Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Tredimensionel Co-kultur sfærisk angiogenese assay system er designet til at efterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur sfæroider er dannet af to humane vaskulære celler prækursorer, ECFCs og MSCs, og indlejret i kollagen gel. Det nye system er effektivt til at evaluere angiogene modulatorer og giver mere relevant information til in vivo-studiet.

Abstract

Undersøgelser inden for angiogenese har været aggressivt voksende i de sidste par årtier med anerkendelsen af, at angiogenese er et kendetegn for mere end 50 forskellige patologiske tilstande, såsom reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme og tumor metastaser. Under angiogenese Drug udvikling, det er afgørende at bruge in vitro-analysesystemer med passende celletyper og ordentlige forhold til at afspejle den fysiologiske angiogenese proces. For at overvinde begrænsningerne af nuværende in vitro-angiogenese-analysesystemer, der primært anvender endotelceller, udviklede vi et 3-dimensionalt (3D) sfærisk spiring-analyse system. Co-Culture sfæroider blev produceret af to humane vaskulære celle prækursorer, endotel kolonidannende celler (ecfcs) og mesenchymal stamceller (MSCS) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs sfæroider blev indlejret i type I kollagen matrix for at efterligne det in vivo ekstracellulære miljø. En real-time celle optager blev udnyttet til løbende at observere progression af angiogen spiring fra sfæroider for 24 h. levende celle fluorescerende mærkning teknik blev også anvendt til at kanal lokaliseringen af hver celletype under spire dannelse. Angiogenisk potentiale blev kvantificeret ved at tælle antallet af spirer og måle den kumulative længde af spirer genereret fra de enkelte sfæroider. Fem tilfældigt udvalgte sfæroider blev analyseret pr. forsøgsgruppe. Sammenlignings eksperimenter viste, at ECFCs + MSCs sfæroider udviste større spire nummer og kumulativ spire længde sammenlignet med kun ECFCs-sfæroider. Bevacizumab, en FDA-godkendt angiogenesehæmmer, blev testet med det nyudviklede Co-Culture sfæroide-analyse system for at verificere dets potentiale til at screene anti-angiogeniske lægemidler. IC50 -værdien for ecfcs + MSCS-sfæroider sammenlignet med Sfæroider i ecfcs var tættere på den effektive plasmakoncentration af bevacizumab opnået fra xenograft tumor musemodel. Den nuværende undersøgelse tyder på, at 3D ecfcs + MSCS sfæroide angiogenese assay system er relevant for fysiologisk angiogenese, og kan forudsige en effektiv plasmakoncentration forud for dyreforsøg.

Introduction

Ca. 500.000.000 mennesker verden over forventes at drage fordel af angiogenesis-moduerende terapi for vaskulære misdannelser-associerede sygdomme som reumatoid arthritis, oculopati, hjerte-kar-sygdomme, og tumor metastaser1. Således er udviklingen af lægemidler, der kontrollerer angiogenese blevet et vigtigt forskningsområde i den farmaceutiske industri. I løbet af narkotika udviklingsprocessen, in vivo dyreforsøg er nødvendig for at undersøge virkningerne af Drug kandidater på fysiologiske funktioner og systemiske interaktioner mellem organer. Etiske og omkostningsspørgsmål har imidlertid øget bekymringerne vedrørende dyreforsøg2. Der er derfor behov for forbedrede in vitro-analysesystemer for at opnå mere nøjagtige og forudsigelige data, der fører til bedre beslutningstagning før dyreforsøg. Nuværende in vitro angiogenese assays normalt måle spredning, invasion, migration, eller rørformede struktur dannelse af endotelceller (ECs) seedet i to-dimensionelle (2D) kultur plader3. Disse 2D angiogenese assays er hurtige, enkle, kvantitative og omkostningseffektive, og har i væsentlig grad bidraget til opdagelsen af angiogenese-modulerende stoffer. Der er dog stadig flere spørgsmål, som skal forbedres.

Sådanne 2D in vitro-analysesystemer kan ikke afspejle komplekse flertrinshændelser af angiogenese, der forekommer under in vivo fysiologiske forhold, hvilket fører til unøjagtige resultater, der forårsager uoverensstemmelser mellem in vitro-analysedata og kliniske forsøgsresultater4. 2D-kulturforhold inducerer også ændring af cellulære fænotyper. For eksempel, efter spredning i 2D kultur plader, ECs har en svag cellulær fænotype som manifesteret ved reduceret ekspression af CD34 og flere signaler, der regulerer cellulære svar5,6. For at overvinde begrænsningerne i 2D-kulturbaserede angiogenese-analysesystemer er tre-dimensionelle (3D) sfæriske angiogeneseanalysessystemer blevet udviklet. Spiring efterfulgt af rørformede struktur dannelse fra sfæroider dannet af ECs afspejle in vivo neo-vascularization processer7,8. Således, 3D sfæroide angiogenese assay er blevet betragtet som en effektiv analyse system til screening potentielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.

