Summary
Het artikel beschrijft een snel protocol voor het etiketteren van bloedvaten in een Teleost vis door cardiale transfusie van DiI verdund in fixatief, met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model en gericht op de hersenen en de hypofyse weefsel.
Abstract
Bloedvaten innervate alle weefsels in gewervelde dieren, waardoor hun overleving door het verstrekken van de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen. Het is een van de eerste organen die beginnen te functioneren tijdens de ontwikkeling. Mechanismen van de vorming van bloedvaten zijn uitgegroeid tot een onderwerp van hoge wetenschappelijke en klinische belangstelling. Bij volwassenen is het echter moeilijk om de vasculatuur te visualiseren in de meeste levende dieren als gevolg van hun lokalisatie diep in andere weefsels. Niettemin, visualisatie van de bloedvaten blijft belangrijk voor verschillende studies, zoals endocrinologie en Neurobiology. Terwijl verschillende transgene lijnen zijn ontwikkeld in zebravis, met bloedvaten direct gevisualiseerd door middel van expressie van fluorescerende eiwitten, geen dergelijke instrumenten bestaan voor andere Teleost soorten. Met behulp van Medaka (Oryzias latipes) als een model, het huidige protocol presenteert een snelle en directe techniek om de bloedvaten label in de hersenen en de hypofyse door perfusing door het hart met fixatief met DiI. Dit protocol maakt de verbetering van ons begrip over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.
Introduction
Bloedvaten spelen een essentieel onderdeel van het gewervelde lichaam als ze de nodige voedingsstoffen, zuurstof en hormonale signalen te verstrekken aan alle organen. Ook, sinds de ontdekking van hun betrokkenheid bij de ontwikkeling van kanker1, hebben ze veel aandacht gekregen in klinisch onderzoek. Hoewel een aantal publicaties de mechanismen hebben onderzocht die de groei en de morfogenese van de bloedvaten mogelijk maken, en een groot aantal genen belangrijk voor hun vorming zijn geïdentificeerd2, nog veel te begrijpen met betrekking tot de interactie tussen cellen of weefsels en het circulerende bloed.
Visualisatie van bloed vasculatuur in de hersenen en de hypofyse is belangrijk. Neuronen in de hersenen vereisen een hoge toevoer van zuurstof en glucose3, en de hypofyse bevat tot acht belangrijke hormoon-producerende cel typen die de bloedtoevoer gebruiken om het signaal van de hersenen te ontvangen en hun respectieve hormonen te sturen naar verschillende rand organen4,5. Terwijl in zoogdieren, de portal-systeem aan de basis van de hypothalamus de mediaan van de eminentie, verbindt de hersenen en de hypofyse6, zoals een duidelijke bloed brug is niet beschreven in Teleost vis. Inderdaad, in teleosts, preoptics-hypothalamic neuronen rechtstreeks project hun axonen in het pars nervosa van de hypofyse7 en meestal innervate de verschillende endocriene cel types direct8,9. Echter, sommige van deze neuronen hebben hun zenuwuiteinden gelegen in de extravascular ruimte, in de nabijheid van bloedvaten10. Daarom is het verschil tussen Teleost vissen en zoogdieren is niet zo duidelijk, en de relatie tussen het bloed vasculatuur en de hersenen en de hypofyse cellen vereist een groter onderzoek in Teleost vis.
Zebravis heeft, in vele aspecten, een anatomisch en functioneel vergelijkbaar vasculaire systeem aan andere gewervelde soorten11. Het is uitgegroeid tot een krachtig gewervelde model voor cardiovasculair onderzoek vooral dankzij de ontwikkeling van verschillende transgene lijnen waar componenten van het vasculaire systeem zijn gelabeld met TL-reporter eiwitten12. Nochtans, kan de nauwkeurige anatomie van de bloedsomloop tussen soorten, of zelfs tussen twee individuen variëren die tot de zelfde soort behoren. Daarom kan visualisatie van de bloedvaten van hoge rente ook in andere Teleost soorten waarvoor Transgenesis tools niet bestaan.
