Summary
本文介绍了一种快速的协议, 通过心脏灌注的心脏灌注的 DiI 稀释在固定, 使用 medaka (Oryzias latipes) 作为模型, 并侧重于大脑和垂体组织的远端鱼的血管标记。
Abstract
血管刺激脊椎动物的所有组织, 通过提供必要的营养、氧气和激素信号来维持它们的生存。它是最早在发展过程中开始运作的机构之一。血管形成机制已成为具有高度科学和临床意义的课题。然而, 在成人中, 由于大多数活体动物在其他组织深处的定位, 很难想象它们的血管结构。然而, 血管可视化仍然是重要的几个研究, 如内分泌和神经生物学。虽然斑马鱼已经开发出了一些转基因系, 血管通过荧光蛋白的表达直接可视化, 但其他远程物种没有这样的工具。利用 medaka (Oryzias latipes) 作为模型, 目前的协议提出了一种快速和直接的技术, 通过灌注通过心脏与含有 dii 的固定剂, 大脑和垂体的血管标签。该协议可以提高我们对大脑和垂体细胞如何在整个组织或厚组织切片中与血管相互作用的理解。
Introduction
血管是脊椎动物身体的重要组成部分, 因为它们为所有器官提供必要的营养、氧气和激素信号。另外, 自从发现他们参与癌症发展1以来, 他们在临床研究中受到了很大的关注。尽管一些出版物研究了允许血管生长和形态发生的机制, 并确定了大量对其形成很重要的基因, 但关于相互作用, 还有很多需要了解的地方细胞或组织与循环血液之间。
在大脑和垂体中的血液血管的可视化是重要的。大脑中的神经元需要大量的氧气和葡萄糖,脑垂体中含有多达八种重要的产生激素的细胞, 这些细胞使用血液流动接收来自大脑的信号, 并将各自的激素传递给不同的细胞外周器官4,5。而在哺乳动物中, 下丘脑底部的门户系统命名为中位隆起, 连接大脑和垂体 6, 这样一个清晰的血桥还没有在远程鱼中描述过。事实上, 在远程测试中, 垂体前神经元直接将轴突投射到垂体7的神经部分, 主要直接支配不同的内分泌细胞类型 8,9.然而, 这些神经元中的一些神经元的神经末梢位于血管外空间, 靠近血毛细血管10。因此, 远端鱼和哺乳动物之间的区别并不那么明显, 血液血管与大脑和脑垂体细胞之间的关系需要对远端鱼进行更深入的研究。
斑马鱼在许多方面都有一个解剖和功能上可比于其他脊椎动物物种的血管系统11。它已成为心血管研究的强大脊椎动物模型, 主要是由于几个转基因线的发展, 其中血管系统的组成部分被标记为荧光记者蛋白 12。然而, 确切的循环系统解剖可能因物种而异, 甚至在属于同一物种的两个个体之间也会有所不同。因此, 血管的可视化可能也是高度感兴趣的其他远程物种, 其中不存在转基因工具。
在哺乳动物和心灵中, 有几种技术可以给血管贴上标签。其中包括血管特异性基因的原位杂交、碱性磷酸酶染色、微血管造影和染料注射 (评论见13)。荧光亲脂性阳离子阳离子 (dii) 首次用于研究膜脂质侧向迁移, 因为它保留在脂质双层中, 并可通过它迁移14,15,16。事实上, DiI 的一个分子是由两个碳链和色谱联。当碳氢化合物链整合在与之接触的细胞的脂质双层细胞膜中时, 染色体仍保留在其表面17。一旦进入膜, DiI 分子在脂质双层内横向扩散, 这有助于染色不直接与 DiI 溶液接触的膜结构。因此, 通过心脏灌注注射 DiI 溶液, 会给所有与该化合物接触的内皮细胞贴上标签, 允许直接给血管贴标签。今天的 DiI 也被用于其他染色目的, 如单分子成像, 命运映射, 和神经元追踪。有趣的是, 存在几种荧光 (具有不同波长的发射), 允许与其他荧光标签的组合, DiI 的结合以及横向扩散可以发生在活组织和固定组织18,19岁
1893年由百丁氏发现的甲醛, 至今已被广泛用作组织固定的首选化学物质20,21。它显示了广泛的特异性为大多数细胞目标并且保留了细胞结构22,23。它还保留了大多数荧光的荧光特性, 因此可用于固定目标细胞表达荧光报告蛋白的转基因动物。
在这份手稿中, 以前的一个协议开发的血管标签的小实验哺乳动物模型 24 已适应在鱼类中的使用。整个过程只需几个小时就可以完成。它展示了如何在鱼的心脏中灌注含有 DiI 的甲醛固定溶液, 以便直接标记大脑中的所有血管和垂体模型的鱼美达卡。Medaka 是一种原产于亚洲的小型淡水鱼, 主要分布在日本。它是一个研究模型生物与一套分子和遗传工具可用25。因此, 在这个物种以及其他物种的血管的识别将允许提高我们对大脑和垂体细胞如何在整个组织或厚组织切片中与血液血管相互作用的理解。