De fleste 3D sfæroide angiogenese assays udnytter kun ECs, hovedsageligt humane navle formede vene endotelceller (huvecs) eller humane dermal microvaskulære endotelceller (hdmecs) til at fokusere på den cellulære respons af ECs under angiogenese. Men, blod kapillærer er sammensat af to celletyper: ECs og pericytes. Udarbejdelse af tovejsinteraktion mellem ECs og pericytes er afgørende for korrekt vaskulær integritet og funktion. Flere sygdomme, såsom arveligt slagtilfælde, diabetisk retinopati, og venøs misdannelse, er forbundet med ændret pericyte tæthed eller nedsat pericyte fastgørelse til endotelet9. Pericytes er også kendt som et centralt element i angiogen proces. Pericytes rekrutteres til at stabilisere nydannede fartøjs strukturer ved ECs. I denne henseende, mono-kultur sfæroide angiogenese assay ikke indarbejde pericytes7,10. Derfor kan Co-Culture sfæroider dannet af ECs og pericytes give en værdifuld tilgang til mere nøje efterligne fysiologisk angiogen hændelser.

Den foreliggende undersøgelse havde til formål at udvikle en 3D Co-kultur sfæriske angiogenese-assay med en kombination af humane endotel kolonidannende celler (ECFCs) og mesenchymal stamceller (MSCs) til mere nøje at afspejle in vivo angiogenese. Co-Culture sfæroide system som en in vitro-repræsentation af et normalt blodkar blev først etableret af korff et al. i 200111. De kombinerede HUVECs og humane navlestrengs glatte muskelceller (HUSMCs), og viste, at co-kultur af to modne vaskulære celler faldt spiring potentiale. Moden ECs (huvecs) er kendt for gradvist at miste deres evne til at formere sig og differentiere, hvilket negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Modne perivaskulære celler (HUSMCs) kan forårsage endotel celle inaktivering gennem ophævelse af den vaskulære endotelial vækstfaktor (VEGF) reaktionsevne11. Den væsentligste forskel mellem Korffs og vores co-Culture sfæroide-system er de anvendte celletyper. Vi anvendte to vaskulære prækursorer, ecfcs og MSCS, at etablere en ordentlig angiogenese assay system til at screene og undersøge Pro-eller-anti-angiogene agenter. ECFCs er forløberen for ECs. ECFCs har robust spredningskapacitet sammenlignet med modne ECs14, som gør det muligt at overvinde begrænsningen af ECS. Ecfcs bidrager til ny fartøjs dannelse i mange postnatale patofysiologiske tilstande15,16,17. MSCS er pluripotente stamceller, der har kapacitet til at differentiere sig til pericytes og dermed bidrage til angiogenese18,19.

I tidligere rapporter viste ecfcs og MSCS synergistiske virkninger på in vitro-rørdannelse20, in vivo neo-vascularization21,22og forbedret reperfusion af iskæmisk væv23,24. I denne undersøgelse blev ECFCs og MSCs anvendt til at danne Co-kultur sfæroider og indlejret i type I collagen gel for at afspejle et in vivo 3D miljø. Kollagen betragtes som en vigtig bestanddel af den ekstracellulære matrix (ECM) omkring ECs25. ECM spiller en afgørende rolle i reguleringen af celle adfærd26. Den analyse protokol, der foreslås her, kan nemt og hurtigt udføres inden for to dage ved hjælp af fælles laboratorieteknikker. For effektiv celle sporing under spiring proces, kan hver celletype fluorescently mærket og overvåges ved hjælp af en real-time celle optager. Det nyoprettede 3D Co-Culture sfæroide angiogenese-analyse system er designet til at øge følsomheden for at evaluere potentielle angiogene modulatorer og give forudsigelige oplysninger forud for in vivo-studiet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humane Ecfc'er blev isoleret fra humant perifert blod som beskrevet i en tidligere rapport27. Kort, det mononukleale celle lag blev adskilt fra hele blodet ved hjælp af Ficoll-Paque plus, og dyrkede i det rette medium, indtil Endothelial-lignende kolonier blev vist. Kolonier blev indsamlet og ECFCs blev isoleret ved hjælp af CD31-belagte magnetiske perler. MSCs blev isoleret fra den overtrædende mononukleare celle (MNC) fraktion af human voksen knoglemarv. Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse for Duksung Women's University (IRB-nr. 2017-002-01).

