Summary
Здесь представлен протокол для спонтанного поколения нейросфер, обогащенных в нервных клетках-прародителях из нейронов высокой плотности. Во время того же эксперимента, когда нейроны покрываются при более низкой плотности, протокол также приводит к длительным первичных культур нейронов крыс.
Abstract
Первичная культура нейронов является важным методом в области неврологии. Чтобы получить более глубокие механистические идеи в мозг, важно иметь надежную модель in vitro, которая может быть использована для различных исследований нейробиологии. Хотя первичные культуры нейронов (т.е. долгосрочные гиппокампа культур) предоставили ученым модели, он еще не представляет сложность сети мозга полностью. В результате этих ограничений, новая модель возникла с использованием нейросфер, которые имеют более близкое сходство с тканью мозга. Настоящий протокол описывает покрытие высокой и низкой плотности смешанных корковых и гиппокампальных нейронов, изолированных от эмбриона эмбрионального дня 14-16 Sprague Dawley крыс. Это позволяет для генерации нейросфер и долгосрочной первичной культуры нейронов в качестве двух независимых платформ для проведения дальнейших исследований. Этот процесс чрезвычайно прост и рентабельен, так как сводит к минимуму несколько шагов и реагентов, которые ранее считались необходимыми для культуры нейронов. Это надежный протокол с минимальными требованиями, которые могут быть выполнены с достижимыми результатами и далее использоваться для разнообразия исследований, связанных с неврологией.
Introduction
Мозг представляет собой сложную схему нейрональных и ненейрональных клеток. В течение многих лет ученые пытались получить представление об этом сложном механизме. Для этого нейробиологи первоначально прибегали к различным преобразованиям нервных клеточных линий для исследований. Тем не менее, неспособность этих клональных клеточных линий, чтобы сформировать сильные синаптические связи и надлежащие аксоны или дендриты сместили научный интерес к первичным культурам нейронов1,2. Наиболее захватывающим аспектом первичной культуры нейронов является то, что она создает возможность наблюдать и манипулировать живыми нейронами3. Кроме того, он менее сложен по сравнению с нервной тканью, что делает его идеальным кандидатом для изучения функции и транспортировки различных нейрональных белков. В последнее время несколько разработок в области микроскопии, геномики и протеомики создали новые возможности для нейробиологов, чтобы использовать нейронных культур4.
Первичные культуры позволили нейробиологам исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе нейронного развития, анализировать различные нервные сигнальные пути и развивать более последовательное понимание синапсиса. Хотя ряд методов сообщили культур из первичных нейронов (в основном из гиппокампа происхождения5,6,7), единый протокол с химически определенной среде, которая позволяет долгосрочной культуры нейронов по-прежнему необходимо. Тем не менее, нейроны покрытием при низкой плотности чаще всего наблюдаются, которые не выживают в долгосрочной перспективе, вероятно, из-за отсутствия трофической поддержки 8, которая обеспечивается соседних нейронов и глиальных клеток. Некоторые методы даже предложили совместного культивирования первичных нейронов с глиальными клетками,в которых глиальные клетки используются в качестве фидерного слоя 9. Тем не менее, глиальные клетки создают много проблем из-за их разрастания, которые иногда переопределить роста нейронов10. Таким образом, учитывая проблемы выше, более простой и экономичный протокол первичной нейронной культуры не требуется, который может быть использован как нейробиологов и нейрохимиков для исследований.
Первичная культура нейронов по существу является формой 2D-культуры и не представляет пластичность, пространственную целостность или неоднородность мозга. Это привело к необходимости более правдоподобной 3D-модели под названием нейросферы11,12. Нейросферы представляют новую платформу для нейробиологов, с более близким сходством с реальным, in vivo мозга13. Нейросферы являются неадекторными 3D-кластерами клеток, богатых нервными стволовыми клетками (НСК), нервными клетками-прародителями (НпК), нейронами и астроцитами. Они являются отличным источником для изоляции нервных стволовых клеток и нервных клеток-прародителей, которые могут быть использованы для изучения дифференциации в различные нейронные и ненейронные линии. Опять же, изменчивость в нейросферных культурах, производимых с использованием ранее сообщенных протоколов, представляет собой барьер для разработки единого протокола культуры нейросферы14.
