가로오스와 200 mM 염화칼슘(CaCl2)을섞습니다.
- 아가로즈 젤 용액을 전자 레인지 (또는 핫 플레이트)로 끓입니다. 끓는 시간은 아가로즈 젤 용액의 부피와 전자 레인지의 힘 (또는 핫 플레이트의 온도)에 따라 다릅니다.
- 삶은 아가로즈 젤 용액을 알루미늄 몰드에 붓고 (보조 그림 S2참조) 유리 접시로 샌드위치.
- 5 분 동안 기다렸다가 알루미늄 금형에서 고형 아가로즈 젤을 풀수 있습니다.
- 성장 판 연골 세포 수확
- 신생아 생쥐의 뒷다리에서 성장판을 분리합니다.
- 성장판을 37°C 및 8%이산화탄소(CO2)에서인큐베이터에서 3시간 동안 0.25% 콜라게나아제의 1 mL에 놓고, 세포외 매트릭스(ECM)를 제거한다.
- 125 x g에서 5 분 동안 소화 된 샘플을 원심 분리하여 연골 세포 펠릿을 만들고 샘플에서 상류자를 제거합니다. 여기서, 1 x g는 중력의 가속도이다.
- 덜베코의 수정된 독수리 배지(DMEM)의 1mL에서 연골 세포 펠릿을 다시 정지시면 됩니다.
- 세포 카운터를 사용하여 DMEM에서 연골 세포의 수를 계산합니다.
- DMEM에서 연골 세포체를 125 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 다시 연골 세포 펠릿을 만들고 샘플에서 상류자를 제거합니다.
- 선택적으로, 연골세포 배양 배지(CCM)34에서 2 μM 칼세인 AM을 함유하고, 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양하고, 3.3.6단계를 반복하고 3.3.8단계로 이동한다.
- 콘드로시테 펠렛을 원하는 CCM 부피로 다시 중단하고 사용하기 전에 37°C 및 8%CO2에서 인큐베이터에 보관하십시오.
- 알긴산-콘드로시테(또는 비드) 구문(그림 2c)
- 1.5% (w/v) 알긴산알지산과 설포-NHS 5 mg/mL, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디미드 염산염(EDC)의 10 mg/mL과 함께 혼합합니다.
- 알긴산 젤 용액 1mL에 8 x 106 연골 을 첨가 [또는 알긴산 젤 용액 의 1 mL에 1 μm 직경 형광 비드 (542/612 nm)의 3 μL을 추가하십시오 (0.3 % (v /v)].
- 3.1단계에서 제조된 아미노 실란화된 유리 판상에 알긴산 콘드로시드(또는 비드) 용액의 150 μL을 놓습니다.
- 알긴산 젤 용액을 아가로즈 젤 몰드로 3분 동안 덮습니다.
- 면도날로 아가로즈 겔 몰드에서 흘러나오는 과도한 알긴산 젤 용액을 제거하고 아가로즈 겔 몰드를 제거한다. 이어서, 원통형 알긴산-콘드로시테(또는 비드) 구체는 아미노실란화된 유리판 상에서 수득된다.
- 알긴산-콘드로시트 생성을 가교 용액(50 mM CaCl 2/140 mM NaCl in diH2O)에 1분 동안 배치하여 추가 중합을 위해.
4. 장치 어셈블리(그림 2d)
참고: PDMS 스페이서와 3D 인쇄 클램프는 별도로 준비해야 합니다.
- 작동 장치의 레이어 2의 네 모서리에 1mm 두께의 PDMS 스페이서 4개 위치를 찾습니다.
- 700 μL의 CCM을 배치하여 레이어 2의 공기 챔버를 덮습니다.
- 알긴산 콘드로시테(또는 비드) 구조물을 레이어 2에 놓고 공소를 공기 챔버와 신중하게 정렬합니다.
- 3D 인쇄 클램프로 장치를 고정합니다(그림1c).
5. 장치의 작동
- 에어 펌프의 출구를 실리콘 튜브가 있는 솔레노이드 밸브 입구와 연결합니다(재료 표참조).
- 솔레노이드 밸브의 출구를 실리콘 튜브로 조립된 장치의 입구와 연결합니다.
- 솔레노이드 밸브를 기능 발생기로 연결합니다.
- 함수 생성기에서 생성된 정사각형 파(예: 1Hz)로 솔레노이드 밸브를 조작합니다.
- 에어 펌프를 켜서 장치를 공압으로 작동시려면
6. 장치에 있는 연골 세포의 화상 진찰
참고 : 좋은 이미지 품질을 얻기 위해, 이미지 연골 세포 (또는 형광 구슬) 유리 플레이트를 통해 알긴산 젤 2 확장 PDMS 풍선 과 공기 챔버는 광학 이미지를 왜곡 할 수 있기 때문에. 반전된 현미경을 이미징에 사용하는 경우 유리 판 2가 아래쪽을 향하도록 장치를 설정해야 합니다.