1. cellekultur

  1. Klargøring af ECFCs og MSCs medium og frakke Plader
    1. Forbered endotel cellevækst medium MV2 (ecgm-MV2, undtagen hydrocortison) suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS) og 1% glutamin-penicillin-streptomycin (GPS).
    2. Forbered mesenchymal stamcelle vækstmedium-2 (MSCGM-2) indeholdende 10% FBS og 1% GPS.
    3. For ECFC-kulturen, coat cellekultur pladerne med 1% gelatineopløsning. For at tilberede 1% gelatineopløsning opløses 1 g gelationpulver i 500 mL PBS med magnetomrører og steriliseres med autoklave. Plader kan være belagt med 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm, eller 15 mL/150 mm af 1% gelatineopløsning. Inkubér overtrukne plader i 15 minutter i en celle kulturinkubator (37 °C og 5% CO2). Derefter fjernes den resterende 1% gelatineopløsning ved aspiration og vaskes de coatede plader én gang med PBS.
  2. Voksende ECFCs og MSCs
    1. Frø 1 x 106 ecfcs på 1% gelatine-coated 150 mm plader, og vokse ved hjælp af ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) i en cellekultur inkubator (37 °c og 5% Co2) til 80-90% konfluency. Brug ECFCs på passage Numbers 7-10 for at opnå ensartede resultater.
    2. Frø 1 x 106 MSCS på ikke-belagte 150 mm plader, og vokse ved hjælp af mscgm-2 i en cellekultur inkubator (37 °c og 5% Co2) til 80-90% konfluency. Brug MSCs på passage Numbers 7-10 for at opnå ensartede resultater.

2. fremstilling af 1,2% w/v methylcellulose opløsning

  1. Mål 6 g methylcellulose i en 500 mL glas flaske og steriliseres i en autoklave.
  2. Heat ECGM-MV2 (uden FBS og GPS) ved 60 °C i 20 min, og tilsæt 250 mL opvarmet ECGM-MV2 til steriliseret methylcellulose pulver. For at opretholde sterile forhold, skal du udføre processen inde i strømnings hætten.
  3. Tilsæt en steriliseret magnetisk Stir-stang og bland opløsningen i 20 min på magnetomrører, indtil methylcellulose er grundigt fugtet og jævnt dispergeret uden klumper. Tilsæt 250 mL kold (4 °C) ECGM-MV2 (uden FB'ER og GPS) under steril tilstand og bland i yderligere 10 minutter på magnetomrører. Derefter, chill opløsningen i et køleskab (4 °C) natten over.
    Bemærk: Methylcellulose er en kulhydrat polymer, der opløses godt i kølige temperaturer på grund af hævelse og efterfølgende hydrering.
  4. Næste dag, alikvot opløsningen i et 50 mL rør og centrifugeres ved 5.000 x g i 3 timer ved 4 °c. Tag den klare, viskøse supernatanten opløsning, og opbevar den ved 4 °C indtil brug i op til 3-6 måneder.
    Bemærk: Sedimentet kan indeholde residualcellulose fiber, så tag forsigtigt supernatanten opløsningen, som efterlader mindst 5 mL volumen. Denne volumen kan justeres i henhold til eksperimentelle betingelser.

