Summary
Трехмерная система сфероидного ангиогенеза, трехмерная со-культура, предназначена для имитации физиологиического ангиогенеза. Сокультурные сфероиды образуются двумя прекурсорами сосудистых клеток человека, ECFCs и MSCs, и встроены в коллагенный гель. Новая система эффективна для оценки ангиогенных модуляторов и предоставляет более актуальную информацию для исследования in vivo.
Abstract
Исследования в области ангиогенеза были агрессивно растет в последние несколько десятилетий с признанием того, что ангиогенез является отличительной чертой более 50 различных патологических условий, таких как ревматоидный артрит, окулопатия, сердечно-сосудистые заболевания , и метастазопухоли опухоли. Во время развития препарата ангиогенез, очень важно использовать в пробирке системы анализа с соответствующими типами клеток и надлежащих условий, чтобы отразить процесс физиологии ангиогенеза. Чтобы преодолеть ограничения текущих систем анализа in vitro angiogenesis, использующих в основном эндотелиальные клетки, мы разработали трехмерную (3D) систему анализа сфероидного анализа. Сокультурные сфероиды были произведены двумя прекурсорами сосудистых клеток человека, эндотелиальными колониями, образующими клетки (ECFCs) и мезенхимальными стволовыми клетками (MSC) с соотношением 5 к 1. Сфероиды ECFCs-MSCs были встроены в коллагеновую матрицу типа I для имитации внеклеточной среды in vivo. В режиме реального времени клеточный рекордер был использован для непрерывного наблюдения прогрессирования ангиогенного прорастания из сфероидов в течение 24 ч. Техника флуоресцентной маркировки живых клеток была также применена к тракту локализации каждого типа клеток во время образования ростков. Ангиогенный потенциал был количественно путем подсчета количества ростков и измерения кумулятивной длины ростков, генерируемых отдельными сфероидами. В экспериментальной группе было проанализировано пять случайно отобранных сфероидов. Сравнительные эксперименты показали, что сфероиды ECFCs-MSCs показали большее количество ростков и кумулятивную длину ростка по сравнению с сфероидами только ECFCs. Bevacizumab, FDA утвержденных ингибитор ангиогенеза, был протестирован с недавно разработанной совместной культуры сфероидной системы проверки, чтобы проверить его потенциал для проверки анти-ангиогенных препаратов. Значение IC50 для сфероидов ECFCs-MSCs по сравнению с сфероидами только ECFCs было ближе к эффективной концентрации плазмы bevacizumab, полученной из модели опухолевой мыши ксенотрансплантата. Настоящее исследование показывает, что 3D ECFCs-MSCs сфероидной ангиогенез системы асссея имеет отношение к физиологический ангиогенез, и может предсказать эффективную концентрацию плазмы до экспериментов на животных.
Introduction
Приблизительно 500 миллионов человек во всем мире, как ожидается, выиграют от ангиогенеза модуляции терапии для сосудистых пороков развития связанных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, окулопатия, сердечно-сосудистые заболевания, и метастаз опухоли1. Таким образом, разработка препаратов, контролирующих ангиогенез, стала важной областью исследований в фармацевтической промышленности. В процессе разработки препарата, in vivo исследования животных необходимо изучить влияние кандидатов наркотиков на физиологические функции и системные взаимодействия между органами. Тем не менее, этические и вопросы стоимости увеличили озабоченность в отношении экспериментов на животных2. Поэтому для получения более точных и предсказуемых данных, ведущих к лучшему принятию решений перед экспериментами на животных, необходимы усовершенствованные системы анализа in vitro. Текущие анализы in vitro ангиогенеза обычно измеряют пролиферацию, вторжение, миграцию или трубчатую структуру формирования эндотелиальных клеток (ECs), посеянных в двухмерных (2D) культурных пластинах3. Эти 2D ангиогенез анализы быстрый, простой, количественный, и экономически эффективным, и в значительной степени способствовали открытию ангиогенеза модулирующих препаратов. Однако ряд вопросов еще предстоит усовершенствовать.
Такие 2D системы анализа in vitro не могут отражать сложные многоступенчатые события ангиогенеза, который происходит в физиологических условиях vivo, что приводит к неточным результатам, которые вызывают расхождения между данными in vitro assay и результатами клинических испытаний4. 2D условия культуры также вызывают изменение клеточных фенотипов. Например, после распространения в 2D-культурных пластинах, ECs имеют слабый клеточный фенотип, проявляющийся снижением экспрессии CD34 и несколькими сигналами, которые регулируют клеточные ответы5,6. Для преодоления ограничений 2D-культурных систем анализа ангиогенеза были разработаны трехмерные (3D) сфероидные системы анализа ангиогенеза. Прорастание с последующим формированием трубчатой структуры из сфероидов, образованных ЭК, отражает в виво неоваскуляризации процессов7,8. Таким образом, 3D сфероид ангиогенез анализ считается эффективной системой ассеев для скрининга потенциальных про- или анти-ангиогенез наркотиков.
Большинство 3D сфероидных ангиогенез анализы использовать только ECs, в основном человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) или человека дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток (HDMECs), чтобы сосредоточиться на клеточной реакции ЭК во время ангиогенеза. Однако капилляры крови состоят из двух типов клеток: ЭК и перицитов. Разработка двухнаправленного взаимодействия между ОР и перицитами имеет решающее значение для надлежащей целостности и функции сосудов. Некоторые заболевания, такие как наследственный инсульт, диабетическая ретинопатия и венозная мальформация, связаны с измененной плотностью перицитов или снижением перицита, прикрепленного к эндотелию9. Перициты также известны как ключевой элемент ангиогенного процесса. Перициты набираются для стабилизации вновь сформированных структур судна eCs. В связи с этим, моно-культура сфероид ангиогенез самосвидетельство не включает перициты7,10. Таким образом, сфероиды совместной культуры, образованные ЭК и перицитами, могут обеспечить ценный подход к более точно имитировать физиологические ангиогенные события.
Настоящее исследование направлено на разработку 3D-культуры сфероидного ангиогенеза анализ с сочетанием человека эндотелиальной колонии формирования клеток (ECFCs) и мезенхимальных стволовых клеток (MSCs), чтобы более тесно отражать в виво ангиогенеза. Кокультурная сфероидная система в качестве представления in vitro сборки нормального кровеносного сосуда была впервые создана Korff et al. в 2001году 11. Они объединили HUVECs и человеческие пупочные артерии гладкие мышечные клетки (HUSMCs), и показали, что совместная культура двух зрелых сосудистых клеток снижается потенциал прорастания. Зрелые ECs (HUVECs), как известно, постепенно теряют свою способность распространяться и дифференцировать, что негативно влияет на их ответы ангиогенеза12,13. Зрелые периваскулярные клетки (ГУСМК) могут вызвать инактивацию эндотелиальной клетки через отмену сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) отзывчивости11. Основное различие между системой Сфероидов Корфа и нашей совместной культуры заключается в используемых типах клеток. Мы применили два сосудистых прекурсора, ECFCs и MSCs, чтобы создать правильную систему асссирования ангиогенеза для проверки и исследования про-или-анти-ангиогенных агентов. ECFCs являются предшественником ECs. ECFCs имеют надежный потенциал распространения по сравнению со зрелыми ECs14, которые позволяют преодолеть ограничение ECs. ECFCs способствовать формированию новых судов во многих послеродовых патофизиологических условиях15,16,17. MSCs плюрипотентные стволовые клетки, которые имеют способность дифференцировать в перициты, тем самым способствуя ангиогенез18,19.
В предыдущих докладах, ECFCs и MSCs показали синергетический эффект на образование пробирки трубки20, in vivo неоваскуляризации21,22, и улучшение реперфузии ишемических тканей23,24. В настоящем исследовании, ECFCs и MSCs были использованы для формирования совместной культуры сфероидов и встроенных в тип I коллагена гель для отражения in vivo 3D окружающей среды. Коллаген считается одним из основных компонентов внеклеточной матрицы (ECM), окружающей ECs25. ECM играет важную роль в регулировании поведения клеток26. Предложенный здесь протокол анализа может быть легко и быстро осуществлен в течение двух дней с использованием общих лабораторных методов. Для эффективного отслеживания клеток в процессе прорастания, каждый тип клеток может быть флуоресцентно помечены и контролироваться с помощью записи клеток в режиме реального времени. Недавно созданная 3D-система анализов сфероидного ангиогенеза предназначена для повышения чувствительности к оценке потенциальных ангиогенных модуляторов и предоставления предсказуемой информации до исследования in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ECFCs человека были изолированы от человеческой периферической крови, как описано в предыдущем докладе27. Короче говоря, моноядерный слой клетки был отделен от всей крови с помощью Ficoll-Paque Plus, и культивировался в надлежащей среде, пока эндотелиальных колоний появились. Колонии были собраны и ECFCs были выделены с помощью CD31 покрытием магнитных бусин. MSCs были выделены из адепта моноядерной клетки (MNC) фракции человеческого взрослого костного мозга. Протокол исследования был одобрен институциональным наблюдательным советом Дуксунского женского университета (IRB No 2017-002-01).
1. Культура клеток
-
Подготовка ECFCs и MSCs средних и шерстяных пластин
- Подготовка эндотелиальных клеток среднего роста MV2 (ECGM-MV2, за исключением гидрокортизона) дополняется 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS) и 1% глутамин-пенициллилин-стрептомицин (GPS).
- Подготовка мезенхимальных рост стволовых клеток среднего-2 (MSCGM-2), содержащий 10% FBS и 1% GPS.
- Для культуры ECFC, пальто клеточной культуры пластин с 1% желатина раствора. Для приготовления 1% желатина раствор, растворить 1 г геляционного порошка в 500 мл PBS с магнитным мешалкой, и стерилизовать с автоклавом. Плиты могут быть покрыты 3 мл/60 мм, 5 мл/100 мм, или 15 мл/150 мм 1% желатина раствора. Инкубировать пластины с покрытием в течение 15 минут в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию и 5% CO2). После этого, удалить оставшиеся 1% желатина решение аспирации и мыть покрытые пластины один раз с PBS.
-
Растущие ECFCs и MSCs
- Семена 1 х 106 ECFCs на 1% желатина покрытием 150 мм пластин, и расти с помощью ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) в инкубаторе культуры клеток (37 градусов по Цельсию и 5% CO2) до 80-90% сплава. Используйте ECFCs на проходных номерах 7-10 для получения последовательных результатов.
- Семена 1 х 106 MSCs на не-покрытие150 мм пластин, и расти с помощью MSCGM-2 в инкубаторе культуры клеток (37 градусов по Цельсию и 5% CO2) до 80-90% confluency. Используйте MSCs на проход номера 7-10 для получения последовательных результатов.
2. Подготовка 1,2% ж / V Метилцеллюлоза Решение
- Измерьте 6 г метиловой целлюлозы в стеклянной бутылке 500 мл и стерилизуйте в автоклаве.
- Тепло ECGM-MV2 (без FBS и GPS) при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 20 мин, и добавить 250 мл с подогревом ECGM-MV2 для стерилизованного порошка метиловой целлюлозы. Для поддержания стерильных условий, осуществлять процесс внутри потока капот.
- Добавьте стерилизованный магнитный перемешивание и смешайте раствор в течение 20 минут на магнитном мешалке до тех пор, пока метиловая целлюлоза не будет тщательно смачивана и равномерно рассеяна без комков. Добавьте 250 мл холодного (4 кВ) ECGM-MV2 (без FBS и GPS) в стерильных условиях и перемешайте еще 10 минут на магнитном усилителе. Затем охладите раствор в холодильнике (4 градуса По Цельсию) на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метилцеллюлоза является углеводным полимером, который хорошо растворяется при низких температурах из-за отеков и последующего гидратации. - На следующий день, aliquot раствор в 50 мл трубки и центрифуги на 5000 х г на 3 ч при 4 c. Возьмите четкий вязкий супернатантный раствор и храните при 4 градусах Цельсия до использования до 3-6 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отложения могут содержать остаточное целлюлозное волокно, поэтому аккуратно принимать супернатантный раствор, оставляя позади по крайней мере 5 мл объема. Этот объем может быть скорректирован в соответствии с экспериментальными условиями.
3. Генерация и встраивание только ECFCs, MSCs-только, и ECFCs-MSCs сфероидов
День 1
- Подготовка экворутов и суспензии ячейки MCCs
- Вымойте 80-90% сливочных ECFCs и MSCs, добавив фосфат буферизированный солен (PBS) без кальция и магния, и аспират.
- Чтобы отделить ECFCs и MSCs от культуры пластины, инкубировать их с 0,05% трипсин-EDTA в течение 3 мин и 5 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 и 5% CO2), соответственно, в инкубаторе клеточной культуры.
- Инактивируйте трипсин, добавляя среду DMEM, содержащую 10% FBS и 1% GPS. Pipette клетки вверх и вниз, чтобы создать одну подвеску ячейки.
- Отложение клеток центрифуги при 282 х г в течение 5 мин на RT.
- Удалите супернатант и повторно приостановите клетки в соответствующей среде.
- Маркировка ECFCs и MSCs флуоресцентным красителем
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните клеточной мембранной маркировки ECFCs с PKH67 (зеленый) и MSCs с PKH26 (красный) флуоресцентный краситель после инструкций производителя с небольшими изменениями следующим образом.- Вымойте клетки два раза с сывороткой свободной среде, чтобы удалить FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белки и липиды в FBS снижает эффективную концентрацию красителей для маркировки клеток путем связывания. - Подсчитайте ECFCs и MSCs с помощью гемоцитометра под микроскопом, и передать 3 х 106 ECFCs и 2 х 106 MSCs в 2 мл микро-трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальная плотность клеток для маркировки клеток красителями. Использование большого количества клеток вызывает плохое и неоднородное окрашивание, в то время как использование слишком небольшого количества клеток приводит к восстановлению бедных клеток. - Центрифуга труб на 100 х г в течение 5 минут на RT для получения клеточной гранулы. Тщательно аспирируйте супернатант, оставляя не более 15-25 л остаточного объема.
- Повторно приостановить ECFCs и MSCs в 250 Л Обезопаденного C из комплекта красителя. Аккуратно пипетка подвески ячейки для обеспечения полного дисперсии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавитель C является физиологическим солью, и может уменьшить эффективность окрашивания красителя путем формирования мицелл. Поэтому не позволяйте клеткам долго стоять в разбавителье С и не вихрем труб. - Подготовьте раствор для окрашивания для ECFCs, добавив от 5 кЛ PKH67 до 250 л Diluent C (окончательная концентрация 20 мкм) и для МСК, добавив 3 КЛ PKH26 до 250 л Diluent C (окончательная концентрация 12 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации красителей отличаются от рекомендаций производителя. Высокая концентрация приведет к слипанию клеток и токсичности клеток. Низкая концентрация не будет достаточной для окрашивания. - Добавьте 250 кЛ суспензии клеток ECFCs к 250 злителю раствора красителя PKH67 и 250 Зл Омск до 250 л раствора красителя PKH26. Немедленно смешайте клетки с красителем путем pipetting вверх и вниз и инкубировать на 5 минут на комнатной температуре. Для получения лучших результатов, покрыть трубку алюминиевой фольгой и поместите на шейкер, чтобы обеспечить достаточное смешивания во время окрашивания.
- Остановите процесс окрашивания, добавив 0,5 мл FBS в суспензию окрашенных клеток, а затем инкубировать в течение 1 мин, чтобы позволить FBS связать избыток несвязанного красителя. Отложение окрашенных клеток центрифуги при 100 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECFCs и MSCs гранулы светло-желтый и розовый, соответственно, после окрашивания. - Тщательно удалить супернатант и мыть клетки два раза с полной среде, чтобы удалить избыток красителя. Centrifuge труб на 100 х г в течение 5 минут и повторно приостановить гранулы в 2 мл каждой полной среде.
- Вымойте клетки два раза с сывороткой свободной среде, чтобы удалить FBS.
- Генерация сферои ECFC, MSC или ECFC-MSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Применить висячие капли техники для создания сфероидов, как описано ранее28. Ниже приведены шаги по подготовке сфероидов.- Подсчитайте окрашенные ECFCs и MSCs.
- Приостановить окрашенные ECFCs, MSCs или ECFCs-MSCs в ECGM-MV2, содержащий 20% methylcellulose раствор и 5% FBS. Подготовка при плотности клеток 4 х 104 ячеек/мл для ECFCs или MSCs (25 Л. клеточной суспензии содержит 1000 клеток). Для двух клеточной суспензии ECFCs и MSCs, подготовить при плотности клеток 2 х 104 ячейки / мЛ ECFCs и 0,4 х 104 ячейки / мл MSCs (25 Л содержит 500 ECFCs и 100 MSCs).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение ECFCs к MSCs не должно превышать 5:1. Большее число МСК может привести к чрезмерной миграции и нерегулярной морфологии ростков. Меньшее количество МСК может привести к плохому взаимодействию между клетками, что приводит к плохому прорастаниям. - Подготовьте универсационный блок, добавив 15 мл PBS в нижней части 150-мм культурной пластины.
- Перенос клеточной подвески в стерилизованный полистирол прямоугольный резервуар для использования многоканального пипетки. Рассеять клетки подвески равномерно путем pipetting.
- Депозит 25 капель клеточной подвески на крышку 150-мм культурной пластины с помощью многоканальной пипетки (примерно 100 капель/крышки 150-мм пластины). Перевернуть крышку над заполненным PBS увлажнятелем и инкубировать в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор метилцеллюлозы обеспечивает надлежащую вязкость супойного раствора. Когда висячие капли метод был выполнен без раствора метилцеллюлозы, капли были легко поскользнулся вниз, когда крышка была перевернута(Дополнительная рисунок 1). Кроме того, после ночной инкубации, сфероиды не были идеально сформированы без раствора метилцеллюлозы. Этот результат показывает, что надлежащая вязкость раствора метилцеллюлозы необходима для формирования круглой формы сфероидов.
День 2
- Встраивание сфероидов в нейтрализованный коллагеновый гель
- Теплые FBS и ECGM-MV2 (без FBS и GPS) в водяной бане (37 градусов по Цельсию). Поместите холодный раствор метилцеллюлозы на рабочую скамейку, чтобы довести до комнатной температуры.
- Поместите 24-колодую пластину в инкубатор клеточной культуры (37 градусов по Цельсию) для потепления.
- Вырезать остроконечные 1 мл пипетки советы 3-5 мм, чтобы аспирировать сфероиды и вязкие подвески, такие как раствор метилцеллюлозы и типа I коллагена, удобно и точно.
- Подготовка 3 мг /мл нейтрализованного типа I коллагена гель на льду после типа I коллагена гель производителя инструкции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализация должна проводиться на льду, чтобы избежать гелирования коллагена при комнатной температуре. Для одной скважины из 24-колодца требуется 500 л нейтрализованного коллагена. Всегда готовьте 1 мл дополнительного объема коллагена. Коллагеновый гель можно использовать до 2-3 ч после нейтрализации, если держать на льду. - Урожай сфероидов путем промывки крышки, содержащей сфероиды с 5 мл PBS. Соберите сфероидно-подвесной раствор в конической трубке 50 мл. Повторно промыть крышку с 5 мл PBS для получения оставшихся сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время сбора урожая внимательно наблюдать, чтобы подтвердить существование сфероидов. Для более визуального осмотра, передача около 50-100 Л сфероидов подвесного раствора на слайд-стекло, и проверить круглую форму сфероидов под микроскопом. - Отложение сфероидов центрифугиванием на 282 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант тщательно, не нарушая сфероидов, оставляя не более 100-200 Л остаточного объема.
- Аккуратно коснитесь стенки трубки так, чтобы сфероиды свободно подвешивали в оставшемся остаточном растворе 100-200 л.
- Добавьте ECGM-MV2, содержащий 5% FBS и 40% раствор метилцеллюлозы, в сфероидносодержащую трубку. Добавленный объем определяется на основе приблизительно 100 сфероидов/мл. Аккуратно смешайте сфероидную подвеску, протянив тупой наконечник 1 мл пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор метилцеллюлозы широко используется в качестве подтяжного агента, который не позволяет сфероидам осадок. Концентрация FBS должна сосугой 5%. Более высокая концентрация FBS вызывает аномальное прорастание из-за чрезмерных факторов роста. Более низкая концентрация FBS не может поддерживать здоровые условия для клеток. - Смешайте раствор сфероид-подвески и нейтрализованный коллагеновый гель i типа (3 мг/мл) при соотношении 1:1 на льду. Используйте тупой 1 мл пипетки отзыв, чтобы избежать нарушения сфероидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мл раствора коллагенного геля сфероидов требуется для одной скважины 24-колодца. Сделать дополнительный раствор смешанной подвески, если это возможно. - Если ангиогенные свойства любого агента (ы) или химических (ы) должны быть проверены, передача 1 мл сфероидов-подвески коллагена гель раствор в 1 мл микро-трубки и добавить агент (ы) или химических (ы) с последующим нежным смешивания с тупым 1мЛ пипетка отзыв.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем агента и химического вещества может составить до 200 мл, что разбавляет концентрацию коллагенового геля i типа от 1,5 мг/мл до 1,25 мг/мл, но не влияет на полимеризацию коллагенового геля i типа. Добавьте такой же том корабля к сфероидам управления. - Добавьте раствор сфероид-подвески коллагенного геля в колодцы предварительно прогретой 24-хорошей пластины (0,9 мл/ну) путем пайпетирования, а затем инкубируйте в течение 30 мин в инкубаторе клеточной культуры для полимеризации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса встраивания сфероидов не нарушайте гель, возбуждая пластину. - Обложка сфероид-приостановки коллагена гель, добавив 100 зл и глотаэков ECGM-MV2, содержащих 2,5% FBS с / без VEGF. Для ECFC только сфероидов, стимулировать клетки с экзогенным добавлением VEGF (окончательная концентрация 50 нг /мл) для формирования надлежащей ростки. Сфероиды ECFC-MSC не требуют экзогенной стимуляции какими-либо факторами роста.
- Поместите пластину в клеточный регистратор, установленный в инкубаторе клеточной культуры (37 градусов по Цельсию и 5% CO2),и случайно сосредоточьтесь на 5-10 сфероидах (объектив 10x объективной линзы). Мониторинг формирования прорастания каждого флуоресценции помечены сфероидов каждые 1 ч в течение 24 ч без каких-либо нарушений.
4. Квантитат Сфероид прорастания
- Импортируйте файлы изображений в программное обеспечение ImageJ, чтобы количественно определить количество ростков и измерить длину каждого ростка. Для сфероидов совместной культуры, этикетка ECFCs с зеленым флуоресцентным красителем, прежде чем сделать сфероиды. Затем измерьте количество и длину ростков, окрашенных зеленой флуоресценцией(Дополнительная рисунок 2). Пять случайно отобранных сфероидов были количественно в экспериментальной группе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ростки являются совместно удлиненные структуры, образованные несколько ECFCs расширения из сфероидов. Длина ростка измеряется как длина от точки происхождения ростков от поверхности сфероидов до кончика ростков. - Выразите значения как средства - SEM, по крайней мере, трех независимых экспериментов. Определите статистически значимую разницу по односторонней ANOVA для нескольких сравнений или t-testStudent для парных сравнений.
ПРИМЕЧАНИЕ: P 0,05 считается статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сравнение экспериментов проводилось с использованием монокультурных сфероидов (только Для ECFCs) и сфероидов совместной культуры (ECFCs-MSCs) для изучения того, играют ли МСК значительную роль в ангиогенезе, опосредовав опосредованный ECFCs. Формирование прорастания из каждого сфероида отслеживалось в течение 24 ч с помощью клеточного самописца в реальном времени, который мог фиксировать прогрессирование ангиогенного прорастания из сфероидов. Ангиогенный потенциал был количественно путем подсчета количества ростков и измерения кумулятивной длины ростков, генерируемых отдельными сфероидами. Были проанализированы пять случайно отобранных сфероидов на экспериментальную группу. Для сфероидов ECFCs-MSCs количество ростков и кумулятивная длина ростка были значительно выше по сравнению с сфероидами только ECFCs на всех временных точках(рисунок 1A-C). Ростковые количество и длина сфероидов ECFCs-MSCs постоянно увеличивались на 12 ч, но количество и длина сфероидов только ECFCs увеличились на 6 ч и не менялись в более поздние временные точки(рисунок 1B,C). Кроме того, ростки, образованные сфероидами ECFCs-MSCs, были толще и долговечнее, чем те, которые образуются только сфероидами ECFCs с/без лечения VEGF(Рисунок 1A, и Дополнительное видео 1A,B,D). MSCs только сфероиды не образуют ростки, но показал индивидуальную миграцию MSCs за пределами сфероидов(Рисунок 1И и дополнительное видео 1C). Эти результаты демонстрируют значительный вклад MSCs, перицитных прекурсоров, в клеточный ангиогенез ECFCs. MSCs, как известно, выделяют различные факторы роста29, которые могут стимулировать ECFCs к форме ростков и трубчатых структур.
ECFCs были помечены зелено-флуоресцентным красителем и MSCs были помечены красно-флуоресцентным красителем перед объединением для создания сфероидов ECFCs-MSCs. Вместе с записью в реальном времени, эта техника маркировки флуоресценции живых клеток может отслеживать клеточные движения ECFCs и MSCs во время образования ростков. Флуоресцентные изображения показали, что ECFCs-опосредованных структур ростока были покрыты MSCs(Рисунок 2 и Дополнительное видео 2). Это говорит о том, что комбинированные MSCs функционируют как периваскулярные клетки во время образования ростков, которые повышают стабильность и долговечность при тесной связи между двумя сосудистыми клетками.
Недавно разработанная система сфероидного ассеа была протестирована с помощью bevacizumab, утвержденного FDA ингибитора ангиогенеза, чтобы проверить его потенциал для проверки антиангиогенных препаратов. Сфероиды ECFCs-MSCs, предварительно обработанные бевацизумабом, показали снижение количества ростков и кумулятивной длины ростка в зависимости от дозы, по сравнению с контрольными сфероидами ECFCs-MSCs(рисунок 3A,B). В параллельных экспериментах, ECFCs только сфероиды предварительно обработанные с bevacizumab следуют стимуляции с VEGF (50 нг /мл) также показали снижение VEGF индуцированных ростков и кумулятивной длины в дозе зависимым образом (Рисунок 3C, D) . Следует отметить, что ic50 значения bevacizumab для ингибирования кумулятивной длины ростка в Сфероидов ECFCs-MSCs был в 46 раз больше, чем в ECFCs только сфероидов (Таблица 1). Этот результат сильно подразумевает, что более высокая концентрация необходима для ингибирования физиологически релевантных сосудистых формации ECFCs и MSCs по сравнению с концентрацией, необходимой для ингибирования только EC-опосредованного сосудистого образования.
Далее, ксенотрансплантат опухолевой мыши модель была выполнена с bevacizumab лечения, чтобы выявить, какие сфероидной системы обеспечивают предсказуемые данные, коррелирующие с in vivo эффективной концентрации плазмы. Глиобластома U87MG-Red-FLuc, полученная человеком, была подкожно введена мышам с ослабленным иммунитетом. После подтверждения образования опухоли на 1 неделе, мыши были случайным образом разделены на 3 группы, которые получили различные методы лечения: контроль (0 мг/кг), низкая доза (1 мг/кг), и высокая доза (30 мг/кг). Рост опухоли был значительно подавлен в 30 мг/кг-обработанной группы по сравнению с контрольной группой(Дополнительная рисунок 3A). Группа, обработанная в 1 мг/кг, показала тенденцию к уменьшению опухоли, но статистической разницы по сравнению с контрольной группой не наблюдалось. Концентрация мышиной плазмы на 3 неделе лечения бевацзумумаба составила 568,0 х 40,62 мкг/мл при 30 мг/кг и 38,1 х 0,72 мкг/мл при 1 мг/кг(Дополнительная цифра 3В). Примечательно, что концентрация в плазме бвацизумаба, показывающая эффективное ингибирование (568,0 х 40,62 мкг/мл при 30 мг/кг в течение 3 недель лечения), была тесно достигнута сфероидами ECFCs-MSCs (1261,5 х 214,49 мкг/мл), но не Сфероидами ECFCs-только (27.0/9Л). Таким образом, система сфероидного ангиогенеза ECFCs-MSCs может рассматриваться как подходящая система анализов для прогнозирования эффективной концентрации плазмы перед экспериментами на животных.
Рисунок 1: Образование ростков только от ECFCs, MSCs-только, и ECFCs-MSCs сфероидов. (A) Репрезентативные изображения образования ростков только от ECFCs-только, MSCs-только и ECFCs-MSC сфероидов, встроенных в тип I коллагена гель на 0, 6, 12, 18 и 24 ч (Шкала бар 100 мкм). (B) Количественный график числа ростков, образованных из ECFCs-только и ECFCs-MSCs сфероидов (средний -SEM, n No 3). (C)Количественный график кумулятивной длины ростка, образованной только из сфероидов, созданных только ECFCs и ECFCs-MSCs (средний SEM, n No 3). - указывает на существенную разницу между только ECFCs и сфероидами ECFCs-MSCs в тех же временных точках (стр. 0,05). указывает на существенную разницу между группами, указанными в кронштейне (стр. 0,05). Эта цифра была изменена с предыдущей лобковой30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Локализация ECFCs и MSCs в структурах ростка. Репрезентативные изображения, показывающие расположение двух типов клеток в структурах ростка после 24 h. ECFCs и MSCs были флуоресцентно помечены PKH67 (зеленый) и PKH26 (красный), соответственно, и выполняется 3D ECFCs-MSCs сфероидный ангиогенез. Стрелки показывают, что MSC были покрыты ECFCs-опосредованных структур ростка (Шкала бар 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Ингибиторное действие бевацизумаба на образование ростков от ECFCs-MSCs и сферои до ECFCs. Сфероиды ECFCs-MSCs и ECFCs-только были обработаны bevacizumab, а образование ростков контролировалось в течение 24 ч. (B) Количественный график кумулятивной длины ростка от сфероидов ECFCs-MSCs, обработанных бевацизумабом (средний-SEM, n no 3). (C)Количественный график числа ростков от VEGF-стимулировали ECFCs только сфероиды, обработанные bevacizumab (средний SEM, n No 3). (D) Количественный график кумулятивной длины ростка от VEGF-стимулировали ECFCs только сфероиды, обработанные bevacizumab (средний SEM, n No 3). указывает на существенную разницу от контрольной группы (белая панель) (стр. 0,05). указывает на значительное отличие от группы, обработанной VEGF (черная планка) (р 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Время h) |
IC50 (мг/мл) Авастина | р-значение | |
| Сфероид только ECFCs | Сфероид ECFCs-MSCs | ||
| 6 | 94,62 и 38,53 | 3058.21 - 373.31 | 0.003 |
| 12 | 58,61 и 17,80 | 2006 г. 484,73 | 0.015 |
| 18 | 83.38 - 54.54 | 1509.51 и 483.88 | 0.042 |
| 24 | 27.04 - 9,97 | 1261.51 и 214.49 | 0.0045 |
Таблица 1: IC50 значения bevacizumab для ингибирования кумулятивной длины ростка в либо ECFCs-только или ECFCs-MSCs сфероидов. Сфероиды только ECFCs лечились бевацизумабом, а затем стимуляцией с помощью VEGF (50 нг/мл), которая необходима для образования ростков от сферои только eCFCs. Сфероиды ECFCs-MSCs лечились бевацизумабом без стимуляции VEGF. Оба сфероида встроенных в тип I коллагена гель, и росткформирования от каждого сфероида наблюдалось в течение 24 ч с помощью записи клеток в режиме реального времени. Данные представлены в виде средних SEM (n No 3).
Дополнительная рисунок 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 3: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительное видео 1B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительное видео 1С: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительное видео 1D: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительное видео 2: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящее исследование ввести улучшенную систему анализа in vitro ангиогенеза с использованием сфероидов, образованных двумя человеческими сосудистыми клетками-прародителями, ECFCs и MSCs. осуществляется путем взаимодействия и включения между эндотелиальными клетками и перицитами. По сравнению с другими анализами in vitro ангиогенезом, которые отражают только опосредованный ECs ангиогенез, эта система анализа сокультуры более репрезентативно многоступенчатого каскада физиологических ангиогенезов, включая клеточное взаимодействие, прорастание, образование труб, и созревание сосуда. Эта недавно созданная система асссеа также напоминает внеклеточную микросреду in vivo, посевая сфероиды в коллагеновый гель типа I. Мы предполагаем, что 3D-система сфероидного ангиогенеза является надежной, повторяемой, легко поддается количественной оценке и, самое главное, физиологически релевантной.
При выполнении совместно-культуры сфероидного асссирования, важно вставлять сфероиды в гель с соответствующей концентрацией нейтрализованного типа I коллагена и FBS. Лучшая конечная концентрация нейтрализованного коллагена I типа составляет 1,5 мг/мл, а процент FBS составляет 2,5%. В предварительных экспериментах более высокие концентрации коллагена приводили к жесткому гелю и препятствовали качеству и количеству ростков, происходящих из сфероидов. Меньшие концентрации коллагена давали мягкий и хрупкий гель, который не мог поддерживать целостность сфероидов. Аналогичным образом, более высокое количество FBS вызвало plethoric прорастания из сфероидов на базальном уровне, независимо от ангиогенного фактора стимуляции. Более низкая концентрация FBS вела к плохим условиям клеток. Для последовательных и воспроизводимых результатов, должно быть внедрено надлежащее количество сфероидов (около 50 сфероидов/хорошо). Более 50 сфероидов / хорошо может привести к непосредственной близости сфероидов в скважине, которые могут аномально повлиять на качество и количество ростков.
Очень важно поддерживать коллаген i типа в охлажденных условиях во время нейтрализации и смешивания шагов с сфероидной подвеской, потому что коллаген может сгусток при комнатной температуре, что приводит к нерегулярной матрице. При смешивании сфероидной подвески с коллагенным раствором рекомендуется использовать 1 мл пипетки наконечник с 3-5 мм вырезать в конце, чтобы сделать широкое отверстие. Это позволяет легко обрабатывать вязкий коллагеновый раствор и защищает сфероиды от разрыва. Агитация пластины после встраивания сфероидного коллагена может нарушить целостность геля и привести к поломке, что может помешать нормальному поколению ростка.
При анализе сфероидов совместной культуры с использованием ECFCs и MSCs необходимо поддерживать соотношение 5:1. Использование большего числа MSCs причин распространения вокруг сфероида из-за мигрирующих фенотипа MSCs, которые могут повлиять на идеальное поколение ростка. Меньшее количество MSCs недостаточно, чтобы стимулировать прорастание ECFCs и покрыть ростки должным образом. Кроме того, необходимо проверить состояние клеток во время роста. Если плохое прорастание наблюдается, рекомендуется использовать еще один здоровый проходы клеток. Для лучшего результата настоятельно рекомендуется использовать ЭКФУ и МСК при прохождении менее 10.
Здесь мы представляем улучшенную систему 3D ангиогенеза с использованием сфероидов, которые тесно захватывают в виво ангиогенез. По сравнению с 2D одноклеточными системами анализа, эта система сфероидного анализа совместной культуры отражает более точно клеточные реакции между двумя типами сосудистых клеток для формирования трубчатых структур в физиологических условиях. Однако эта система остается чрезмерно упрощенной по сравнению со сложным многоступенчатым процессом инвио ангиогенеза. Сосудистая генерация in vivo обычно происходит через многократное взаимодействие различных других типов клеток, включая эпителиальные клетки, фибробласты, иммунные клетки, а также обильные белки ECM. Будущие применения этой новой системы включают введение других типов клеток и ECM, чтобы более точно отражать физиологический и/или патологический ангиогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом (17172MFDS215) от Министерства по безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств, грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIP) (2017R1A2B4005463) и Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