Verschillende technieken zijn beschreven om de bloedvaten label in zowel zoogdieren en teleosts. Deze omvatten in situ hybridisatie voor vasculatuur genen, alkalische fosfatase kleuring, microangiography, en Dye injecties (voor een herziening Zie13). Fluorescerende lipophilic kationische indocarbocyanine kleurstof (DiI) werd voor het eerst gebruikt om membraanlipiden laterale mobiliteit studie als het wordt bewaard in de lipide bilayers en kan migreren door middel van het14,15,16. Inderdaad, een molecuul van DiI is samengesteld uit twee koolwaterstof ketens en chromophores. Terwijl de koolwaterstofketens in het lipide bilayer celmembraan van de cellen in contact met het integreren, blijft chromophores op zijn oppervlakte17. Eenmaal in het membraan, DiI moleculen diffuse lateraal binnen de lipide bilayer die helpt bij de vlek membraan structuren die niet in direct contact met de DiI oplossing. Het injecteren van een DiI oplossing door middel van cardiale doorbloeding, zal daarom alle endothelial cellen in contact brengen met de verbinding waardoor directe etikettering van de bloedvat. Vandaag DiI wordt ook gebruikt voor andere kleuring doeleinden, zoals enkele molecule Imaging, Fate mapping, en neuronale tracing. Interessant, bestaan verscheidene fluorophores (met verschillende golflengten van emissie) toestaand de combinatie met andere fluorescente etiketten, en de integratie evenals de laterale verspreiding van DiI kan in zowel levende als vaste weefsels voorkomen18, 19.
Formaldehyde, ontdekt door Ferdinand Blum in 1893, is op grote schaal gebruikt om de huidige dag als de voorkeur chemische stof voor weefsel fixatie20,21. Het toont brede specificiteit voor de meeste cellulaire doelstellingen en bewaart cellulaire structuur22,23. Het bewaart ook de fluorescente eigenschappen van de meeste fluorophores, en kan zo worden gebruikt om transgene dieren te fixeren waarvoor de gerichte cellen fluorescente verslaggever proteïnen uitdrukken.
In dit manuscript is een vorig protocol ontwikkeld om de bloedvaten in kleine experimentele zoogdier modellen24 te labelen, aangepast aan het gebruik in vis. De hele procedure duurt slechts een paar uur uit te voeren. Het laat zien hoe perfuse een fixatief oplossing van formaldehyde met DiI in de vis hart om direct te labelen alle bloedvaten in de hersenen en de hypofyse van het model vis Medaka. Medaka is een klein zoet water vis inheems in Azië, voornamelijk gevonden in Japan. Het is een onderzoek modelorganisme met een reeks van moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25. Daarom, de identificatie van de bloedvaten in deze soort, alsmede in andere zal toelaten om ons begrip te verbeteren over hoe de hersenen en de hypofyse cellen interageren met bloed vasculatuur in hele weefsel of dikke plakjes weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren behandeling werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor de zorg en het welzijn van onderzoek dieren aan de Noorse Universiteit voor levenswetenschappen, en onder toezicht van erkende onderzoekers.
1. voorbereiding van instrumenten en oplossingen
- Bereid DiI voorraad oplossing oplossen van 5 mg DiI kristal in 1,5 mL plastic buis met 1 mL 96% EtOH. Vortex voor 30 s en blijf bedekt met aluminiumfolie.
Opmerking: De DiI stockoplossing kan gedurende enkele maanden in het donker worden bewaard bij-20 °C. - Bereid de vis houder (Figuur 1a) door het snijden van een stuk polystyreen tot 5 cm lengte, 3 cm breed, en 2 cm dikte, en lijmen aan een 9 cm-diameter plastic schaal. Maak een 3 cm boot vormig gat met een scalpel mes in het polystyreen.
- Bereid het perfusing systeem voor (Figuur 2) door een 30-50 cm lange plastic bril aan het uiteinde van de naald toe te voegen.