3. generering og integrering af ECFCs-only, MSCs-only, og ECFCs-MSCs Sfæroider

Dag 1

  1. Klargøring af ECFCs og MSCs-cellesuspension
    1. Vask 80-90% flydende ecfcs og MSCS ved tilsætning af fosfat bufferet saltvand (PBS) uden calcium og magnesium, og Aspirer.
    2. For at frigøre ECFCs og MSCs fra kultur pladen, Inkubér dem med 0,05% trypsin-EDTA i 3 min og 5 minutter i en celle kulturinkubator (henholdsvis 37 °C og 5% CO2) i en celle kulturinkubator.
    3. Inaktivér trypsin ved at tilføje DMEM medium indeholdende 10% FBS og 1% GPS. Pipette cellerne op og ned for at oprette en enkelt cellesuspension.
    4. Sediment cellerne ved at centrifuger ved 282 x g i 5 minutter ved rt.
    5. Fjern supernatanten, og gensuspender cellerne i det pågældende medium.
  2. Mærkning ECFCs og MSCs med fluorescerende farvestof
    Bemærk: Udfør celle membran mærkning af ECFCs med PKH67 (grøn) og MSCs med PKH26 (rødt) fluorescerende farvestof efter fabrikantens anvisninger med lidt ændringer som følger.
    1. Vask cellerne to gange med serumfrit medium for at fjerne FBS.
      Bemærk: Proteiner og lipiderne i FBS nedsætter den effektive farvestof koncentration til mærkning af celler ved binding.
    2. Tæl ECFCs og MSCs ved hjælp af et hemocytometer under mikroskopet, og Overfør 3 x 106 ecfcs og 2 x 106 MSCS til 2 ml mikro-rør.
      Bemærk: Disse er de optimale celle tætheder til mærkning celler med farvestoffer. Brug af et stort antal celler forårsager dårlig og heterogene farvning, mens brugen af for få celler giver dårlige celler opsving.
    3. Centrifuger rørene ved 100 x g i 5 minutter ved rt for at få en celle pellet. Forsigtigt aspirere supernatanten, der ikke forlader mere end 15-25 μL rest volumen.
    4. Re-suspendere ECFCs og MSCs i 250 μL fortyndingsmiddel C fra farvestof kit. Pipette forsigtigt cellesuspensionen for at sikre fuldstændig dispersion.
      Bemærk: Fortyndingsmiddel C er en fysiologisk salt, og kan reducere farvning effektivitet af farvestof ved at danne miceller. Lad derfor ikke cellerne stå i fortyndingsvæske C i lang tid, og rør ikke rørene.
    5. Farvningsopløsningen forberedes til ECFCs ved tilsætning af 5 μL PKH67 til 250 μL fortyndingsmiddel C (endelig koncentration på 20 μM) og for MSCs ved tilsætning af 3 μL PKH26 til 250 μL fortyndingsmiddel C (endelig koncentration på 12 μM).
      Bemærk: De endelige farvestof koncentrationer er forskellige fra fabrikantens anbefalinger. Høj koncentration ville føre til celle sammenklumpning og celletoksicitet. Lav koncentration ville ikke være tilstrækkelig til farvning.
    6. Tilsæt 250 μL ECFCs-cellesuspension til 250 μL PKH67-farveopløsning og 250 μL MSCs til 250 μL PKH26 farveopløsning. Bland straks cellerne med farvestoffer ved pipettering op og ned og Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. For bedre resultater, dække røret med aluminiumsfolie og sted på en shaker for at sikre tilstrækkelig blanding under farvning.
    7. Stop farvningsprocessen ved at tilsætte 0,5 mL FBS til den farvede cellesuspension, og Inkuber derefter i 1 min for at tillade, at FBS binder overskydende ubundet farvestof. Sediment de farvede celler ved at centrifuger ved 100 x g i 5 min.
      Bemærk: ECFCs og MSCs pellets er lyse gule og pink, henholdsvis efter farvning.
    8. Fjern forsigtigt supernatanten og vask cellerne to gange med komplet medium for at fjerne overskydende farvestof. Rørene centrifugeres ved 100 x g i 5 minutter, og pelleten gensuspenderes i 2 ml af hvert komplet medium.
  3. Generering af ecfc-, MSC-eller ecfc + MSC-sfæroider
    Bemærk: Anvend den hængende dråbe teknik til at generere sfæroider som beskrevet tidligere28. Trinene til fremstilling af sfæroider er angivet nedenfor.
    1. Tæl de farvede ECFCs og MSCs.
    2. Suspendere farvede ECFCs, MSCs eller ECFCs + MSCs i ECGM-MV2 indeholdende 20% methylcellulose opløsning og 5% FBS. Forbered ved en celletæthed på 4 x 104 celler/ml for ECFCs eller MSCS (25 μl cellesuspension indeholder 1.000 celler). For to cellesuspension af ECFCs og MSCs, Forbered ved en celletæthed på 2 x 104 celler/ml ecfcs og 0,4 x 104 celle/ml MSCS (25 ΜL indeholder 500 ecfcs og 100 MSCS).
      Bemærk: Mellem ECFCs og MSCs ikke overstige 5:1. Et større antal MSCs kan føre til overdreven migration og irregulær spire morfologi. Et mindre antal MSCs kan forårsage dårlig interaktion mellem cellerne, hvilket giver dårlig spiring.
    3. Forbered en hydrerings enhed ved at tilsætte 15 mL PBS i bunden af en 150 mm kultur plade.
    4. Cellesuspensionen overføres til det steriliserede polystyren rektangulære reservoir til brug af multikanalpipette. Disperse cellerne suspension jævnt ved pipettering.
    5. Der indlades 25 μL dråber cellesuspension på forsiden af en 150 mm kultur plade ved hjælp af en pipette med flere kanaler (ca. 100 dråber/dæksel på 150 mm pladen). Vend dækslet over en PBS-fyldt hydrerings enhed, og Inkuber i en celle kulturinkubator i 24 timer.
      Bemærk: Methylcellulose opløsning giver en korrekt viskositet til affjedrings opløsningen. Når den hængende dråbe metode blev udført uden methylcellulose opløsning, dråber blev let gled ned, når dækslet blev inverteret (supplerende figur 1). Desuden blev sfæroider efter natten inkubation ikke perfekt dannet uden methylcellulose opløsning. Dette resultat indikerer, at korrekt viskositet ved methylcellulose opløsning er nødvendig for at danne rund form af sfæroider.

