Summary
Præsenteret her er en protokol for spontan generation af Neuro kugler beriget i neurale stamceller fra høj densitet belagte neuroner. Under det samme eksperiment, når neuroner er belagt med en lavere tæthed, protokollen resulterer også i langvarige primære rotte neuron kulturer.
Abstract
Primær neuron kultur er en vigtig teknik inden for neurovidenskab. For at få dybere mekanistisk indsigt i hjernen, er det vigtigt at have en robust in vitro-model, der kan udnyttes til forskellige neurobiologi undersøgelser. Selvom primære neuron kulturer (dvs., langsigtede hippocampus kulturer) har givet videnskabsfolk med modeller, er det endnu ikke repræsentere kompleksiteten af hjernen netværk helt. I kølvandet på disse begrænsninger, en ny model er opstået ved hjælp af Neuro kugler, som bærer en tættere lighed med hjernevæv. Denne protokol beskriver belægningen af høje og lave tætheer af blandede kortikale og hippocampus neuroner isoleret fra embryo af embryonale dag 14-16 Sprague Dawley rotter. Dette giver mulighed for generering af Neuro kugler og langsigtet primær neuron kultur som to uafhængige platforme til at gennemføre yderligere undersøgelser. Denne proces er ekstremt enkel og omkostningseffektiv, da den minimerer flere trin og reagenser, der tidligere blev anset for essentielle for neuron kulturen. Dette er en robust protokol med minimale krav, der kan udføres med opnåelige resultater og yderligere anvendes til en mangfoldighed af undersøgelser relateret til neurovidenskab.
Introduction
Hjernen er en indviklet kredsløb af neuronal og ikke-neuronal celler. I årevis har forskerne forsøgt at få indsigt i dette komplekse maskineri. For at gøre det, neuroforskere oprindeligt tyet til forskellige transformerede nerve-baserede cellelinjer til undersøgelser. Men, den manglende evne af disse klonale cellelinjer til at danne stærke synaptiske forbindelser og ordentlig axoner eller dendritter har skiftet videnskabelig interesse for primære neuron kulturer1,2. Det mest spændende aspekt af primær neuron kultur er, at det skaber en mulighed for at observere og manipulere levende neuroner3. Desuden er det mindre kompleks i forhold til neurale væv, hvilket gør det til en ideel kandidat til at studere funktion og transport af forskellige neuronal proteiner. For nylig har flere udviklinger inden for mikroskopi, genomforskning og proteomics skabt nye muligheder for neuroforskere til at udnytte neuron kulturer4.
Primære kulturer har gjort det muligt for neuroforskere at udforske de molekylære mekanismer bag neurale udvikling, analysere forskellige neurale signalering veje, og udvikle en mere sammenhængende forståelse af synapse. Selv om en række metoder har rapporteret kulturer fra primære neuroner (for det meste fra hippocampus oprindelse5,6,7), en samlet protokol med en kemisk defineret medium, der muliggør langsigtet kultur af neuroner er stadig brug for. Men, neuroner belagt ved en lav tæthed er oftest observeret, som ikke overlever langsigtede, sandsynligvis på grund af manglen på trofisk støtte8 , der leveres af de tilstødende neuroner og gliaceller celler. Nogle metoder har endda foreslået Co-culturing af de primære neuroner med gliale celler, hvor de gliale celler bruges som en feeder lag9. Men, gliaceller celler udgør en masse problemer på grund af deres overvækst, som undertiden tilsidesætte neuronal vækst10. Derfor, i betragtning af problemerne ovenfor, en enklere og mere omkostningseffektiv primær neurale kultur protokol er påkrævet, som kan bruges af både Neuro biologer og Neuro kemikere til undersøgelser.