- Bereid 40 mL verse 4% Paraformaldehyde oplossing (door) door verdunning van 10 mL 16%-systeem met 30 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een plastic buis van 50 mL.
- Bereid 10 mL fixatief/DiI oplossing door 1 mL DiI stockoplossing te verdunnen in 9 mL vers bereide 4%-gewerkte in een plastic buis van 10 mL. Houd in het donker tot het gebruik.
Opmerking: De DiI kristallen die niet opgelost kunnen worden bewaard in de Stock Solution Tube, en nieuwe ethanol kan worden toegevoegd aan nieuwe DiI voorraad oplossing voor te bereiden (zie stap 1,1). -
Bereid 50 mL tricaine (MS-222) voorraad.
- Los 200 mg Tricaine poeder op in 48 mL H2O. Voeg 2 ml 1 M Tris base (pH 9) toe. Pas aan pH 7 met 1 M HCl aan en bewaar bij-20 °C.
- Verdun 5 mL Tricaine voorraad in 50 mL schoon water in een klein glas.
- Maak een paar 5 cm glazen pipetten (Figuur 2) door een glazen capillair te rekken met een pipet-trekker volgens de instructies van de fabrikant.
2. dissectie en doorbloeding
Opmerking: Het is een toxische vluchtige verbinding, waardoor de dissectie en de bloeding in een kap of in een geventileerde ruimte moeten worden uitgevoerd, en de gebruiker moet een gas masker dragen.
- Bereid de dissectie gereedschappen met inbegrip van kleine schaar, en een scherpe en een sterke Tang voor dissectie.
- Vul de spuit met de voor bereide oplossing van de DiI door deze in de 50 mL Tube te plaatsen en op te stellen. Plaats vervolgens de naald met de bril aan het uiteinde van de spuit (Figuur 2).
- Bevestig de spuit op de Bank met behulp van verschillende stukjes tape geplaatst in verschillende richtingen, pas de positie van de Microscoop en de stoel om een goede positie voor de dissectie te verkrijgen en voor het indrukken van de spuit zuiger (Figuur 1B).
Opmerking: In dit protocol, de elleboog wordt gebruikt om druk op de spuit zuiger, maar andere mogelijkheden opties kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, bijstand van een andere persoon. - Euthanaseren de vis met een overdosis van tricaine door het plaatsen van de vis in de oplossing bereid in stap 1,7. Wacht 30 s en test de reflexen van de vis door te grijpen zijn caudale Vin met de Tang. De vis kan worden gebruikt wanneer het is gestopt met reageren op de stimuli.
- Plaats de vis in de vis houder met zijn buik naar boven en pin een naald in het uiteinde van het hoofd en een ander boven de staart om de vis op zijn plaats te houden.
- Open de voorste buik met de schaar door horizontaal snijden van de oppervlakkige laag van de huid.
- Met behulp van een tang, verwijder de huid boven het hart tot een duidelijke toegang tot het ventrikel en de bol arteriosus is voorzien (Figuur 3).
- Voeg een glazen pipet toe aan het uiteinde van het capillair en breek het uiteinde van de glazen pipet.
Opmerking: Het gat van de gebroken Tip moet groot genoeg zijn om de vloeistof uit te laten, maar nog steeds klein genoeg om gemakkelijk in het weefsel. De glazen pipet kan worden hergebruikt indien niet gebroken of verstopt. - Breng het glas pipet dicht bij het ventrikel en voeg de druk om de spuit zuiger met de elleboog om de vloeistof uit te dwingen.
- PIN de hart ventrikel met de glazen pipet terwijl het toevoegen van druk op de spuit.
- Direct na, geperforeerd de sinus venosus met een tang om het bloed om de circulatie te verlaten.