Dag 2

  1. Indlejring af sfæroider i neutraliseret kollagen gel
    1. Varm FBS og ECGM-MV2 (uden FBS og GPS) i et vandbad (37 °C). Placer kold methylcellulose opløsning på en arbejdsbænk for at bringe stuetemperatur.
    2. Placer en 24-brønd plade i en cellekultur inkubator (37 °C) til opvarmning.
    3. Skær de spidde spids 1 mL pipettespidser 3-5 mm for at aspirere sfæroider og viskøse suspensioner, såsom methylcellulose opløsning og type I kollagen, komfortabelt og præcist.
    4. Forbered 3 mg/mL neutraliseret type I collagen gel på is efter type I collagen gel producentens instruktion.
      Bemærk: Neutralisering skal udføres på is for at undgå gelering af kollagen ved stuetemperatur. For en brønd af en 24-brønd plade, 500 μL neutraliseret kollagen er nødvendig. Forbered altid 1 mL ekstra mængde kollagen. Kollagen gel kan bruges op til 2-3 h efter neutralisering, hvis det holdes på is.
    5. Sfæroider høstes ved at skylle dækslet indeholdende sfæroider med 5 mL PBS. Saml spheroid-suspenderet opløsning i et 50 mL konisk rør. Genskyl dækslet med 5 mL PBS for at få de resterende sfæroider.
      Bemærk: Under høsten, nøje observere for at bekræfte eksistensen af sfæroider. For mere visuel inspektion, overføre omkring 50-100 μL spheroid-suspenderet opløsning på glaspladen, og kontrollere den runde form af sfæroider under mikroskopet.
    6. Sedimentering af sfæroider ved centrifugering ved 282 x g i 5 min. kassér supernatanten forsigtigt uden at forstyrre de sfæroider, som ikke efterlod mere end 100-200 μl rest volumen.
    7. Tryk forsigtigt på rørets væg, så sfæroider er frit suspenderet i den resterende 100-200 μL rest opløsning.
    8. Tilsæt ECGM-MV2 indeholdende 5% FBS og 40% methylcellulose opløsning til det spheroid-holdige rør. Den tilføjede mængde bestemmes ud fra ca. 100 sfæroider/mL. Bland forsigtigt sfæroide-suspensionen ved pipettering med en stump 1 ml pipettespids.
      Bemærk: Methylcellulose opløsning er almindeligt anvendt som en suspension agent, der ikke tillader sfæroider til sediment. FBS-koncentrationen bør være 5%. Højere FBS-koncentration forårsager unormal spiring på grund af overdreven vækstfaktorer. Lavere FBS-koncentration kan ikke opretholde sunde forhold for celler.
    9. Bland spheroid-affjedrings opløsning og neutraliseret-type I collagen gel (3 mg/mL) ved et 1:1-forhold på is. Brug en stump 1 mL pipettespids for at undgå at bryde sfæroider.
      Bemærk: 1 ml af de sfæroider-suspension collagen gel opløsning er nødvendig for en brønd af en 24-brønd plade. Foretag en ekstra blandet affjedrings løsning, hvis det er muligt.
    10. Hvis det er nødvendigt at under prøve de angiogene egenskaber hos en eller flere agenter eller kemikalier, skal du overføre 1 mL af den spheroid-suspenderende collagen gel-opløsning i et 1 mL mikro-rør og tilføje middel (e) eller kemisk (e) efterfulgt af blid blanding med en stump 1mL pipettespids.
      Bemærk: Volumen af agent og kemikalie kan summe til 200 mL, som fortynder type I kollagen gel koncentration fra 1,5 mg/mL til 1,25 mg/mL, men påvirker ikke type I kollagen gel polymerisering. Tilsæt samme volumen af køretøjet til kontrol sfæroider.
    11. Tilsæt den spheroid-suspenderende kollagen gel opløsning i brønde af en 24-brønd plade (0,9 mL/brønd) ved pipettering, og Inkuber derefter i 30 minutter i en celle kulturinkubator til polymerisering.
      Bemærk: Under den sfæoide indlejrings proces må du ikke forstyrre gelen ved at ryste pladen.
    12. Dække den spheroid-suspenderende kollagen gel ved at tilføje 100 μL ECGM-MV2 indeholdende 2,5% FBS med/uden VEGF. For ECFC-kun sfæroider stimulerer cellerne med eksogen tilsætning af VEGF (endelig koncentration på 50 ng/mL) for at danne rigtige spirer. ECFC + MSC sfæroider kræver ikke eksogen stimulation af nogen vækstfaktorer.
    13. Anbring pladen i en realtids celle optager, der er installeret i en celle kulturinkubator (37 °C og 5% CO2), og fokuser tilfældigt på 5-10 sfæroider (10x objektiv linse). Overvåg spiring dannelse af hver fluorescens-mærkede sfæroider hver 1 h for 24 timer uden forstyrrelse.