En primær neuron kultur er i det væsentlige en form for 2D-kultur og repræsenterer ikke plasticitet, rumlig integritet, eller heterogenitet af hjernen. Dette har givet anledning til behovet for en mere troværdig 3D-model kaldet Neuro kugler11,12. Neuro kugler præsentere en roman platform til neuroforskere, med en tættere lighed med den virkelige, in vivo hjernen13. Neuro kugler er ikke-klædige 3D-klynger af celler, der er rige på neurale stamceller (NSCs), neurale progenitorceller (NPC'er), neuroner og astrocytter. De er en glimrende kilde til isolering af neurale stamceller og neurale progenitorceller, som kan bruges til at studere differentiering i forskellige neuronal og ikke-neuronal lineages. Igen, variabilitet i Neuro Sphere kulturer produceret ved hjælp af de tidligere rapporterede protokoller udgør en barriere for formuleringen af en samlet Neuro Sphere kultur protokol14.
Dette manuskript præsenterer en protokol, hvor det er muligt at generere både 2D-og 3D-platforme ved skiftende celle plating tætheder fra en blandet kortikal og hippocampus kultur. Det bemærkes, at inden for 7 dage frie-flydende Neuro kugler er opnået fra high-density belagte neuroner isoleret fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo, som på yderligere kultur, danner broer og sammenkoblinger gennem radiale glial-lignende extensions. På samme måde opnås en primær neuron-kultur, der kan opretholdes i op til 30 dage, ved at ændre vedligeholdelses mediet to gange om ugen i de lavdensitets belagte neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer, der involverer dyr, blev godkendt af den institutionelle dyreetiske Komité for CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/møde/Apr/2018/1).
1. klargøring af reagens og medier
- Poly-D-lysin (PDL) opløsning: Forbered PDL-opløsninger ved koncentrationer på 0,1 mg/mL i deioniseret vand, og opbevar dem i 4 °C indtil brug.
- Dissociations medium: til 1 L sterilt, filtreret deioniseret vand, Kombiner følgende komponenter i de respektive koncentrationer: natriumchlorid (8 mg/ml), kaliumchlorid (0,4 mg/ml), kaliumphosphat monobasisk (0,06 mg/ml), D-glucose (1 mg/ml), natriumphosphatdibasic (0,479 mg/mL) og 1 M HEPES [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethansulfoninsyre; 10 mM]. Vortex alle komponenterne for at hjælpe korrekt blanding og opbevares i 4 °C indtil brug.
Bemærk: Brug dissociations mediet i iskold form under dissociation, men ved stuetemperatur (RT) til vask og andre formål. - Plating medium: plating medium består af følgende: minimum Essential medium (MEM) ørne med Earles afbalancerede salt opløsning (BSS; 88,4%), D-glucose (0,6%), heste serum (10%) og penicillin/streptomycin (1%). Kombiner komponenterne i de respektive nøgletal og Udfør proceduren inde i en hætte under sterile forhold.
Bemærk: Brug altid frisklavet plating medium for at undgå nedbrydning af nogen komponent. - Vedligeholdelses medium: Forbered vedligeholdelses mediet ved at kombinere følgende i de respektive nøgletal: Neuro basal medium (97%), 0,5 mM kommercielt opnået glutamin prøve, B27 serum-fri supplement (2%), og penicillin/streptomycin (1%). Kombiner komponenterne i de respektive nøgletal og Udfør proceduren inde i en hætte under sterile forhold. Sørg for, at alle komponenter er frisklavede.
2. klargøring af dæksedler
- Tag en 12 mm diameter rund glas dækseddel og sug den i 1 M saltsyre (HCl) i 4 timer.
- Overfør dæksedlerne i destilleret vand ved hjælp af et par tang, og drej det forsigtigt for at slippe af med syren helt.
- Overfør de vaskede dæksedler til en ekstra rengørings runde i et bægerglas med 100% ethanol.
- Før du bruger dæksedlerne, tør dem godt i laminar hætten ved at holde dem på silkepapir.
3. fremstilling af poly-D-lysin belagte plader til Neuron kultur
- Tag 2 24 brønd plader: en for høj tæthed plating og en anden for lav tæthed plating. Åbn kun de sterile pakninger inde i laminar hætten.
- Overfør de 12 mm sterile glas dæksedler i de 24 brønd plader.