Данная рукопись представляет собой протокол, в котором можно генерировать как 2D, так и 3D платформы путем чередования плотности клеточного покрытия от смешанной корковой и гиппокампальной культуры. Отмечается, что в течение 7 дней свободно плавающие нейросферы получаются из высокой плотности покрытых нейронов, изолированных от E14-E16 Sprague Dawley крысы эмбриона, которые на дальнейшее культуры, образуют мосты и взаимосвязи через радиальные глиально-подобные расширения. Аналогичным образом, в низкой плотности покрывало нейронов, первичной культуры нейронов, которые могут быть сохранены до 30 дней, получается путем изменения среднего обслуживания два раза в неделю.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных CSIR-Indian Institute of Chemical Biology (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).
1. Подготовка реагентов и средств массовой информации
- Поли-D-лизина (PDL) раствор: подготовить PDL растворы в концентрации 0,1 мг/мл в деионизированной воде и хранить в 4 градусов по Цельсию до использования.
- Среда диссоциации: до 1 л стерильной, фильтрованной деионизированной воды, сочетайте следующие компоненты в соответствующих концентрациях: хлорид натрия (8 мг/мл), хлорид калия (0,4 мг/мл), монобасичный калий фосфат (0,06 мг/мл), D-глюкоза-глюкоза (1 мг/мл), фосфат натрия дибасический (0,479 мг/мл) и 1 M HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанетанесульфоновая кислота; 10 м/м/ 10 м/м. Vortex все компоненты, чтобы помочь надлежащего смешивания и хранить в 4 кК до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду диссоциации в ледяной форме во время диссоциации, но при комнатной температуре (RT) для стирки и других целей. - Среда покрытия: среда покрытия состоит из следующих: минимальная необходимая среда (MEM) Eagle's с сбалансированным соляным раствором Earle (BSS; 88,4%), D-глюкозой (0,6%), сывороткой лошади (10%) и пенициллином/стрептомицином (1%). Объедините компоненты в соответствующих соотношениях и выполняйте процедуру внутри капота в стерильных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный средство покрытия, чтобы избежать деградации любого компонента. - Средняя среда обслуживания: подготовить среду обслуживания, объединив следующие в соответствующих соотношениях: нейробазальная среда (97%), 0,5 мМ коммерчески полученный пробы глутамина, безсыворотка B27 добавка (2%), и пенициллин/стрептомицин (1%). Объедините компоненты в соответствующих соотношениях и выполняйте процедуру внутри капота в стерильных условиях. Убедитесь, что все компоненты недавно подготовлены.
2. Подготовка обложек
- Возьмите 12 мм диаметром круглый стеклянный покрывало и замочите его в 1 M соляной кислоты (HCl) в течение 4 ч.
- Передача coverslips в дистиллированной воде с помощью пары щипц и закружить его осторожно, чтобы избавиться от кислоты полностью.
- Перенесите промытые крышки для дополнительного раунда очистки в стакане, содержащем 100% этанол.
- Перед использованием крышки, высушить их хорошо в ламинар ный капот, держа их на бумаге.
3. Подготовка поли-D-лизин покрытием пластин для культуры нейронов
- Возьмите две 24 пластины хорошо: один для высокой плотности покрытия, а другой для низкой плотности покрытия. Откройте стерильные пакеты только внутри ламинарного капюшона.
- Перенесите 12 мм стерильных стеклянных крышкв в 24 колодца.
- Налейте 300 л раствора PDL (0,1 мг/мл в деионизированной воде) в каждую скважину, чтобы она полностью покрывала поверхность крышки.