Opmerking: Het hart ventrikel wordt kwetsbaarder als gevolg van de fixatief. Het wordt ook minder rood als het bloed wordt verdund met de fixatief/DiI oplossing. - Van het ventrikel, past u de hoek van het glas pipet om de ingang van de bol arteriosus te vinden. Breng de pipet opening in de bol arteriosus zoals weergegeven in Figuur 2en voeg meer druk toe aan de spuit.
Opmerking: De bol arteriosus is transparant en het weefsel is elastisch. Bij het vervangen van bloed met DiI/fixatief, de glazen pipet in het hart moet meer zichtbaar worden en door het toevoegen van druk, de grootte van de bol arteriosus moet uitbreiden. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat er voldoende druk is gebruikt om al het bloed te vervangen door de fixatief/DiI oplossing, en dat alle bloedvaten zijn bereikt. Vaak als het succesvol is, provoceert het GAASje spiercontracties en de vis zal bewegen. - Doorgaan met het toevoegen van druk op de spuit voor 30-60 s nog steeds het houden van de glazen pipet in de bol arteriosus.
- Verwijder de glazen pipet en de naalden van de vis.
- Ontleden de hersenen en de hypofyse, en broeden weefsels in verse 4%-gedenkplaats in PBS voor 2 h in het donker bij kamertemperatuur.
Opmerking: Dissectie van de hersenen en de hypofyse eerder is beschreven in detail op twee verschillende manieren door Fontaine et al.26 en Ager-Wick et al.27. Vanwege de fixatie, het weefsel wordt heel hard en de fragiele verband tussen de hersenen en de hypofyse kan worden gebroken. Na dissectie, kan de post fixatie verwerking ook overnachten bij 4 °C worden uitgevoerd. - Spoel het weefsel tweemaal in PBS voor 10 min voor de voorbereiding voor de beeldvorming.
Opmerking: Het weefsel kan vervolgens worden gemonteerd tussen dia en deksel slip met afstandhouders tussen en montage medium voor confocale beeldvorming (Zie Figuur 4), of een deel met een vibratome, zoals beschreven in detail in Fontaine et al.26 voor de montage tussen glij-en Afdekstrook voorbeeld vorming met een stereomicroscoop (Zie Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol toont een stap voor stap procedure om de bloedvaten label in de Medaka hersenen en de hypofyse, en op hetzelfde moment vast het weefsel. Na etikettering door cardiale injectie van een fixatieve oplossing die DiI in het hart bevat, kunnen de bloedvaten op schijfjes worden waargenomen met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 4) of op geheel weefsel met behulp van een confocale Microscoop (Figuur 5). Hetzij op de dikke tissue slice of op het hele weefsel, de architectuur van het bloed vasculatuur kan worden waargenomen in drie dimensies. Weefsel Slices kunnen worden gelabeld voor specifieke gerichte eiwitten met behulp van standaard immunofluorescentie protocollen na het einde van de fixatie, en op transgene lijnen waar de cellen van belang Express fluorescerende reporter eiwitten (Figuur 6). Dit maakt onderzoek naar interacties tussen bloedvaten en andere specifieke soorten cellen. Hier bijvoorbeeld, het gebruik van een transgene lijn van Medaka waar groene fluorescerende eiwitten (GFP)-producerende cellen onthulde de locatie van de hypofyse LH cellen28. Men kan opmerken dat deze cellen uitbreidingen naar de bloedvaten sturen. Sommige bloedvaten kunnen niet goed worden geëtiketteerd als de doorvoer is sub-optimaal. Dit kan bijvoorbeeld het geval zijn als de oplossing wordt geïnjecteerd in het hart ventrikel in plaats van de bol arteriosus, of bij gebruik van te lage druk en/of te kort een periode op de spuit zuiger (Figuur 7). Ten slotte, door beeldvorming hetzelfde weefsel met dezelfde beeldvorming parameters, de intensiteit van de etikettering werd aangetoond dat afnemen na vier dagen, met het signaal meer verspreid (Figuur 8).