- Hæld 300 μL PDL-opløsning (0,1 mg/mL i deioniseret vand) i hver brønd, så det fuldt ud dækker overfladen af dæksedlerne.
- Wrap pladerne med aluminiumsfolie for at forhindre tørring og holde det i CO2 inkubator natten over.
- Den næste dag (før plating), aspirerer PDL-opløsningen og vaskes korrekt med 300 μL sterilt deioniseret vand to til tre gange.
- Tilsæt 200 μL frisklavet plating medium og returnere pladerne til inkubator indtil plating.
4. fjernelse og hugning af fosteret
Bemærk: Steriliser alle kirurgiske instrumenter pakket i aluminiumsfolie i en autoklave ved 121 °C (15 PSI) i 30 min. Dette omfatter et par stump-ende saks, pincet, fine pincet, to fine saks, og en arterie pincet for hele proceduren.
- For at generere neuroner og Neuro kugler, bruge en tidsindstillet gravid Sprague Dawley rat og markere dagen med vaginal plug Detection som e0.
Bemærk: kulturen skal udføres mellem E14-E16. - På kulturdagen skal du placere en steril glas Petri plade på is og fylde den med kold Hank's afbalancerede salt opløsning (HBSS).
- Anesthetize en E14-E16 gravid rotte med en intraperitoneal (IP) injektion af 90 mg ketamin/kg legemsvægt og 10 mg xylazine/kg, derefter offer ved at udføre livmoderhals dislokation.
Bemærk: rotter kan også aflives af en overdosis af pentobarbital eller overdosering af ketamin med xylazin eller Diazepam. - Steriliser dæmningens mave ved at sprøjte 70% ethanol og lav et V-formet snit i abdominalområdet ved hjælp af sterile pincet og et par stump ende saks.
- Tag de embryonale sække forsigtigt på Petri pladen med kold HBSS-opløsning.
Bemærk: Brug ikke de samme pincet og sakse, der bare blev brugt til huden, da dette vil forurere de indre organer. Brug et andet sæt saks/pincet til de indre organer. - Tag embryonerne ud af embryonale sække i frisk, kold HBSS.
- Decapitate hovedet med steril saks.
5. fjernelse af hjernen og dissektion af cortex med hippocampus
- Før du starter, skal du fylde 90 mm sterile Petri skåle med koldt, sterilt HBSS.
- Overfør hovederne i de sterile retter ved hjælp af sterile, stump-endte dressing pincer.
- Under stereomikroskopet, hold hovedet fra snude regionen med sterile, savtakket æg tang og fjern hjernen ved at skære huden og kraniet åbent.
- Saml alle embryo hjerner på samme måde i HBSS-løsningen.
- Fjern alle meninges fra halvkugler og midthjernen ved at holde hjernestammen.
- Fjern forsigtigt de intakte halvkugler ligner svampe hætter, der indeholder hippocampus og cortex.
- Saml de halvkugler, der indeholder cortex og intakt hippocampus, i et 15 mL konisk rør, der indeholder 10 mL dissociations medium.
6. dissociation af kortikale og hippocampus væv i enkelt neuroner
- Lad de indsamlede væv slå sig ned og aspirere dissociations mediet, så 5%-10% af mediet er i det.
- Tilsæt 10 mL frisk dissociations medium til vævet, og Gentag trin 6,1 to gange.
- Tilsæt 4,5 mL dissociations middel og 0,5 mL 0,25% (1x) trypsin EDTA (ethylendiamintetraacetat) opløsning.
- Opbevar vævet i inkubator ved 37 °C i 20 minutter for fordøjelsen at fortsætte.
- Aspirer mediet, og tilsæt 10 mL dissociations-og plating medium fortløbende til det fordøjet væv.
- Lad de Ford øjede væv slå sig ned og aspirere dissociations mediet. Tilsæt 2,5 mL plating medium og hæld i bunden af en 90 mm steril skål.
- Triturate de Ford øjede væv i hjørnet bunden af skålen ved hjælp af en 1.000 μL pipettespids til at besætte den minimale volumen.