- Оберните пластины с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить сушки и держать его в ИНкубаторCO2 на ночь.
- На следующий день (перед покрытием) аспирировать раствор PDL и правильно промыть 300 л стерильной деионированной воды два-три раза.
- Добавьте 200 л свежеприготовленного покрытия среды и верните пластины в инкубатор до покрытия.
4. Удаление и обезглавливание плода
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все хирургические инструменты упакованы в алюминиевую фольгу в автоклаве на 121 кв (15 psi) в течение 30 мин. Это включает в себя пару тупых ножниц, щипцы, тонкие щипцы, два тонких ножницы, и одна артерия щипцы для всей процедуры.
- Для генерации нейронов и нейросфер, используйте приурочен беременных Sprague Dawley крысы и отметить день с вагинальным обнаружением плагина, как E0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура должна быть выполнена между E14-E16. - В день культуры поместите стерильный стеклянный петри плиту на лед и заполните ее холодным сбалансированным соляным раствором Хэнка (HBSS).
- Анестезия E14-E16 беременной крысы с интраперитонеальной (т.п.) инъекции 90 мг кетамина / кг массы тела и 10 мг ксилазин / кг, а затем жертвовать, выполняя вывих шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы также могут быть усыплены передозировкой пентобарбитала или передозировки кетамина с ксилазином или диазепамом. - Стерилизовать брюшной полости плотины путем распыления 70% этанола и сделать V-образный разрез в брюшной области с помощью стерильных щипцы и пары тупых ножниц.
- Тщательно возьмите эмбриональные мешки на пластину Петри с холодным раствором HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте те же щипцы и ножницы, которые только что были использованы для кожи, так как это будет загрязнять внутренние органы. Используйте другой набор ножниц / щипцы для внутренних органов. - Возьмите эмбрионы из эмбриональных мешков в свежем, холодном HBSS.
- Обезглавить голову стерильными ножницами.
5. Удаление головного мозга и вскрытие коры головного мозга гиппокампом
- Перед началом заполните 90 мм стерильных блюд Петри холодным, стерильным HBSS.
- Перенесите головки в стерильные посуды с помощью стерильных, тупых перевязочных щипц.
- Под стереомикроскопом удерживайте голову от области мснаряда стерильными, зубчатыми щипками и удаляйте мозг, разрезая кожу и череп.
- Соберите все эмбриональные мозги одинаково в растворе HBSS.
- Удалите все олени из полушарий и среднего мозга, удерживая ствол мозга.
- Тщательно удалите нетронутые полушария, напоминающие грибные шапки, которые содержат гиппокамп и кору головного мозга.
- Соберите полушария, содержащие кору и нетронутый гиппокамп в конической трубке 15 мл, содержащей 10 мл диссоциационистской среды.
6. Диссоциация корковой и гиппокампальной ткани на одиночные нейроны
- Разрешить собранные ткани, чтобы успокоиться и аспирировать диссоциации среды, оставляя 5%-10% среды в нем.
- Добавьте 10 мл свежей среды диссоциации к ткани и повторите шаг 6.1 дважды.
- Добавьте 4,5 мл раствора диссоциации и 0,5 мл 0,25% (1x) трипсина EDTA (этилен диамин тетраацетат) раствор.
- Держите ткани в инкубаторе при 37 градусах По Цельсию в течение 20 минут для пищеварения, чтобы продолжить.
- Усиливайте среду и добавляйте 10 мл диссоциации и покрытие среднего последовательно к переваренных тканей.
- Разрешить переваренных тканей, чтобы успокоиться и аспирировать диссоциации среды. Добавьте 2,5 мл покрытия среднего и вылейте в основание стерильной тарелки 90 мм.
- Triturate переваренных тканей в угловой базе блюда с помощью 1000 л пипетки отзыв, чтобы занять минимальный объем.
- Пройдите полученную суспензию клеток через 70 мкм-ситечко, исключая любые куски ткани.