4. quantitate Sfæoidspiring

  1. Importer billedfilerne til ImageJ software for at kvantificere antallet af spirer og måle længden af hver spire. For Co-Culture sfæroider, etiketten ECFCs med grøn fluorescerende farvestof før du laver sfæroider. Derefter måles antallet og længden af spirer farvet med grøn fluorescens (supplerende figur 2). Fem tilfældigt udvalgte sfæroider blev kvantificeret pr. forsøgsgruppe.
    Bemærk: Spirer er sammen aflange strukturer dannet af flere ECFCs strækker sig ud af sfæroider. Spire længde måles som længden fra spirer oprindelse fra overfladen af sfæroider til spidsen af spirer.
  2. Udtryk værdierne som betyder ± SEM for mindst tre uafhængige eksperimenter. Bestem den statistisk signifikante forskel ved en-vejs ANOVA for flere sammenligninger eller elevens t-test for parrede sammenligninger.
    Bemærk: P ≤ 0,05 betragtes som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Der blev udført sammenlignings eksperimenter ved hjælp af sfæroider med monokultur (kun ECFCs) og co-Culture spheroider (ECFCs + MSCs) for at undersøge, om MSCs spiller en betydelig rolle i ECFCs-medieret angiogenesis. Spiring dannelse fra hver sfæroide blev overvåget for 24 h af en real-time celle optager, der kunne fange progression af angiogen spiring fra sfæroider. Angiogenisk potentiale blev kvantificeret ved at tælle antallet af spirer og måle den kumulative længde af spirer genereret fra individuelle sfæroider. Fem tilfældigt udvalgte sfæroider pr. eksperimentel gruppe blev analyseret. For ECFCs + MSCs sfæroider var antallet af spirer og den kumulative spire længde signifikant højere sammenlignet med ECFCs-kun sfæroider på alle tidspunkter (figur 1A-C). Spire antallet og længden af ECFCs + MSCs-sfæroider steg kontinuerligt i 12 timer, men antallet og længden af sfæroider i ECFCs steg i 6 timer og ændrede sig ikke på senere tidspunkter (figur 1B, C). Desuden var spirer dannet af ECFCs + MSCs sfæroider tykkere og mere holdbare end dem, der dannes af ECFCs-kun sfæroider med/uden VEGF-behandling (figur 1A, og supplerende video 1a, B, D). Kun MSCs-sfæroider udgjorde ikke spirer, men viste individuel migrering af MSC'er uden for sfæroider (figur 1A og supplerende video 1c). Disse resultater viser det betydelige bidrag af MSCS, pericyte prækursorer, til cellulær angiogenese af ecfcs. MSCs er kendt for at udskiller forskellige vækstfaktorer29 , der kan stimulere ECFCs til dannelse af spirer og rørformede strukturer.

ECFCs blev mærket med grønt fluorescerende farvestof, og MSCs blev mærket med rødt fluorescerende farvestof, før de kombinerede til at generere ECFCs + MSCs sfæroider. Sammen med real-time optagelse, denne levende celle fluorescens mærkning teknik kan spore cellulære bevægelser af ECFCs og MSCs under spire dannelse. Fluorescerende billeddannelse viste, at ECFCs-medierede spire strukturer var dækket med MSCs (figur 2 og supplerende video 2). Dette tyder på, at kombinerede MSCs fungere som perivaskulære celler under spire dannelse, som forbedrer spire stabilitet og holdbarhed ved den tætte sammenslutning mellem to vaskulære celler.

Det nyudviklede Co-Culture sfæroide-analyse system blev testet med bevacizumab, en FDA-godkendt angiogenesehæmmer, for at verificere dets potentiale til at screene anti-angiogene lægemidler. ECFCs + MSCs sfæroider, der er forbehandlet med bevacizumab, viste nedsat spire nummer og kumulativ spire længde på en dosisafhængig måde sammenlignet med Control ECFCs + MSCs sfæroider (figur 3a, B). I parallelle eksperimenter udviste ECFCs-only sfæroider, der var forbehandlet med bevacizumab efterfulgt af stimulation med VEGF (50 ng/mL), også nedsat VEGF-induceret spire nummer og kumulativ spire længde på en dosisafhængig måde (figur 3C, D) . Bemærk, at IC50 -værdierne for bevacizumab til inhibering af kumulativ spire længde i ecfcs + MSCS-sfæroider var 46 gange større end i sfæroider, der kun er i ecfcs (tabel 1). Dette medfører i høj grad, at der er behov for en højere koncentration for at hæmme den fysiologisk relevante vaskulære dannelse ved ECFCs og MSCs sammenlignet med den koncentration, der er nødvendig for kun at hæmme EF-medieret vaskulær dannelse.