- Den opnåede cellesuspension passerer gennem 70 μm-celle sien, bortset fra klumper af væv.
- Bestem tætheden af levedygtige celler ved hjælp af trypan og et blå farvestof udelukkelse metode og tælle antallet af celler i en automatiseret celle tæller.
- For trypan og et Blue-udelukkelsesmetoden skal du tage 10 μL af cellesuspensionen og 10 μL 0,4% trypan og et blå plet, Bland grundigt og tilsæt 10 μL af blandingen i et af de to lukkede kamre i de disponible kammer skred.
- Indsæt det dias, der indeholder blandingen, i celle tælleren, og få læsningen.
Bemærk: trypan og et blå farvestof udelukkelse metode er baseret på princippet om, at levende celler (på grund af deres intakt membraner) vil udelukke trypan og et blå farvestof og vil derfor vise en klar cytoplasma, sammenlignet med en ikke-levedygtig celle, der nemt vil tage op trypan og et blå og vises blå i farve15.
- Antallet af celler, der er opnået, fortyndes til 1,5 x 105 celler/ml for høj densitet og 20.000 celler/ml for lav densitet i to separate rør, der indeholder 30 ml hver af plating mediet.
- Aspirere den tidligere tilsat plating medium fra hver brønd og plade 500 μL af celler spredt i plating medium i hver brønd.
- Derefter returneres pladerne til inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 4 h.
- Undersøg cellerne for overholdelse under mikroskop 4 h efter plating.
- Hvis cellerne er korrekt påløbet i begge plader, skal mediet udskiftes i hver brønd med 500 μL frisk vedligeholdelses medium og inkubater ved 37 °C.
- Kultur disse neuroner dyrkes ved lav densitet i 30 dage ved at ændre vedligeholdelses mediet 2x pr. uge.
- Kultur Neuro kugler opnået fra high-density belagte neuroner i samme vedligeholdelses medium ved at overføre dem til de ultra-lave fastgørelses plader.
- Karakterisere neuroner og Neuro kugler ved immun farvning dem med vigtige markører. For immunocytochemistry, først fastsætte cellerne/Neuro kugler ved hjælp af 4% formaldehyd for 30 min på pladen selv, derefter permeabilize cellerne med 0,1% non-ionisk vaskemiddel i 10 min.
- Tilsæt primære antistoffer for både neuroner (anti-Tuj1, GFAP, O4, Tau) og Neuro kugler (anti-Nestin, GFAP, Tuj1) i fosfat-bufferet saltvand (PBS) ved 1:300 koncentrationer og Inkuber natten over ved 4 °C16.
Bemærk: Tuj1 (klasse III β-Tubulin) og Tau er positive markører for de primære neuroner, mens GFAP (glial fibrillært syreholdigt protein) og O4 (oligodendrocyt markør) er negative markører for primære neuroner17,18. I tilfælde af Neuro kugler, Tuj1, GFAP, og nestin alle tjene som positive markører19,20. - Næste dag, vask cellerne med PBS en eller to gange og tilsæt passende sekundære antistoffer i PBS ved 1:600 koncentrationer ved RT for 2 h.
Bemærk: anti-Mouse eller anti-kanin sekundære antistoffer vælges afhængigt af værts arterne af det primære antistof tilsat. Det skal erindres, at de sekundære antistoffer skal konjugeres til fluorescens derivater, der egner sig til fluorescens mikroskopi. - Cellerne vaskes igen med PBS en eller to gange.
- Udfør nuklear farvning af cellerne med Hoechst 33258 (1 mg/mL stamopløsning i deioniseret vand). Forbered 0,1% Hoechst-opløsning i PBS fra stamopløsningen, og tilsæt den til cellerne.
- Cellerne skal inkubates med 0,1% Hoechst-opløsning i 30 minutter, hvorefter de vaskes igen med PBS.
- Tilsæt 20 μL PBS (eller monterings medium) på sliden, og monter langsomt coveret med de farvede celler over det område af diaset, der indeholder PBS. Forsegl margenerne af dæksedlen med dibutylphthalat polystyren xylen (DPX).