- Определите плотность жизнеспособных клеток с помощью метода исключения трипан синего красителя и подсчитайте количество клеток в автоматизированном клеточном счетчике.
- Для trypan синий метод исключения красителя, принять 10 зл и 10 зл и 10 зл 0,4% trypan голубое пятно, тщательно перемешать, и добавить 10 зл/ смеси в одном из двух закрытых камер одноразовых слайдов камеры.
- Вставьте слайд, содержащий смесь в счетчик ячейки и получить показания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод исключения трипан синий краситель основан на принципе, что живые клетки (из-за их нетронутыми мембраны) исключит трипан синий краситель и, следовательно, показать четкую цитоплазму, по сравнению с нежизнеспособной клетки, которые легко занимают trypan синий и появляются синий в цвет15.
- Разбавить количество клеток, полученных в пластине 1,5 х 105 клеток/мл для высокой плотности и 20000 клеток/мл для низкой плотности в двух отдельных трубах, содержащих 30 мл каждая из среды покрытия.
- Аспирированный ранее добавленный средство покрытия от каждого колодца и пластины 500 зл и клеток, рассеянных в среде покрытия в каждой скважине.
- После этого вернуть пластины в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2 на 4 ч.
- Изучите клетки на соответствие под микроскопом 4 ч после покрытия.
- При правильном присоединении клеток в обеих пластинах замените среду в каждой скважине 500 л свежей среды обслуживания и инкубация при 37 градусах Цельсия.
- Культура этих нейронов выросли при низкой плотности в течение 30 дней, изменив обслуживание среднего 2x в неделю.
- Культура нейросфер, полученных из высокой плотности покрывало нейронов в той же среде обслуживания путем передачи их на ультра-низкие пластины крепления.
- Характеризуй нейроны и нейросферы, иммуноспотихих их с важными маркерами. Для иммуноцитохимии сначала зафиксировать клетки/нейросферы, используя 4% формальдегида в течение 30 мин на самой пластине, затем пронизать клетки с помощью 0,1% неионных моющих средств в течение 10 мин.
- Добавить первичные антитела для обоих нейронов (анти-Tuj1, GFAP, O4, тау) и нейросфер (анти-Нестин, GFAP, Tuj1) в фосфат-буферных солей (PBS) в 1:300 концентрации и инкубировать ночь на 4 C16.
ПРИМЕЧАНИЕ: Tuj1 (класс III -тубулин) и тау являются положительными маркерами для первичных нейронов, в то время как GFAP (глиальный фибриллокислый кислый белок) и O4 (маркер олигодендроцита) являются отрицательными маркерами для первичных нейронов17,18. В случае нейросфер, Tuj1, GFAP, и Nestin все служат в качестве положительных маркеров19,20. - На следующий день, мыть клетки с PBS один или два раза и добавить соответствующие вторичные антитела в PBS на 1:600 концентрации на RT для 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-мышь или анти-Кролик вторичные антитела выбираются в зависимости от вида хозяина первичного антитела добавил. Следует иметь в виду, что вторичные антитела должны быть спряжены к производным флуоресценции, пригодным для флуоресценции микроскопических целей. - Вымойте клетки снова с PBS один или два раза.
- Выполните ядерное окрашивание клеток с помощью Hoechst 33258 (1 мг/мл бульонного раствора в деионизированной воде). Приготовьте 0,1% раствор Hoechst в PBS из биржевого раствора и добавьте его в клетки.
- Инкубировать клетки с 0,1% Hoechst раствор в течение 30 минут, затем снова мыть с PBS.
- Добавьте 20 Л ПБС (или монтажной среды) на слайде и медленно смонтируйте крышку, содержащую окрашенные клетки, над областью слайда, содержащей PBS. Печать края крышки с дибутилфталат полистирол ксилена (DPX).