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Protocol
所有动物处理都是根据挪威生命科学大学关于研究动物护理和福利的建议, 并在授权调查人员的监督下进行的。
1. 仪器和解决方案的准备
- 准备 DiI 库存溶液溶解5毫克的 DiI 晶体在 1.5 mL 塑料管与1毫升的 96% etoh。涡流为 30秒, 并保持覆盖使用铝箔。
请注意:DiI 库存解决方案可以在-20°c 的黑暗中保存几个月。 - 将一块聚苯乙烯切割成5厘米长、3厘米宽、厚度为2厘米, 并将其粘附在直径为9厘米的塑料盘上, 以准备鱼架 (图 1a)。在聚苯乙烯中使用手术刀刀片制作一个3厘米长的船形孔。
- 准备完善系统 (图 2), 在针的末端加入一个30-50 厘米长的塑料插管。
- 用30毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 在50毫升塑料管中稀释10% 毫升的 16% PFA, 制备40毫升新鲜的4% 甲醛溶液 (PFA)。
- 在10毫升塑料管中稀释9毫升新鲜制备的 4% PFA 中的 DiI 库存溶液中的1毫升, 制备固定剂/dii 溶液的10毫升。在黑暗中使用, 直到使用。
请注意:未溶解的 DiI 晶体可以保存在库存溶液管中, 并且可以添加新的乙醇来制备新的 DiI 库存溶液 (见步骤 1.1)。 -
准备50毫升的毛滴虫 (MS-222) 库存。
- 在h2o. 加入 2ml tris 碱 (ph 9) 的2毫升中溶解200毫克的三卡内粉。使用 1M HCl 调整到 pH 值 7, 并存储在-20°c。
- 在一个小杯子里的50毫升的清洁水中稀释5毫升的 Tricaine 库存。
- 按照制造商的说明, 用移液器拉拔玻璃毛细管, 准备几台5厘米的玻璃移液器 (图 2)。
2. 解剖和灌注
请注意:PFA 是一种有毒的挥发性化合物, 因此解剖和灌注应在引擎盖或通风室内进行, 用户必须佩戴防毒面具。
- 在解剖前准备解剖工具, 包括小剪刀, 以及一个锋利的钳子和一个强的钳子。
- 将注射器放入50毫升管中并进行拉拔, 将其填充为 Pfau-dii 的溶液。然后将带插管的针头放在注射器的末端 (图 2)。
- 使用放置在不同方向的几片胶带将注射器固定在工作台上, 调整显微镜和座椅的位置, 以获得解剖和按压注射器活塞的良好位置 (图 1b)。
请注意:在这个协议中, 肘部被用来压下注射器活塞, 但其他的可能性选项可以使用, 例如, 从另一个人的援助。 - 用过量的滴虫对鱼进行安乐死, 方法是将鱼放入步骤1.7 中准备的溶液中。等待 30秒, 用钳子抓住鱼的尾鳍, 测试鱼的反射能力。鱼可以在停止对刺激的反应时使用。
- 将鱼放在鱼座上, 其腹部朝上, 将一根针钉在头部的末端, 并将另一根针钉在尾巴上方, 以保持鱼的位置。
- 用剪刀水平切割皮肤的表层, 打开前腹部。
- 使用钳子, 取出心脏上方的皮肤, 直到有一个明确的通道进入心室和球状动脉提供 (图 3)。
- 在毛细管的末端加入一个玻璃移液器, 并打破玻璃移液器尖端的末端。
请注意:破裂尖端的孔应该足够大, 让液体出来, 但仍然足够小, 很容易进入组织。玻璃移液器如果没有破损或堵塞, 可以重复使用。 - 将玻璃移液器靠近心室, 并将压力加到注射器活塞上, 使肘部产生液体。
- 将心脏心室与玻璃移液器结合, 同时给注射器增加压力。
- 之后, 用钳子打孔鼻窦, 使血液离开血液循环。
请注意:心脏心室变得更加脆弱, 因为固定剂。当血液被固定物/dii 溶液稀释时, 它也会变得不那么红。 - 从心室调整玻璃移液器的角度, 找到球状动脉的入口。如图 2所示, 将移液器打开, 并为注射器增加压力。