- Udfør billeddannelse af de faste celler under et mikroskop ved 10x og 40x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol, en enkel strategi er blevet belyst, hvor variabel celle plating tætheder fra to forskellige neurale screening platforme er opnået. Figur 1a,B illustrerer tilslutningen af celler efter 4 h af plating neuroner i høj og lav densitet belagte celler, hhv. Ved at observere den korrekte overholdelse af neuronerne, som vist i figur 1, blev overfladebelægningen erstattet af vedligeholdelses medium i hver af brøndene og vendte dermed tilbage til inkubator ved 37 °c. Relativt mere celle tilslutning blev observeret i high-density belagte neuroner. Efter 24 timer af plating, både høj og lav densitet belagte neuroner viste udførlige neuronal extensions og synaptisk sammenkoblinger, som observeret i differential interferens kontrast (dic) billeder i figur 2a,B.
I figur 3aer et fasekontrast billede af de lavdensitet-belagte neuroner efter 7 dage i kulturen repræsenteret. Her har neuronerne udviklet et omfattende synaptisk netværk bestående af dendritiske grene. Disse neuroner kan yderligere opretholdes i op til 30 dage ved at ændre vedligeholdelses mediet hver 3 dag med udviklingen af mere indviklede neuronal netværk. I figur 3b,C, immunocytochemical farvning blev udført for at afsløre neuronal karakter af lav densitet kultur neuroner ved farvning med neuronal markører Tuj1 (en markør af differentierede neuroner)21 og Tau (en markør af axons)22 , hhv. Den røde farve i figur 3b indikerer tilstedeværelsen af Tuj1 farvning, og grøn i figur 3c repræsenterer farvning i axonerne af primære neuroner. Renhed af neuronal kultur er vist ved fravær af farvning af ikke-neuronal markører for GFAP af astrocytter (figur 3D) og O4 af oligodendrocytter (figur 3e). Kerner vist i blåt blev plettet med Hoechst 33258.
Den høje densitet belagt neuroner efter 7 dage er præget af dannelsen af spontane Neuro kugler, som det ses i figur 4a,B,C,D. Efter 8-10 dage blev der observeret særskilte broer bestående af radiale gliale som forlængelser mellem Neuro kugler, som det ses i figur 4E. Neuro kugler var rigt begavet med NPC'er, som coexpress markører Nestin og Tuj123. Neurospeheres viser positiv farvning af Nestin og tuj, som vist i figur 524. De kerner, der blev vist i blåt, blev farvet med Hoechst 33258. Disse Neuro kugler kan opretholdes i flere uger ved at dyrkning dem i ultra-lave fastgørelses plader. I figur 6blev levetiden for neuroner, der dyrkes i ca. 30 dage, vurderet, og cellens levedygtighed blev målt med et interval på ~ 5 dage ved hjælp af den konventionelle MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid], hvor det blev fundet, at neuronerne viste mere end 90% levedygtighed selv efter 30 dages kultur.
Næste, procentdelen af astrocytter i den høje og lav tæthed seedede kulturer blev vurderet. Da denne metode er primært rettet mod dyrkning neuroner, det var vigtigt at vurdere, om denne metode understøtter præference vækst af neuroner over ikke-neuronal celler, især astrocytter. Tilstedeværelsen af en population af astrocytter blev observeret i Neuro Sphere-danner høj tæthed seedede kultur, præget af den grønne farve af GFAP farvning i figur 7a; selv om, betydeligt mindre blev observeret i forhold til Tuj1 (rød)-farvede neuronal population. Dette blev også bekræftet af de kvantitative data i figur 7b, hvor ~ 17% populationer af celler var GFAP-udtrykte, sammenlignet med 83% af befolkningen i Tuj1 udtrykker celler.