- Выполните визуализацию фиксированных клеток под микроскопом при 10x и 40x увеличении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе была выяснена простая стратегия, в которой получается плотность с переменным покрытием клеток с двух различных платформ скрининга нейронов. Рисунок 1A,B иллюстрирует соблюдение клеток после 4 ч покрытия нейронов в высокой и низкой плотности покрыванных клеток, соответственно. При соблюдении надлежащего соблюдения нейронов, как показано на рисунке 1, покрытие среды был заменен на обслуживание среды в каждой из скважин и, таким образом, вернулся в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию. Сравнительно больше пристыковки клеток наблюдалось в высокой плотности покрывало нейронов. После 24 ч покрытия, как высокая и низкая плотность покрывало нейронов показали сложные нейронные расширения и синаптические взаимосвязи, как это наблюдается в дифференциальной интерференции контраст (DIC) изображения на рисунке 2A,B.
На рисунке 3Aпредставлено фазово-контрастное изображение низкой плотности покрынных нейронов после 7 дней в культуре. Здесь нейроны разработали сложную синаптическую сеть, состоящую из дендритных ветвей. Эти нейроны могут быть дополнительно сохранены на срок до 30 дней, изменяя среду обслуживания каждые 3 дня с развитием более сложных нейронных сетей. На рисунке 3B,C, иммуноцитохимическое окрашивание было выполнено, чтобы выявить нейронную природу нейронов культуры низкой плотности путем окрашивания с нейронными маркерами Tuj1 (маркер дифференцированных нейронов)21 и Тау (маркер аксонов)22 , соответственно. Красный цвет на рисунке 3B указывает на наличие окрашивания Tuj1, а зеленый цвет на рисунке 3C представляет собой окрашивание аксонов первичных нейронов. Чистота нейронной культуры проявляется отсутствием окрашивания ненейрональных маркеров для GFAP астроцитов(рисунок 3D)и O4 олигодендроцитов (рисунок3E). Ядра, показанные синим цветом, были окрашены Hoechst 33258.
Высокая плотность покрывало нейроны после 7 дней отмечены образованием спонтанныхнейросфер, как это наблюдается на рисунке 4A,B,C,D. После 8-10 дней, различные мосты, состоящие из радиальных глиальных, как расширения наблюдались между нейросферами, как видно на рисунке 4E. Нейросферы были богато наделены NPC, которые coexpress маркеры Нестин и Tuj123. Нейроспехеры показывают положительное окрашивание Нестина и Туя, как показано на рисунке 524. Ядра, показанные синим цветом, были окрашены Хёхттом 33258. Эти нейросферы могут поддерживаться в течение нескольких недель путем культивирования их в ультра-низких пластин крепления. На рисунке 6, долговечность нейронов культивируется около 30 дней была оценена, и жизнеспособность клеток была измерена с интервалом в 5 дней с помощью обычного МТТ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтатразола бромид, в котором он был обнаружили, что нейроны показали более 90% жизнеспособности даже после 30 дней культуры.
Затем была оценена процентная доля астроцитов в культурах с высокой и низкой плотностью семян. Поскольку эта методология направлена в первую очередь на культивирование нейронов, важно было оценить, поддерживает ли этот метод преференциальный рост нейронов по сравнению с ненейрональными клетками, особенно астроцитами. Присутствие популяции астроцитов наблюдалось в нейросферно-формирующейся культуре высокой плотности семян, отмеченной зеленым цветом окрашивания GFAP на рисунке 7A; однако, значительно меньше наблюдалось по сравнению с Tuj1 (красный) окрашенных нейронов населения. Это также было подтверждено количественными данными на рисунке 7B, в которых 17% популяций клеток были GFAP-выражения, по сравнению с 83% населения в Tuj1 выражая клетки.
Астроцитарная популяция была также исследована с помощью Окрабирования GFAP, по сравнению с нейронной популяцией (Tuj1 окрашивая) в сеяных клетках низкой плотности, в течение 7 непрерывных дней. Хотя существенная разница в общем количестве клеток не наблюдалась в течение 7 дней, из-за низкого посева, популяция астроцитов также наблюдалась очень низкой (почти нет или очень низкое окрашивание GFAP), при этом большинство из них нейронная популяция (очень высокое выражение Tuj1), как это наблюдается на рисунке 8A.