Figuur 1 : Beelden van de holding plaat voor de doorbloeding van de vis (A) en de injectie opstelling (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Schema van de Medaka vis hart-en transfusie systeem getoond met de Idel locatie van de glazen naald in het hart voor een succesvolle doorbloeding. Het hoofd van de pijl toont waar te perforeren het hart om het bloed toe te staan om omloop te verlaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Beeld van de buikzijde van de vis geopend, met het hart blootgesteld voor de door bloeding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Beeld van het bloed vasculatuur in een plakje van de hersenen en de hypofyse weefsel van Medaka. Een volwassen Medaka was doorbloede met een fixatieve oplossing met DiI. Hersenen en de hypofyse werden ontleed en vast 's nachts. De weefsels werden opgezet in 3% agarose en werden met een vibratome vóór weergave met een fluorescentiemicroscoop gesegmenteerd. Alle bloedvaten gelabeld met DiI worden gezien door de hele sectie waarin de vasculatuur in de hersenen en de hypofyse. OT = optische Tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = kleine hersenen; Hind = achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : 3D-rendering van een confocale z-stack van het bloed vasculatuur in Medaka hypofyse. Een volwassen Medaka was doorbloede met een fixatieve oplossing met DiI. Hersenen-hypofyse werden ontleed en vast 's nachts. De hypofyse werd ontleed uit de hersenen en gemonteerd tussen een glijbaan en dekglaasje met afstandhouders IB tussen, voordat Imaging met een confocale Microscoop. Z-stack werd opgenomen, en een 3D-rendering werd gemaakt met behulp van Fiji-software en de 3D-viewer plugin29. De gehele hypofyse bloed vasculatuur zou kunnen worden waargenomen in 3D. RPD = rostrale pars distalis; PPD = proximale pars distalis; PI = pars intermedia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Z projectie van confocale z-stack van een tissue slice van transgene Medaka waar Lhβ promotor de expressie van groene fluorescent reporter proteïne controleert. Een volwassene TG (LHB: hrGfpII) Medaka was doorbloede met een fixatief oplossing met DiI. Hersenen-hypofyse werden ontleed en vast 's nachts. De weefsels werden opgezet in 3% agarose en werden met een vibratome. Sommige hormoon producerende cellen, LH-cellen in dit geval, het verzenden van extensies (pijltjes koppen) naar de bloedvaten kunnen worden waargenomen, waarschijnlijk te voelen signalen uit het bloed en/of hun hormonen vrij te geven in de circulatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7 : Beeld van bloed vasculatuur in een plakje van de hersenen en de hypofyse weefsel van slecht doorbloede Medaka. Een volwassen Medaka was slecht doorbloede met een fixatief oplossing met DiI door het injecteren van de oplossing in het ventrikel alleen. Hersenen-hypofyse werden ontleed en vast 's nachts. De weefsels werden opgezet in 3% agarose en werden met een vibratome vóór weergave met een confocale Microscoop gesegmenteerd. De bloedvaten waren slecht gelabeld met DiI en sommige van hen waren niet geëtiketteerd op alle. OT = optische Tectum; Tel =, telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = kleine hersenen; Hind = achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8 : Time lapse beeldvorming van het label Blood vasculatuur in Medaka hersen-hypofyse weefsel sectie. Een volwassen Medaka was doorbloede met een fixatieve oplossing met DiI. Hersenen-hypofyse werden ontleed en vast 's nachts. Weefsels werden gemonteerd in 3% agarose en met een vibratome voordat Imaging met een stereomicroscoop direct na montage (a), en 4 dagen na montage (B) met dezelfde imaging parameters. Merk op dat de etikettering is gedaald en verspreid met de tijd. OT = optische Tectum; Tel = telencephalon; Hyp = hypothalamus; Pit = hypofyse; CB = kleine hersenen; Hind = achterhersenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiale transfusie met DiI eerder is gebruikt om de bloedvaten label in verschillende modelsoorten24, met inbegrip van Teleost Fish13.