Den astrocytiske population blev også undersøgt gennem GFAP farvning, sammenlignet med neuronal population (Tuj1 farvning) i lav tæthed seedede celler, for 7 kontinuerlige dage. Selv om en betydelig forskel i det samlede celleantal ikke blev observeret i løbet af 7 dage, på grund af lav såning, astrocyt populationen blev også observeret for at være meget lav (næsten ingen eller meget lav GFAP farvning), med et flertal er den neuronal population (meget højt Tuj1 udtryk) som observeret i figur 8a.
Som vist i figur 8b, kvantitativ analyse blev udført ved at tælle befolkningen af astrocytter og neuroner opnået gennem mikroskopi ved hjælp af cellsens software, hvor kun ~ 2%-3% af astrocyt populationen blev oprindeligt observeret. På grund af manglen på egnede medier og næringsstoffer til at støtte sin vækst, denne population af astrocytter også langsomt omkom over tid, mens der i nærværelse af optimale faktorer og medier, neuroner hurtigt overtog hele kulturen.
Som vist i figur 9, blev det observeret, at på grund af tilstedeværelsen af NPCs, Neuro kugler udtrykte også store mængder af astrocytter, præget af den stærke grønne signal af GFAP farvning sammen med en stærkere Tuj1 signal. Endelig, at observere, om disse Neuro kugler ekspanderet over tid, efter 1 uge med høj densitet kultur, på hvilket tidspunkt de små Neuro kugler begyndte at danne, et par blev overført i ultra-lav fastgørelses plader og deres vækst blev overvåget hver 5 dage for op til 15 dage.
En levende/døde celle analyse blev også udført ved hjælp af værelse am (grøn) og propidium kaliumiodid (rød) for at kontrollere sundheden af cellerne. Det blev observeret, at de ekspanderende Neuro kugler viste en stor mængde grøn fluorescens uden rød farvning, indikerer ingen død forekommer i Neuro kugler i mindst op til 15 dage i kulturen, som præsenteret i figur 10a. Som vist i figur 10bblev der observeret voluminøs ekspansion af Neuro sfærerne hver 5 dage i kulturen i op til 15 dage. For at afbilde linjegrafen, der repræsenterer den eventuelle stigning i mængden af Neuro kugler (for hvert tidspunkt), blev 50 Neuro kugler undersøgt, og deres gennemsnit blev brugt til at udlede Neuro Sphere volumener på hvert tidspunkt.
Figur 1 : Repræsentation af celle tilslutning efter 4 h plating. (A) celle tilslutning i høj densitet belagte neuroner. (B) celle tilslutning i lavdensitet belagte neuroner. Skala bjælken i (A, B) er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Celle morfologi af neuroner efter 24 timers plating. (A) celle morfologi af højdensitet belagte neuroner. (B) celle morfologi af lavdensitet belagte neuroner. Skala stænger i (A, B) repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Morfologi og karakterisering af lavdensitet belagte neuroner efter 7 dage. (A) fase-kontrast billede af neuroner, der viser omfattende spiring. Scale bar repræsenterer 200 μm. overlay billeder, der viser udtryk for neuronal proteiner (B) Tuj1 (rød) og (C) Tau (grøn). Immnunocytochemistry viser tydeligt fravær af farvning i ikke-neuronale proteiner (D) GFAP (grøn) og (E) O4 (rød). Kerner blev plettet med Hoechst 33258 (blå). Skala stænger i (B, C, D, E) repræsenterer 20 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Dannelse af Neuro kugler i høj densitet belagte neuroner efter 7 dage. (A-D) Spontant genererede Neuro kugler efter 7 dage i kulturen fra high-density belagte neuroner. E) dannelse af radiale gliallignende forlængelser mellem to nyligt dannede Neuro kugler som indikeret med sorte pile. Skala stænger i (A, B, C, D, E) repræsenterer 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Karakterisering af de opnåede Neuro kugler. Overlay billede af Neuro kugler viser udtryk for neuronal protein Tuj1 (rød) og neurale stamcelle markør nestin (grøn), indikerer en NPC-rige population. Kerner blev plettet med Hoechst 33258 (blå). Scale bar repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Cellelevedygtighed for primære neuroner. Søjlegrafen repræsenterer cellernes levedygtighed for de primære