Как показано на рисунке 8B, количественный анализ был выполнен путем подсчета популяции астроцитов и нейронов, полученных с помощью микроскопии с помощью программного обеспечения cellSens, в котором только 2%-3% населения астроцитов первоначально наблюдалось. Из-за отсутствия подходящих средств массовой информации и питательных веществ для поддержки своего роста, эта популяция астроцитов также медленно погибала с течением времени, в то время как в присутствии оптимальных факторов и средств массовой информации, нейроны быстро захватили всю культуру.
Как показано на рисунке 9, было отмечено, что из-за присутствия NPCs, нейросферы также выразили большое количество астроцитов, отмеченных сильным зеленым сигналом GFAP окрашивая вместе с более сильным сигналом Tuj1. Наконец, чтобы наблюдать, являются ли эти нейросферы расширены с течением времени, после 1 недели культуры высокой плотности, в этот момент небольшие нейросферы начали формироваться, несколько были переданы в ультра-низких пластин крепления и их рост был мониторинг каждые 5 дней в течение до 15 дней.
Проверка живой/мертвой клетки была также проведена с использованием кальцийна AM (зеленый) и пропидий йодида (красный) для проверки здоровья клеток. Было отмечено, что расширение нейросфер ы показали большое количество зеленой флуоресценции без красного окрашивания, что свидетельствует об отсутствии смерти, происходящих в нейросферах, по крайней мере до 15 дней в культуре, как показано на рисунке 10A. Как показано на рисунке 10B,объемное расширение нейросфер наблюдалось каждые 5 дней в культуре до 15 дней. Для графика графика, представляющего возможное увеличение объема нейросфер (для каждой временной точки), было изучено 50 нейросфер, и их средние значения использовались для получения объемов нейросферы в каждую точку времени.
Рисунок 1 : Представление присоединения клеток после 4 ч покрытия. (A) Приверженность клеток в высокой плотности покрывало нейронов. (B) Приверженность клетки в низкой плотности покрывало нейронов. Шкала бар в (A,B) составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Клеточная морфология нейронов после 24 ч покрытия. (A) Клеточная морфология высокой плотности покрывало нейронов. (B) Клеточная морфология низкой плотности покрывало нейронов. Шкала баров в (A, B) представляют 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Морфология и характеристика низкой плотности покрывало нейронов после 7 дней. (A) Фазово-контрастное изображение нейронов, показывающих обширный прорастания. Шкала бар представляет 200 мкм. Наложение изображения, показывающие выражение для нейронных белков (B) Tuj1 (красный) и (C) тау (зеленый). Иммнуноцитохимия, четко показывающая отсутствие окрашиванияв ненейрональные белки (D ) GFAP (зеленый) и (E) O4 (красный). Ядра были запятнаны Hoechst 33258 (синий). Шкала баров в (B, C, D, E) представляют 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Формирование нейросфер в высокой плотности покрывало нейроны после 7 дней. (A-D) Спонтанно генерируемые нейросферы после 7 дней в культуре от высокой плотности покрывало нейронов. (E) Формирование радиальных глиальных расширений между двумя вновь образованными нейросферами, как указано черными стрелками. Шкала баров в (A, B, C, D, E) представляют 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Характеристика полученных нейросфер. Накладывая изображение нейросфер, показывающих экспрессию для нейронального белка Tuj1(красный)и нервный маркер стволовых клеток Nestin (зеленый), что указывает на богатую NPC популяцию. Ядра были окрашены Hoechst 33258 (синий). Панель шкалы составляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Клеточная жизнеспособность первичных нейронов. График бара представляет жизнеспособность клеток первичных нейронов, оцениваемых с помощью mtT-исследования на срок до 30 дней с интервалом в 5 дней. Панель ошибок представляет SD значения (p qlt; 0.05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7 : Характеристика нейросферообразующих культур высокой плотности с