请注意:球芽是透明的, 组织是有弹性的。当用 Dii/固定剂代替血液时, 心脏内的玻璃移液器应该变得更加明显, 通过增加压力, 球腔的大小应该会扩大。这一步对于确保使用足够的压力将所有血液替换为固定物/dii 溶液, 并确保所有血管都已到达至关重要。通常, 当成功时, PFA 会引起肌肉收缩, 鱼就会移动。 - 继续给注射器增加30-60 秒的压力, 仍然将玻璃移液器保持在球状动脉内。
- 从鱼身上取下玻璃移液器和针头。
- 在室温下, 在 PBS 中解剖大脑和垂体, 并在新鲜的 4% PFA 中孵育组织2小时。
请注意:Fontaine 等人 (26 人) 和 Ager-Wick 等人 (Ager-Wick) 在过去以两种不同的方式详细描述了大脑和脑垂体的解剖。由于固定, 组织变得相当坚硬, 大脑和脑垂体之间脆弱的联系可能会被打破。解剖后, 固定后处理也可以在4°c 下进行过夜。 - 在准备成像之前, 在 PBS 中冲洗组织两次, 时间为10分钟。
请注意:然后, 组织可以安装在滑动和盖滑之间, 中间有间隔, 安装介质之间有共聚焦成像 (见图 4), 也可以用 Fontaine 等人详细介绍的振动体进行切片, 然后在之间安装用于立体显微镜成像的滑动和盖板 (参见图 4)。
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Representative Results
该协议演示了一个逐步的程序, 以标签血管在 medaka 大脑和垂体, 同时修复的组织。用心脏注射含有 DiI 的固定溶液贴入心脏后, 可以用荧光立体显微镜 (图 4) 在切片上观察血管, 也可以用共聚焦显微镜在整个组织上观察血管 (图 5)。无论是在厚组织切片或整个组织上, 血液血管的结构都可以在三个维度中观察到。组织切片可以标记为特定的目标蛋白使用标准免疫荧光协议后, 结束的固定, 并在转基因线, 其中感兴趣的细胞表达荧光报告蛋白 (图 6)。这就可以调查血管与其他特定细胞类型之间的相互作用。例如, 在这里, 使用 medaka 的转基因线, 绿色荧光蛋白 (GFP) 产生细胞揭示了垂体 Lh 细胞28的位置。人们可以观察到, 这些细胞向血管发送延伸。如果灌注不理想, 某些血管可能没有正确标记。例如, 如果溶液被注射在心脏心室而不是球状动脉, 或者如果在注射器活塞上使用过低和/或时间太短 (图 7), 就可能出现这种情况。最后, 通过对具有相同成像参数的同一组织进行成像, 显示标记的强度在四天后会降低, 信号会更多地扩散 (图 8)。
图 1: 用于鱼 (a) 灌注的保持板和注射设置 (b) 的图像.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 梅达卡鱼心脏的图式和灌注系统显示与玻璃针在心脏的 idel 位置, 为成功的灌注.箭头头显示在哪里打孔心脏, 让血液离开循环。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 鱼腹侧的图像打开, 心脏暴露灌注.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 从梅达卡的一片大脑和垂体组织中的血液血管图像.一个成年的 medaka 被灌注了一个含有 DiI 的固定溶液。大脑和垂体被解剖并固定一夜。在用荧光显微镜成像之前, 将组织安装在3% 的琼脂糖中, 并用振动体进行切片。所有贴有 DiI 标记的血管都可以通过整个部分看到, 显示大脑和垂体的血管。OT = 光学构造;电话 = 端脑;Hyp = 下丘脑;坑 = 垂体;Cb = 小脑;Hind = 后脑。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 3d 渲染从血血管的共聚焦 z 堆栈在美达卡垂体.一个成年的 medaka 被灌注了一个含有 DiI 的固定溶液。脑垂体被解剖和固定一夜。脑垂体从大脑中解剖, 并安装在滑块和覆盖滑移之间的间隔 b, 然后用共聚焦显微镜成像。Z 堆栈被记录, 并使用斐济软件和3D 查看器插件29进行3d 渲染。整个垂体血液血管可以在3D 中观察到。RPD = 左臂;PPD = 远端近端;PI = 分媒体。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: Z 投射共聚焦 z 堆栈从一个组织切片的转基因美达卡, 其中 Hhβ启动子控制绿色荧光报告蛋白的表达.