- 이전 섹션과 같이 연골 세포 (또는 형광 비드)로 장치를 준비하십시오.
- 각각 압축 전과 아래에 공초점 현미경으로 연골 세포 (또는 형광 구슬)의 z-스택 이미지를 가져 가라. 사용된 공초점 이미징 시스템의 피사계 심도에 따라 z-스텝 크기를 선택합니다.
- 연골세포(또는 알긴산 비드 구조)의 높이는 이전 문헌26,35에나타난 자동 이미지 처리 방법으로 측정할 수 있다.
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Representative Results
이 문서는 미세 유체 연골 세포 압축 장치 제조의 상세한 단계를 보여줍니다(그림 2). 이 장치는 원통형 알긴산-콘드로시트 구문 5개 어레이를 포함하며, 이러한 구문은 5가지 압축 크기로 압축될 수있다(그림 1, 그림 3 및 그림 4). 공압 마이크로채널의 높이는 약 90 μm이며 PDMS 풍선 직경은 각각 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 및 2.0 mm입니다. 장치의 성능은 정적 압축 조건 및 이미지 처리와 공초점 현미경으로 정량화되었다. 정적 압축은 공초점 현미경 검사법을 가진 z-stack화상 진찰이 몇 분 걸리기 때문에 현미경 화상 진찰을 위해 채택되었습니다, 그래서 동적 압축 도중 양적 화상 진찰을 위해 너무 느립니다.
도 3a는 유리판 2상에 주조된 5×5배열의 알긴산 하이드로겔 컬럼(직경:~0.8 mm, 높이: ~1 mm)을 나타낸다. 이들 겔 컨스트럭트들은 겔에 형광 비드를 첨가하여 이미지화되었다. 도 3b는 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 겔 컬럼이 높이33.8%로 압축되었다는 예를 들 수 있다. 도 3c에나타난 바와 같이, 겔 컨스트럭트의 결과 압축 스트레인은 PDMS 풍선 직경에서 0.2 mm 증분당 약 5% 증가하였다.
연골 세포의 압축 변형은 도 4a에도시된 바와 같이 겔 시스트 센터 근처의 613 μm×613 μm ×40-55 μm(x×y×z) 부피에서 세포를 이미징하여 결정하였다. 도 1d는 가장 큰 PDMS 풍선에 의해 16%까지 압축된 연골세포의 예시를 나타낸다. 도 4b는 측정된 셀 압축 변형률 값의 분포를 나타내고, 전체 셀은 더 큰 PDMS 풍선에 의해 더 많이 압축되었다. 따라서, 알긴산 겔 및 콘드로시트 압축의 양은 14 kPa의 일정한 압력으로 PDMS 풍선의 직경에 의해 조절되었다(도3 및 도 4).
그림 1. 미세 유체 연골 세포 압축 장치.
(a)조립된 장치의 회로도. 5 × 5 배열의 알긴산 -chondrocyte 구조는 5 개의 다른 직경(D = 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 및 2.0 mm)의 PDMS 풍선에 정렬되며, 여기서 D는 PDMS 풍선 (또는 공기 챔버)의 직경입니다. (b)장치 작동의 회로도. 이 장치는 PDMS 풍선을 확장하는 공압 압력에 의해 작동됩니다. (c)실제 장치 (동전 직경 = 19mm)의 이미지. (d)가장 큰 PDMS 풍선(D = 2.0 mm)에 압축하기 전 (왼쪽) 및 아래 (오른쪽)의 연골 세포의 수직 단면 (세포 압축 변형,셀 = 셀 높이 변화 / 초기 셀 높이 | x 100 = 16 %). 이 수치는 26에서재현됩니다.
그림 2. 미세 유체 연골 세포 압축 장치 제조의 상세한 단계.
(a)SU-8 마스터 몰드를 생성하고 공압 마이크로 채널로 PDMS 층을 만들기 위한 소프트 리소그래피를 따르기 위한 포토리소그래피(Layer 1). (b)스핀 코팅에 의해 생성된 투명 필름상에 얇은 PDMS 멤브레인(Layer 2)을 가늘게 한다. (c)유리에 원통형 알긴산 젤 주조 방법 (유리 판 2). (d)미세유체 연골세포 압축 장치의 조립체. 이 수치는 26에서재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 정적 압축 하에서 알긴산 젤 변형 측정.
(a)원통형 알긴산 젤 의 5 x 5 배열 (직경 : ~ 800 μm, 높이 : ~ 1mm). (b)가장 큰 PDMS 풍선에 의해 압축 된 알긴산 젤(D = 2.0 mm). 알긴산 겔의 압축 변형률은 33.8 %입니다. (c)알긴산 겔(θgel)의압축 균주는 PDMS 풍선 직경(D)의 0.2 mm 증분당 약 5%씩 증가한다. 오류 막대: 표준 편차입니다. 빨간색 선 : 선형 피팅 라인이 그림은 26에서재현됩니다.
그림 4. 정적 압축 하에서 연골 세포 변형측정.