neuroner, vurderet ved hjælp af en MTT-analyse i op til 30 dage med 5 dages intervaller. Fejllinjen repræsenterer SD af værdien (* p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Karakterisering af neurosphere-danner høj tæthed kulturer med neuronal markør Tuj1 og astrocyt markør GFAP. (A) billedet viser høj tæthed seedede celler (i dic-tilstand), som genererer neuropsheres udtrykker både GFAP (for astrocytter) og Tuj1 (for neuroner). Kerner blev plettet med Hoechst 33258. Scale bar repræsenterer 20 μm. (B) søjlegraf repræsenterer den procentdel af populationen af Tuj1-ekspression celler og GFAP-ekspression celler i sfære genererer høj tæthed celler. Fejllinjen repræsenterer SD (* p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Karakterisering af lavdensitet belagte celler til primær neuron kultur med neuronal markør Tuj1 og astrocyt markør GFAP kontinuerligt op til 7 dage. (A) billedet viser de lavdensitet seedede celler i fire forskellige kanaler (dvs., dic, blå kanal [angiver nuklear farvning af Hoechst 33258], grøn kanal [GFAP farvning], og røde kanal [for Tuj1 farvning]) i 7 dage kontinuerligt. Skalalinjen repræsenterer 20 μm. (B) søjlegrafen repræsenterer den procentvise ratio af populationer af Tuj1-ekspression celler til den af GFAP-udtrykte celler i lav tæthed seedede celler for primær neuron kultur i 7 dage. Fejllinjen repræsenterer SD (* p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Immun farvning af opnåede Neuro kugler med GFAP og Tuj1. Billeder af de opnåede Neuro kugler er (A) i dic-tilstand, (B) Nucleus farvning ved hjælp af Hoechst 33258, (C) astrocyt markør GFAP (grøn), og (D) neuronal markør Tuj1 (rød). Scale bar repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Vækst og levende/døde celle assay af Neuro kugler over 15 dage. (A) billedet viser væksten af en sfære over 15 dage ved 5-dages intervaller i dic-tilstand, samt dens farvning med værelse am (grøn indikerer levende celler) og PI (propidium kaliumiodid med en rød farve indikerer døde celler). Scale bar repræsenterer 20 μm. (B) grafen repræsenterer stigningen i størrelsen af Neuro kugler dyrket i lav vedhæftning plader over en periode på 15 dage med 5 dages intervaller. Fejllinjen repræsenterer SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man ved at ændre celle plating tætheder af primære neuroner, to variable neuronal platforme opnås. Selv om dette er en simpel metode, skal hvert trin omhyggeligt udføres for at opnå de ønskede resultater. Andre tidligere metoder har enten rapporteret langsigtede primære neuron kulturer eller sfære kulturer. De fleste primære neuron kultur protokoller har involveret dyrkning af hippocampus neuroner for 3-5 uger, men de fleste har fejlet, som neuroner dør og visne væk på grund af tab af forbindelser. En anden fordel ved protokollen er, at neuronerne kan dyrkes uden behov for nogen gliaceller feeder lag, dermed opretholde renhed af neuroner.
Men, flere kritiske trin skal følges nøje for at opnå de ønskede resultater. For det første er det absolut nødvendigt at opretholde sterile forhold overalt. Det tilrådes at udføre de fleste trin i en laminar hætte samt pre-rense alle plader, instrumenter og kirurgiske værktøjer med 70% alkohol, før du starter; ellers er der en højere chance for fiasko på grund af kontaminering af bakterier og svampe. Dernæst er det vigtigt at isolere E14-16 embryoner; Derfor bør vaginal plug Detection trin omhyggeligt udføres. Som den embryonale dag stiger, jo højere er chancerne for kontaminering af ikke-neuronal celler. Fuldstændig fjernelse af meninges fra halvkugler er yderst kritisk at reducere interferens i kulturen ved ikke-neuronal celler. Både plating og vedligeholdelse medium skal være frisk tilberedt med alle de komponenter, som hver komponent spiller en væsentlig rolle. En anden faktor, der skal holdes i tankerne er, at de primære neuroner opnået skal opretholdes ved at ændre vedligeholdelsen medium 2x om ugen, således at næringsstof forsyningen til de prolifererende neuroner forbliver konstant.