Dernæst blev der udført en xenograft tumor musemodel med bevacizumab behandling for at afsløre, hvilket sfæroide-system der giver forudsigelige data korrelation med in vivo effektiv plasmakoncentration. Human-afledte glioblastoma U87MG-rød-FLuc cellelinje blev subkutant injiceres til immun-mangelfulde mus. Efter bekræftelse tumordannelse på 1 uge, mus blev tilfældigt opdelt i 3 grupper, der modtog forskellige behandlinger: kontrol (0 mg/kg), lav dosis (1 mg/kg), og høj dosis (30 mg/kg). Tumor vækst var signifikant hæmmet i den 30 mg/kg-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen (supplerende figur 3A). Den 1 mg/kg-behandlede gruppe viste en tendens til tumor fald, men der var ingen statistisk forskel sammenlignet med kontrolgruppen. Plasmakoncentrationen af mus ved 3 ugers behandling med bevacizumab var 568.0 ± 40.62 μg/mL ved 30 mg/kg og 38.1 ± 0,72 μg/mL ved 1 mg/kg (supplerende figur 3b). Især var plasmakoncentrationen af bevacizumab, der viste effektiv hæmning (568.0 ± 40.62 μg/mL ved 30 mg/kg i 3 ugers behandling), tæt opnået med ECFCs + MSCs sfæroider (1261.5 ± 214.49 μg/mL), men ikke kun ECFCs-sfæroider (27.0 ± 9.97 μg/mL). Derfor kan ecfcs + MSCS sfæroide angiogenese-analysesystemet betragtes som et egnet analyse system til forudsigelse af effektiv plasmakoncentration forud for dyreforsøg.

Figure 1
Figur 1: spire dannelse fra ECFCs-only, MSCS-only, og ecfcs + MSCS sfæroider. A) repræsentative billeder af spire dannelse fra ecfcs-only, MSCS-only og ecfcs + MSC sfæroider indlejret i type I collagen gel ved 0, 6, 12, 18 og 24 h (Scale bar = 100 μm). B) kvantitativ graf over spire antallet dannet af ecfcs-only og ecfcs + MSCS sfæroider (gennemsnit ± SEM, n = 3). C) kvantitativ graf over kumulativ spire længde dannet af ecfcs-only og ecfcs + MSCS sfæroider (gennemsnit ± SEM, n = 3). * indikerer signifikant forskel mellem ECFCs-only og ECFCs + MSCs sfæroider på samme tidspunkt (p ≤ 0,05). # indikerer signifikant forskel mellem grupperne angivet med en parentes (p ≤ 0,05). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere tidspunktet30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: lokalisering af ECFCs og MSCs i spire konstruktioner. Repræsentative billeder, der viser placeringer af to celletyper i spire strukturer efter 24 h. ecfcs og MSCS blev fluorescently mærket med henholdsvis PKH67 (grøn) og PKH26 (rød) og udførte 3D ecfcs + MSCS sfæroide angiogenese assay. Pilene viser, at MSCs blev dækket med ECFCs-medierede spire strukturer (Scale bar = 100 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: bevacizumabs hæmmende virkning på spire dannelse fra ecfcs + MSCs og kun ecfcs-sfæroider. ECFCs + MSCs og ECFCs-kun sfæroider blev behandlet med bevacizumab, og spire dannelse blev overvåget i 24 timer.B) kvantitativ graf af kumulativ spire længde fra ecfcs + MSCS sfæroider behandlet med bevacizumab (gennemsnit ± SEM, n = 3). C) kvantitativ graf over spire tallet fra VEGF-stimulerede ECFCs-kun sfæroider, som blev behandlet med bevacizumab (gennemsnit ± SEM, n = 3). D) kvantitativ graf over kumulativ spire længde fra VEGF-stimulerede ECFCs-kun sfæroider, som blev behandlet med bevacizumab (gennemsnit ± SEM, n = 3). * indikerer signifikant forskel fra kontrolgruppen (hvid bjælke) (p ≤ 0,05). # indikerer signifikant forskel fra VEGF-behandlet gruppe (sort bjælke) (p ≤ 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tid
h		 IC50 (μg/ml) af Avastin p-værdi
Ecfcs-kun sfæroide Ecfcs + MSCS sfæroide
6 94,62 ± 38,53 3058,21 ± 373,31 0,003
12 58,61 ± 17,80 2006 ± 484,73 0,015
18 83,38 ± 54,54 1509,51 ± 483,88 0,042
24 27,04 ± 9,97 1261,51 ± 214,49 0,0045

Tabel 1: IC50 værdier af bevacizumab for hæmning af kumulativ spire længde i enten ecfcs-only eller Ecfcs + MSCS sfæroider. FKS-kun sfæroider blev behandlet med bevacizumab efterfulgt af stimulation med VEGF (50 ng/mL), som er nødvendig for spire dannelse fra ECFCs-only sfæroider. ECFCs + MSCs sfæroider blev behandlet med bevacizumab uden VEGF-stimulation. Begge sfæroider indlejret i type I kollagen gel, og spire dannelse fra hver sfæoid blev observeret for 24 timer ved hjælp af en real-time celle optager. Data er repræsenteret som middelværdien ± SEM (n = 3).