(a) z-stack이미지 [613 μm × 613 μm × 40-55 μm(x × y × z)]겔 구조의 중간에, 겔 바닥에서 300-400 μm을 얻었다. (b)연골세포 압축스트레인(θcell)의다른 크기는 PDMS 풍선직경(D)의함수로 귀착되었다. 
: 평균 값입니다. 
: 각 데이터 포인트. 상자의 위쪽(또는 아래쪽) 및 중간 선은 각각 표준 편차 및 중앙값입니다. 이 수치는 26에서재현됩니다.
그림 S1. 단계 1.3.4 (단위 = mm)에 대한 마이크로 채널 포토 마스크 디자인. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S2. 단계 3.2.3 (단위 = mm)에 대한 알루미늄 금형 설계. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 S3. 1시간 길이의 동적(1Hz) 및 정적 압축 하에서 알긴산 겔(1.5%, w/v)의 영구 변형. 이 수치는 26에서재현됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성장판 연골세포에 대한 압축 응력의 영향을 테스트하기 위해 미세유체 연골세포 압축장치(그림 1)를개발하여 알긴산 하이드로겔 스캐폴드의 연골세포에 다양한 수준의 압축 스트레스를 3D로 적용했습니다. 처리량이 높은 방식으로 문화를 전달합니다. 다른 연구자가 장치를 채택하거나 유사한 장치를 개발할 수 있도록 이 프로토콜 문서에서 장치 제작 단계에 대한 세부 정보를 제공했습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 1) 1층의 기포가 공압 마이크로채널을 손상시키지 않고 공압 마이크로채널(Layer 1)으로 PDMS 층을 제작하는 것입니다. PDMS 풍선의 탄성이 경화온도(36,3)에 의존하기 때문에 PDMS 풍선(Layer 2)을 경화하기 위한 일정한 온도(예를 들어, 80°C)는 신선한 아미노실란화된 유리를 사용하여 알긴산 겔 구조를 PDMS 풍선과 정렬하고 4)에 의존하는 것으로 알려져 있기 때문에 플레이트(유리판 2)는 규화 처리 후 2일 이내에 유리판 2상에 알긴산 겔 컬럼을 접합한다.
이 프로토콜의 주요 한계는 프로세스가 포토리소그래피와 소프트 리소그래피의 여러 단계를 포함하기 때문에 장치를 제작하는 데 상대적으로 노동집약적이라는 것입니다. 또한 프로토콜에 따라 제작된 미세 유체 세포 압축 장치의 성능은 다양한 유형의 하이드로겔과 셀을 사용할 때마다 평가되어야 합니다. 하이드로겔과 세포의 기계적 특성의 차이는 장치 성능에 영향을 미치기 때문입니다.
우리의 미세 유체 세포 압축 장치는 연골 세포에 동적 압축을 적용하기위한 것이지만, 그 성능은 정적으로 압축 된 알긴산 젤 및 세포를 이미징하여 평가되었습니다. 이는 종래의 공초점 현미경으로 동적 압축 하에 겔 및 세포를 이미지화하기 어려웠기 때문이다. 우리는 알긴산 겔의 영구적 변형측면에서 정적(14kPa, 1Hz, 1h)과 동적 압축(14kPa, 1Hz, 1시간)을 비교하고 동적 압축 하에 겔의 영구적인 변형이 정적 압축에 비해 무시할 수 있음을 발견했습니다(참조) 보조 그림 S3).
우리의 방법의 한 가지 장점은 3D 배양 환경을 필요로 하는 다른 세포 유형에 사용할 수 있다는 것입니다. PDMS 풍선의 직경 및 두께 및/또는 풍선의 압력을 변경하여 장치의 결과 압축을 응용 프로그램에 따라 변조할 수 있습니다. 또한 프리폴리머와 경화제 사이의 혼합비를 조정하여 PDMS 풍선의 탄성을 수정할 수도 있다. 이 장치의 세포는 빛 /형광 현미경 을 사용하여 실시간으로 이미지 화 될 수 있으며, 장치는 신속하게 하류 분석을 가능하게세포 수확을 위해 분해 될 수있다. 또 다른 장점은 단일 장치를 사용하여 각 응력 레벨당 5개의 기술적 복제물로 5개의 뚜렷한 기계적 응력 레벨을 생성할 수 있다는 것입니다. 복제와 용량 응답 분석을 결합하면 결과에서 높은 수준의 엄격함과 재현성을 보장합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
크리스토퍼 모라에스 박사와 스티븐 에이 모린 박사가 장치 설계 및 제작을 지원해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구 결과는 네브라스카 링컨 대학 (UNL)와 네브래스카 대학 의료 센터 (UNMC)에서 인간 건강 교부금을 위한 생명 공학에 의해 지원되고, NIH/NIAMS에서 AR070242를 부여했습니다. 우리는 공초점 현미경 검사법에 도움을 제공한 네브래스카 대학 의료 센터에 있는 고급 현미경 코어 시설의 제니스 A. 테일러와 제임스 R. Talaska에게 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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