нейрональным маркером Tuj1 и астроцитным маркером GFAP. (A) Изображение показывает высокую плотность семенных клеток (в режиме DIC), который генерирует нейропсемы, выражающие как GFAP (для астроцитов) и Tuj1 (для нейронов). Ядра были запятнаны Hoechst 33258. Шкала бар представляет 20 мкм. (B) Бар график представляет процент населения Tuj1-выражения клеток и GFAP-выражения клеток в нейросфере генерации клеток высокой плотности. Панель ошибок представляет SD (Зп Злт; 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8 : Характеристика низкой плотности покрых клеток для первичной культуры нейронов с нейрональным маркером Tuj1 и астроцитным маркером GFAP непрерывно до 7 дней. (A) Изображение показывает низкую плотность посеянных клеток в четырех различных каналах (т.е., DIC, синий канал »указывает на ядерное окрашивание Hoechst 33258», зеленый канал «GFAP окрашивание» и красный канал «для окрашивания Tuj1» в течение 7 дней непрерывно. Шкала бар представляет 20 мкм. (B) Бар график представляет процентное соотношение популяций Tuj1-выражения клеток, что из GFAP-выражения клеток в низкой плотности семенных клеток для первичной культуры нейронов в течение 7 дней. Панель ошибок представляет SD (Зп Злт; 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9 : Иммуностоизирование полученных нейросфер с помощью GFAP и Tuj1. Изображения полученных нейросфер (A) в режиме DIC, (B) ядра окрашивания с помощью Hoechst 33258, (C) астроцит маркер GFAP (зеленый), и (D) нейрональный маркер Tuj1 (красный). Панель шкалы составляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10 : Рост и живой / мертвый вид клетки асссе нейросферы в течение 15 дней. (A) Изображение показывает рост нейросферы в течение 15 дней с 5-дневным интервалом в режиме DIC, а также его окрашивание с кальцином AM (зеленый указывает живые клетки) и PI (пропидий йодид с красным цветом указывает мертвых клеток). Шкала бар представляет 20 мкм. (B) График представляет увеличение размера нейросфер, выращенных в низкой приверженности пластин в течение 15 дней с интервалом в 5 дней. Панель ошибок представляет SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, что, изменяя плотность клеточного покрытия первичных нейронов, получаются две переменные нейронные платформы. Хотя это простой метод, каждый шаг должен быть тщательно выполнен для достижения желаемых результатов. Другие предыдущие методы либо сообщили долгосрочные первичные культуры нейронов или нейросферных культур. Большинство первичных протоколов культуры нейронов включали культивирование гиппокампа нейронов в течение 3-5 недель, но большинство из них не удалось, как нейроны умирают и увянут из-за потери связей. Еще одним преимуществом протокола является то, что нейроны могут быть культивированы без необходимости для любого глиального фидерного слоя, следовательно, поддержание чистоты нейронов.
Тем не менее, необходимо тщательно вынести несколько важных шагов для получения желаемых результатов. Во-первых, поддержание стерильных условий во всем абсолютно необходимо. Рекомендуется выполнять большинство шагов в ламинарном капюшоне, а также предварительно очистить все плиты, инструменты и хирургические инструменты с 70% алкоголя перед началом; в противном случае, есть более высокий шанс отказа из-за загрязнения бактериями и грибами. Далее важно изолировать эмбрионы E14-16; следовательно, вагинальный шаг обнаружения штепсельной вилки должны быть тщательно выполнены. По мере увеличения эмбрионального дня, тем выше вероятность заражения ненейрональными клетками. Полное удаление оленя из полушарий крайне важно для уменьшения вмешательства в культуру ненейрональных клеток. Как покрытие, так и среда обслуживания должны быть свежеприготовлены со всеми компонентами, так как каждый компонент играет важную роль. Еще одним фактором, который необходимо иметь в виду, что первичные нейроны, полученные должны быть сохранены путем изменения среднего обслуживания 2x в неделю, так что питательные вещества для размножающихся нейронов остается постоянным.