一个成年 tg (lhb:hrgfpii) medaka 与含有 dii 的固定溶液灌注。脑垂体被解剖和固定一夜。组织被安装在3% 琼脂糖和分裂与振动。一些激素产生细胞, 在这种情况下, Lh 细胞, 向血管发送延伸 (箭头) 可以观察到, 可能是为了感觉到血液中的信号, 或者将他们的激素释放到循环中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 来自使用不良的 medaka 的一片大脑和垂体组织中的血液血管图像.一个成年的 medaka 是不适合灌注含有 DiI 的固定溶液, 只在心室中注射该溶液。脑垂体被解剖和固定一夜。在用共聚焦显微镜成像之前, 将组织安装在3% 的琼脂糖中, 并与振动体分离。血管上的血液标签很差, 有些根本没有贴上标签。OT = 光学构造;电话 =, 端脑;Hyp = 下丘脑;坑 = 垂体;Cb = 小脑;Hind = 后脑。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 梅达卡脑垂体组织切片标记血液血管的延时成像.一个成年的 medaka 被灌注了一个含有 DiI 的固定溶液。脑垂体被解剖和固定一夜。在安装 (a) 后, 以及安装 (b) 后, 在安装 (b) 后, 在安装 (a) 后和安装后 4天, 将组织安装在3% 琼脂糖中, 并与振动体进行切片, 然后再使用立体显微镜进行成像。请注意, 标签已随着时间的推移而减少和传播。OT = 光学构造;电话 = 端脑;Hyp = 下丘脑;坑 = 垂体;Cb = 小脑;Hind = 后脑。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
心脏灌注与 DiI 以前已被用来标记血管在几个模型种类24, 包括远程鱼13.
由于 DiI 是通过血管内的灌注直接传递到内皮细胞膜, 因此可以通过增加固定溶液中的 DiI 浓度来提高信噪比。此外, 荧光体在激发时提供强烈的染色, 以最小的漂白方式允许相对持久的排放18,30。此外, 标记可以保留几天, 并与其他需要温和处理的标记技术结合使用, 例如在 immuofluorescence (IF)31中。
但是, 此技术有一些限制。从固定溶液中取出后, 应尽快对组织进行标记和成像, 因为标记的强度会减弱, 信号会随着时间的推移而扩散 (图 8)。当使用增加膜孔隙率的洗涤剂时, 这个过程会更快。另外, 由于 PFA 是一种有毒的挥发性化合物, 在进行这个实验时, 应该采取一些预防措施。为了最大限度地减少本协议的危险方面, 可以在仔细处理感兴趣的组织之前, 完善 DiI 和 PBS 的溶液, 并在灌注后立即用 PFA 溶液修复该溶液。然而, 这只能对小型组织进行, 因为 PFA 在较大的组织样本中的渗透效率低于灌注期间。
通过训练提高了该协议的成功率, 因此预计研究人员需要一些时间来熟悉该技术的不同步骤。例如, 在球状动脉中灌注溶液是协议的一个特别关键的步骤, 需要一些培训才能取得好的结果。此外, 在灌注过程中, 将针头保持在正确的位置足够长的时间也不是一件小事, 需要机械手的训练。
最后, 该协议针对成年美达卡进行了优化, 但在一定程度上可以用于其他物种。不同的组织感兴趣, 甚至不同的生命阶段的动物在同一组织中也将需要优化的浓度 DiI 和灌注时间, 以及使用的材料 (针和注射器大小, 例如)。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
我们感谢 Kanda 真司博士在 medaka 演示心脏灌注固定溶液, 卢尔德家乐福 g Tan 女士在医疗管理方面提供帮助, 并感谢 Anthony Peltier 先生的插图。这项工作由 NMBU 和挪威研究理事会资助, 赠款号码为 248828 (挪威数字生活方案)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
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