Selv om det endnu ikke er blevet forsøgt, denne protokol med små modifikationer kan også være nyttige i mus embryonale neuroner. Hvis de ønskede neuroner eller Neuro kugler ikke opnås efter denne teknik, er der et par fejlfindingstips, der kan være nyttige. For at holde vævene levedygtige, skal dissektion udføres i iskold HBSS. Dissektion kan også udføres i iskold Krebs buffer i stedet for hbss buffer. Hurtigt at udføre dissektion er nøglen til at opretholde vævs levedygtighed. Brug af 10x trypsin vil føre til over fordøjelse af vævet. Derfor skal 10x trypsin-EDTA-opløsningen fortyndes til 1x i dissociations buffer før fordøjelsen. Tilsætning af iskold medium til cellerne, inducerende fryse-chok, bør undgås for enhver pris, og medium efter at nå RT bør anvendes i stedet. Vigtigst af alt, bør dæksedlerne altid være belagt med PDL, ellers vil neuronerne ikke vedhæfte til dæksedlerne. I tilfælde af problemer, mens du udfører formalings trin (dvs. væv ikke fordøje korrekt), fordøjelsen kan udføres ved at tilføje 0,5 ml af 1% DNase i 10 min. Hvis der opstår høje grader af kontaminering med ikke-neuronale celler, skal der tilsættes ~ 5 μM cytosin arabinosid (araC) for at forhindre vækst af ikke-neuronale celler.
På trods af sine mange fordele, denne teknik lider af et par begrænsninger. Det er kendt, at denne teknik spontant genererer Neuro kugler (selv om de udløsende molekylære mekanismer ikke er kendt); Men, få tvetydigheder med hensyn til denne teknik forbliver, såsom den nøjagtige størrelse af Neuro kugler dannet og nøjagtige antal dage, der kræves for at danne et tilstrækkeligt antal Neuro kugler. For det meste er størrelsen problemet. Selv om det er blevet observeret, at Neuro kugler ekspandere i volumen over tid, de oprindelige Neuro kugler opnået er af varierende størrelser. Selvom nyttigt, det gør det vanskeligt at udføre en synkroniseret undersøgelse. Hvad adskiller denne Neuro Sphere generation protokol fra andre er dens robusthed og enkelhed. Der er tidligere rapporterede protokoller for dyrkning og formering af neuropheres kræver særlige medium krav og kultur betingelser, hvoraf ingen er påkrævet i denne protokol. I disse tidligere rapporterede protokoller, der er næppe nogen ensartethed for dem, som ønsker at generere Neuro kugler.
Samlet, denne protokol beskriver en unik strategi for generering af både 2D og 3D neuronal platforme ved blot at ændre celle plating tætheder af primære neuroner isoleret fra embryoner af E14-E16 Sprague Dawley rotter. Denne metode er omkostningseffektiv i forhold til andre metoder, da det kan udføres med en enkel opsætning og kræver langt mindre reagenser og trin. Det kan give forskellige anvendelser af interesse for neuroforskere. Dette kan bruges som screening platforme for forskellige Neuro-terapeutiske fører, observere rollerne af forskellige neuronal last proteiner, undersøgelser af cellulære veje i mange neurodegenerative sygdomme, og mange andre applikationer. Neuro kugler kan yderligere anvendes til screening af forskellige neurale differentierende agenter og studere de tidlige stadier af neurale udvikling in vitro25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker CSIR-IICB Animal facilitet. G. D. tak ICMR, J. K. og V. G. takke DST Inspire, og D. M. tak DBT, Indien for deres stipendier. S. G. anerkender serbiske (EMR/2015/002230) Indien for at yde økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