Хотя он еще не был предпринят, этот протокол с небольшими изменениями также может быть полезным в мыши эмбриональных нейронов. Если желаемые нейроны или нейросферы не получены после этой техники, Есть несколько советов по устранению неполадок, которые могут быть полезны. Чтобы сохранить ткани жизнеспособными, вскрытие должно быть выполнено в ледяной HBSS. Вскрытие также может быть выполнено в ледяном буфере Кребса вместо буфера HBSS. Быстрое вскрытие является ключом к поддержанию жизнеспособности тканей. Использование 10x трипсина приведет к перевариванию тканей. Таким образом, 10x трипсин-EDTA решение должно быть разбавлено до 1x в буфере диссоциации до пищеварения. Добавление ледяной среды к клеткам, вызывая замораживание шок, следует избегать любой ценой, и средний после достижения RT должны быть использованы вместо. Самое главное, крышки всегда должны быть покрыты PDL, в противном случае нейроны не будут прикрепляться к крышкам. При каких-либо трудностях при выполнении шага тритурации (т.е. ткани не перевариваются должным образом), пищеварение может быть выполнено путем добавления 0,5 мл 1% DNase в течение 10 мин. При высоком уровне загрязнения ненейрональными клетками, следует добавить цитозин арабинозоид ный и 5 мкм (арак) для предотвращения роста ненейрональных клеток.
Несмотря на свои многочисленные преимущества, этот метод страдает от нескольких ограничений. Известно, что этот метод спонтанно генерирует нейросферы (хотя, срабатывающиие молекулярные механизмы не известны); однако, несколько двусмысленностей относительно этого метода остают, как точно размер сформированных neurospheres и точное число дней необходимых для того чтобы сформировать достаточное количество neurospheres. Главным образом, размер является проблемой. Несмотря на то, что было отмечено, что нейросферы расширить в объеме с течением времени, первоначальные нейросферы, полученные имеют переменные размеры. Хотя это и полезно, это затрудняет выполнение синхронного исследования. Что отличает этот протокол генерации нейросферы от других, так это его надежность и простота. Ранее сообщалось о протоколах культивирования и распространения нейропредерожеств, требующих особых средних требований и условий культуры, ни один из которых не требуется в этом протоколе. В этих ранее сообщалось протоколов, вряд ли какой-либо единообразия для тех, кто хочет генерировать нейросферы.
В целом, этот протокол описывает уникальную стратегию для генерации 2D и 3D нейронных платформ, просто изменяя плотность клеточного покрытия первичных нейронов, изолированных от эмбрионов крыс E14-E16 Sprague Dawley. Этот метод является экономически эффективным по сравнению с другими методами, так как он может быть выполнен с простой настройкой и требует гораздо меньше реагентов и шагов. Он может обеспечить различные приложения, представляющие интерес для нейробиологов. Это может быть использовано в качестве скрининговых платформ для различных нейротерапевтических приводит, наблюдая за ролью различных нейрональных грузовых белков, исследования клеточных путей во многих нейродегенеративных заболеваний, и многие другие приложения. Нейросферы могут быть дополнительно использованы для скрининга различных нервных дифференциирующих агентов и изучения ранних стадий нервного развития в пробирке25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
Acknowledgments
Мы благодарим животноводческий объект CSIR-IICB. Г.Д. благодарит ICMR, J. K. и V. G. thank DST Inspire, и D. M. благодарит DBT, Индия за их стипендии. S. G. любезно признает SERB (EMR/2015/002230) Индия для оказания финансовой поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
References
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
- Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
- Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
- Kaech, S., Banker, G.
- Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797 (2016).
- Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703 (2014).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
- Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
- Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
- Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
- Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
- Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
- Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449 (2014).
- Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
- Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
- Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467 (2015).
- Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
- Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