Aangezien DiI rechtstreeks wordt geleverd aan het endothelial celmembraan door middel van doorbloeding in de vasculatuur, is het mogelijk om de signaal-ruisverhouding te verhogen door de DiI concentratie in de fixatie oplossing te verhogen. Bovendien, de fluorophore biedt intense kleuring wanneer opgewonden met een minimale bleken waardoor relatief langdurige emissie18,30. Ook kan de etikettering blijven voor meerdere dagen en worden gebruikt in combinatie met andere etiketterings technieken die milde behandelingen nodig, zoals in immuofluorescence (IF)31.
Echter, deze techniek heeft een aantal beperkingen. Na verwijdering van de fixatieve oplossing, etikettering en beeldvorming van de weefsels moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, omdat de intensiteit van de etikettering zal verzwakken, en het signaal zal diffuus met de tijd (Figuur 8). Dit proces zal nog sneller bij het gebruik van detergenten die de porositeit van het membraan te verhogen. Ook, omdat het een toxische vluchtige verbinding is, moeten verschillende voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het uitvoeren van dit experiment. Om de gevaarlijke aspecten van dit protocol te minimaliseren, kan men perfuse een oplossing van DiI en PBS voor het ontleden van het weefsel van belang en bevestig het met de oplossing direct na het doorbloeding. Echter, dit kan alleen worden uitgevoerd voor kleine weefsels, omdat de penetratie van het platform in grotere weefselmonsters minder efficiënt zal zijn dan tijdens de doorbloeding.
Het succespercentage van dit protocol is verbeterd door opleiding, dus het is te verwachten dat onderzoekers wat tijd nodig om kennis te maken met de verschillende stappen van de techniek. Bijvoorbeeld, de doorbloeding van de oplossing in de bol arteriosus is een bijzonder kritieke stap van het protocol en vereist enige training om een goed resultaat te bereiken. Ook het houden van de naald in de juiste positie voor lang genoeg tijdens de doorbloeding is niet triviaal, en vereist opleiding door de manipulator.
Ten slotte is dit protocol geoptimaliseerd voor volwassen medaka, maar het kan worden gebruikt voor andere soorten met een aantal aanpassingen. Verschillende weefsels van belang, of zelfs verschillende levensstadia van het dier binnen hetzelfde weefsel zal ook nodig optimalisaties voor de concentratie van DiI en het tijdstip van de doorbloeding, alsmede het gebruikte materiaal (naald en spuit maten bijvoorbeeld).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Wij danken Dr. Medaka Kanda voor de demonstratie van cardiale doorbloeding met fixatieve oplossing in, mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor hulp bij Medaka veeteelt, en de heer Anthony Peltier voor illustraties. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad van het onderzoek van Noorwegen, toelage nummer 248828 (digitaal leven het programma van Noorwegen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Syringe PP/PE without needle | Sigma | Z116866-100EA | syringes |
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma | Z118044-100EA | needles 18G (1.20*40) |
| Borosilicate glass 10 cm OD 1.2 mm | sutter instrument | BF120-94-10 | glass pipette |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D-282 | |
| LDPE tube O.D 1.7 mm and I.D 1.1 mm | Portex | 800/110/340/100 | canula |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) solution | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 391-0442 | |
| Super glue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
References
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M.
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magistretti, P. J. Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. Zigmond, M., et al. , Academic Press. 389-413 (1999).
- Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. Pituitary cell lines and their endocrine applications. Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).
- Knigge, K. M., Scott, D. E. Structure and function of the median eminence. American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).
- Knowles, F., Vollrath, L. Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel. Nature. 206 (4989), 1168 (1965).
- Knowles, F., Vollrath, L. Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).
- Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish. Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Cha, Y. R., Weinstein, B. M. Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).
- Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M.
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).
- Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane. Science. 195 (4275), 307-309 (1977).
- Johnson, M., Edidin, M. Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization. Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).
- Axelrod, D. Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization. Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures. Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Puchtler, H., Meloan, S. N. On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions. Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).
- Hoetelmans, R. W. M., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Li, Y. W., et al. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).
- Fontaine, R., et al. Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish. Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).