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 2
Supplerende figur 2: Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 3
Supplerende figur 3: Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Video 1A
Supplerende video 1a: Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplemental Video 1B
Supplerende video 1B: Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplemental Video 1C
Supplerende video 1c: Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplemental Video 1D
Supplerende video 1d: Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplemental Video 2
Supplerende video 2: Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I nærværende undersøgelse indføres et forbedret in vitro-angiogeneseanalysesystem, der udnytter Co-kultursfæroider dannet af to humane vaskulære celle progenitorer, ecfcs og MSCS. co-Culture sfæroide-systemet kan efterligne in vivo vaskulær spire dannelse, opnås ved interaktion og inkorporering mellem endotelceller og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro-angiogenese-assays, der kun afspejler ECs-medieret angiogenese, er dette Co-Culture-analyse system mere repræsentativt for den multitrinskaskade af fysiologisk angiogenese, herunder cellulær interaktion, spiring, rørdannelse, og fartøjs modning. Dette nyetablerede analyse system ligner også det in vivo ekstracellulære mikromiljø ved at såning sfæroider i type i collagen gel. Vi foreslår, at 3D Co-Culture sfæroide angiogenese assay-systemet er pålideligt, kan gentages, let kvantificerbart og vigtigst fysiologisk relevant.

Mens der udføres Co-kultur sfæroideanalyse, er det vigtigt at indlejre sfæroider i gel med passende koncentration af neutraliseret type I kollagen og FBS. Den bedste endelige koncentration af neutraliseret type I kollagen er 1,5 mg/mL, og procentdelen af FBS er 2,5%. I de indledende eksperimenter resulterede højere koncentrationer af kollagen i stiv gel og hæmmede kvaliteten og mængden af spirer, som stammer fra sfæroider. Mindre koncentrationer af kollagen gav blød og skrøbelig gel, der ikke kunne opretholde integriteten af sfæroider. Tilsvarende medførte højere mængder af FBS plethoric spiring fra sfæroider på basal niveau uanset angiogen faktor stimulation. Lavere FBS-koncentration førte til dårlige celle forhold. For konsistente og reproducerbare resultater bør et korrekt antal sfæoid integreres (ca. 50 sfæroider/brønd). Mere end 50 sfæroider/brønd kan føre til nærhed af sfæroider inden for brønden, hvilket kan påvirke kvaliteten og mængden af spirer, der genereres, unormalt.

Det er afgørende at opretholde type i kollagen under afkølede forhold under neutralisering og blande trin med sfæroide suspension, fordi kollagen kan størkne ved stuetemperatur, hvilket resulterer i en uregelmæssig matrix. Mens du blander sfæroide suspension med kollagen opløsning, anbefales det at bruge 1 ml pipettespids med 3-5 mm skåret i enden for at gøre Wide Hole. Dette muliggør nem håndtering af den viskøse kollagenopløsning og beskytter sfæroider mod ruptur. Ophidselse af pladen efter indlejring spheroid-suspenderet kollagen løsning kan forstyrre integriteten af gelen og resultere i brud, der kan hæmme normal spire generation.

I co-Culture sfæroide-analyse med ecfcs og MSCS bør forholdet 5:1 bibeholdes. Brug af et større antal MSCS forårsager spredning omkring sfæroide på grund af migrationen fænotype af MSCS, som kan påvirke ideelle spire generation. Et mindre antal MSCs er utilstrækkeligt til at stimulere ECFCs spiring og dække spirerne korrekt. Desuden er det vigtigt at kontrollere celle betingelser under vækst. Hvis der observeres dårlig spiring, anbefales det at bruge en anden sund passager i cellerne. For bedre resultater, brug af ECFCs og MSCs ved passage mindre end 10 anbefales kraftigt.

Her præsenterer vi et forbedret 3D angiogenese analyse system ved hjælp af co-Culture sfæroider, der nøje fanger in vivo angiogenese. Sammenlignet med 2D enkelt celle analysesystemer, dette Co-Culture sfæroide assay system afspejler mere trofast cellulære svar mellem to vaskulære celletyper til dannelse af rørformede strukturer i fysiologisk forhold. Dette system er dog fortsat overforenklet i forhold til den komplekse flertrinsproces af in vivo angiogenesis. Vaskulær generation in vivo opstår normalt gennem multipel interaktion af forskellige andre celletyper, herunder epiteliale celler, fibroblaster, immunceller, og også rigelige ECM proteiner. Fremtidige anvendelser af dette nye system omfatter indførelse af andre celletyper og ECM at mere præcist afspejle den fysiologiske og/eller patologiske angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af et tilskud (17172MFDS215) fra ministeriet for fødevarer og narkotika sikkerhed, National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud, der finansieres af Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og det grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Tags

Udviklingsmæssige biologi angiogenese co-Culture spheroid endotel kolonidannende celler mesenchymal stamceller type I kollagen gel spiring bevacizumab
Tredimensionalt Angiogeneseanalysesystem ved hjælp af co-Culture Sfæroider dannet af Endotelkoloni dannende celler og mesenchymale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H.,… More

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. T. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter