Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Tredimensjonal co-kultur spheroid angiogenese analysen systemet er utformet for å etterligne den fysiologiske angiogenese. Co-kultur spheroids er dannet av to menneskelige vaskulære celle forløpere, ECFCs og MSCs, og innebygd i kollagen gel. Det nye systemet er effektivt for å evaluere angiogenic modulatorer, og gir mer relevant informasjon til in vivo studien.

Abstract

Studier innen angiogenese har vært aggressivt økende i de siste ti årene med erkjennelsen av at angiogenese er et kjennetegn på mer enn 50 ulike patologiske tilstander, slik som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer , og tumor metastasering. Under angiogenese narkotika utvikling, er det avgjørende å bruke in vitro analysen systemer med aktuelle celletyper og riktige forhold for å gjenspeile fysiologiske angiogenese prosessen. For å overvinne begrensninger av gjeldende in vitro angiogenese analysen systemer ved hjelp av hovedsakelig endothelial celler, utviklet vi en 3-dimensjonal (3D) co-kultur spheroid spirende analysen system. Co-kultur spheroids ble produsert av to menneskelige vaskulær celle forløpere, endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) med et forhold på 5 til 1. ECFCs + MSCs spheroids ble innebygd i type I kollagen matrise å etterligne in vivo ekstracellulære miljø. En sanntids celle opptaker ble benyttet for å kontinuerlig observere progresjon av angiogenic spirende fra spheroids for 24 h. live celle fluorescerende merkingsteknikker ble også brukt på tarmkanalen lokalisering av hver celle type under spire formasjon. Angiogenic potensiale ble kvantifisert ved å telle antall spirer og måle den kumulative lengden av spirer generert fra den enkelte spheroids. Fem tilfeldig valgte spheroids ble analysert per eksperimentell gruppe. Sammenligning eksperimenter viste at ECFCs + MSCs spheroids viste større spire tall og kumulativ spire lengde sammenlignet med ECFCs-bare spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkjent angiogenese inhibitor, ble testet med den nylig utviklede co-kultur spheroid analysen system for å verifisere potensialet til skjermen anti-angiogenic narkotika. IC50 -verdien for ECFCs + MSCs-spheroids sammenlignet med ECFCs-Only-spheroids var nærmere den effektive plasmakonsentrasjonen av bevacizumab Hentet fra xenograft tumor musemodell. Den nåværende studien tyder på at 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese analysesystem er relevant for fysiologiske angiogenese, og kan forutsi en effektiv Plasmakonsentrasjon i forkant av dyre eksperimenter.

Introduction

Ca 500 000 000 mennesker over hele verden er forventet å dra nytte av angiogenese-modulerende terapi for vaskulær misdannelse-assosiert sykdommer som revmatoid artritt, oculopathy, hjerte-og karsykdommer, og tumor metastasering1. Dermed har utviklingen av legemidler som kontrollerer angiogenese blitt et viktig forskningsområde i farmasøytisk industri. Under narkotika utviklingsprosessen er in vivo dyrestudier nødvendig for å undersøke virkningene av narkotika kandidater på fysiologiske funksjoner og systemiske interaksjoner mellom organene. Men etiske og kostnads spørsmål har økt bekymringene vedrørende dyre eksperimenter2. Derfor, forbedret in vitro analysen systemer er nødvendig for å oppnå mer nøyaktige og forutsigbare data som fører til bedre beslutningstaking før dyr eksperimenter. Current in vitro angiogenese analyser vanligvis måle spredning, invasjon, migrasjon, eller rørformede struktur dannelse av endothelial celler (ECs) seeded i to-dimensjonale (2D) kultur plater3. Disse 2D angiogenese analysene er raske, enkle, kvantitative og kostnadseffektive, og har i betydelig grad bidratt til oppdagelsen av angiogenese-modulerende narkotika. Men flere problemer gjenstår å bli bedre.

Slike 2D in vitro-analysen systemer kan ikke reflektere komplekse flertrinns hendelser av angiogenese som oppstår i in vivo fysiologiske forhold, fører til unøyaktige resultater som forårsaker avvik mellom in vitro-analysen data og klinisk utprøving utfall4. 2D kultur forhold også indusere endring av cellulære fenotyper. For eksempel, etter spredning i 2D kultur plater, ECs har en svak mobilnettet fenotype som manifestert ved redusert uttrykk for CD34 og flere signaler som regulerer cellulære responser5,6. For å overvinne begrensningene i 2D kultur-baserte angiogenese analysen systemer, tredimensjonale (3D) spheroid angiogenese analysen systemer har blitt utviklet. Spirende etterfulgt av rørformede struktur dannelse fra spheroids dannet av ECs reflektere in vivo neo-endometrial blodkar prosesser7,8. Dermed har 3D spheroid angiogenese analysen blitt betraktet som en effektiv analysen system for screening potensielle Pro-eller anti-angiogenese narkotika.

Høyst 3D spheroid angiogenese analyser anvende bare ECs, hovedsakelig Human navle vene endothelial celler (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulær endothelial celler (HDMECs) å fokusere mot det cellular svaret av ECs i løpet av angiogenese. Men blodkar består av to celletyper: ECs og pericytes. Utarbeide toveis interaksjon mellom ECs og pericytes er avgjørende for riktig vaskulær integritet og funksjon. Flere sykdommer, som arvelig slag, diabetiker retinopati, og venøs misdannelse, er assosiert med endret pericyte tetthet eller redusert pericyte vedlegg til endotelet9. Pericytes er også kjent som et nøkkelelement i angiogenic prosessen. Pericytes er rekruttert for å stabilisere nyopprettede fartøy strukturer av ECs. I denne forbindelse, mono-kultur spheroid angiogenese analysen ikke innlemme pericytes7,10. Derfor co-kultur spheroids dannet av ECs og pericytes kan gi en verdifull tilnærming til tettere etterligne fysiologiske angiogenic hendelser.

Den nåværende studien tok sikte på å utvikle en 3D co-kultur spheroid angiogenese analysen med en kombinasjon av menneskelig endothelial koloni forming celler (ECFCs) og Mesenchymal stamceller (MSCs) til nærmere reflektere in vivo angiogenese. Co-kultur spheroid system som en in vitro representasjon montering av en normal blodkar ble først etablert av korff et al. i 200111. De kombinerte HUVECs og menneskelige navle arterien glatte muskelceller (HUSMCs), og demonstrerte at co-kultur av to modne vaskulære celler redusert spirende potensialet. Eldre ECs (HUVECs) er kjent for å gradvis miste sin evne til å spre og differensiere, noe som negativt påvirker deres angiogenese svar12,13. Eldre inflammasjon celler (HUSMCs) kan forårsake endothelial celle deaktivering gjennom opphevelsen av vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) respons11. Den største forskjellen mellom korff ' s og vår co-kultur spheroid systemet er celle typene som brukes. Vi brukte to vaskulære forløpere, ECFCs og MSCs, å etablere en skikkelig angiogenese analysen system til skjermen og undersøke Pro-eller-anti-angiogenic agenter. ECFCs er forløperen til ECs. ECFCs har robust sprednings kapasitet sammenlignet med eldre ECs14, som gjør det mulig å overvinne begrensningen av ECS. ECFCs bidrar til nye fartøy dannelse i mange postnatal patofysiologisk forhold15,16,17. MSCs er Pluripotent stamceller som har kapasitet til å differensiere til pericytes, og dermed bidra til angiogenese18,19.

I tidligere rapporter, ECFCs og MSCs viste synergieffekter på in vitro tube formasjon20, in vivo neo-endometrial blodkar21,22, og forbedret reperfusion av iskemiske vev23,24. I denne studien, ECFCs og MSCs ble brukt til å danne co-kultur spheroids og innebygd i type I kollagen gel å reflektere en in vivo 3D miljø. Kollagen regnes som en stor bestanddeler av ekstracellulære matrise (ECM) rundt ECs25. ECM spiller en avgjørende rolle i å regulere celle atferden26. Analysen protokollen foreslås her kan enkelt og raskt utført innen to dager ved hjelp av vanlige laboratorie teknikker. For effektiv celle sporing under spirende prosessen, kan hver celle type bli fluorescensmerkete merket og overvåkes ved hjelp av en sanntids celle opptaker. Det ny-etablerte 3D tilpasse-kulturen spheroid angiogenese analysen system er beregnet på forhøye følsomheten for vurderer muligheter angiogenic modulatorer og å skaffe forutsigbar beskjed på forhånd av inne vivo studere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human ECFCs ble isolert fra humant perifert blod som beskrevet i en tidligere rapport27. Kort, mononukleære celle laget ble skilt fra hele blodet ved hjelp av Ficoll-Paque Plus, og kultivert i riktig medium til de endothelial koloniene ble vist. Kolonier ble samlet og ECFCs ble isolert ved hjelp av CD31-belagte magnetiske perler. MSCs ble isolert fra tilhenger mononukleære celle (MNC) brøkdel av menneskelig voksen benmarg. Studien protokollen ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangen styret ved Soyeon Women ' s University (IRB nr. 2017-002-01).

1. Cell kultur

  1. Forberede ECFCs og MSCs medium og pels plater
    1. Forbered endothelial cellevekst medium MV2 (ECGM-MV2, unntatt Hydrocortisone) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% glutamin-penicillin-Streptomycin (GPS).
    2. Forbered mesenchymal Stamcelle vekstmedium-2 (MSCGM-2) som inneholder 10% FBS og 1% GPS.
    3. For ECFC kultur, pels cellen kultur plater med 1% gelatin løsning. For å forberede 1% gelatin løsning, oppløse 1 g gelation pulver i 500 mL PBS med magnetiske stirrer, og sterilisere med autoklav. Platene kan være belagt med 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm, eller 15 mL/150 mm av 1% gelatin løsning. Ruge belagt plater i 15 minutter i en cellekultur inkubator (37 ° c og 5% CO2). Etter da, fjerne de resterende 1% gelatin løsning ved aspirasjon og vaske belagt plater en gang med PBS.
  2. Økende ECFCs og MSCs
    1. Seed 1 x 106 ECFCs på 1% gelatin-belagt 150 mm plater, og vokse ved hjelp ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) i en cellekultur inkubator (37 ° c og 5% co2) til 80-90% confluency. Bruk ECFCs på passasje nummer 7-10 for å oppnå konsistente resultater.
    2. Seed 1 x 106 MSCs på ikke-belagt 150 mm plater, og vokse ved hjelp MSCGM-2 i en cellekultur inkubator (37 ° c og 5% co2) til 80-90% confluency. Bruk MSCs på passasje tall 7-10 for å oppnå konsistente resultater.

2. utarbeidelse av 1,2% w/v methylcellulose løsning

  1. Mål 6 g av metyl cellulose i en 500 mL glass flaske og sterilisere i en autoklav.
  2. Heat ECGM-MV2 (uten FBS og GPS) ved 60 ° c i 20 min, og tilsett 250 mL oppvarmet ECGM-MV2 til sterilisert metyl cellulose pulver. For å opprettholde sterile forhold, Utfør prosessen inne i strømnings panseret.
  3. Legg til en sterilisert magnetisk røre bar og bland løsningen for 20 min på magnetiske stirrer til methyl cellulose er grundig fuktet og jevnt spredt uten klumper. Tilsett 250 mL kaldt (4 ° c) ECGM-MV2 (uten FBS og GPS) under steril tilstand og bland i ytterligere 10 minutter på de magnetiske stirrer. Deretter chill løsningen i kjøleskap (4 ° c) over natten.
    Merk: Methylcellulose er et karbohydrat polymer som oppløses godt i kjølige temperaturer på grunn av hevelse og påfølgende hydrering.
  4. Neste dag, alikvot løsningen i en 50 mL rør og sentrifuger ved 5 000 x g for 3 t ved 4 ° c. Ta den klare viskøs supernatanten løsningen og oppbevar ved 4 ° c til bruk i opptil 3-6 måneder.
    Merk: Sediment kan inneholde rester cellulose fiber, så forsiktig ta supernatanten løsningen etterlater minst 5 mL volum. Dette volumet kan justeres i henhold til eksperimentelle forhold.

3. generering og innebygging av ECFCs bare, MSCs-bare, og ECFCs-MSCs Spheroids

Dag 1

  1. Forberede ECFCs og MSCs celle suspensjon
    1. Vask 80-90% confluent ECFCs og MSCs ved å tilsette fosfat bufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium, og aspirer.
    2. Å løsne ECFCs og MSCs fra kulturen plate, ruge dem med 0,05% Trypsin-EDTA for 3 min og 5 min i en cellekultur inkubator (37 ° c og 5% CO2), henholdsvis i en cellekultur inkubator.
    3. Deaktiver Trypsin ved å legge til DMEM-medium som inneholder 10% FBS og 1% GPS. Pipetter cellene opp og ned for å lage en enkelt celle suspensjon.
    4. Sediment cellene ved sentrifugering ved 282 x g for 5 min på RT.
    5. Fjern supernatanten, og suspendere cellene i det respektive mediet på nytt.
  2. Merking ECFCs og MSCs med fluorescerende fargestoff
    Merk: Utfør celle membran merking av ECFCs med PKH67 (grønn) og MSCs med PKH26 (rød) fluorescerende fargestoff etter produsentens instruksjoner med litt modifikasjoner som følger.
    1. Vask cellene to ganger med serum fritt medium for å fjerne FBS.
      Merk: Proteiner og lipider i FBS reduserer den effektive farge konsentrasjonen for merking celler ved binding.
    2. Count ECFCs og MSCs ved hjelp av en hemocytometer under mikroskopet, og overføre 3 x 106 ECFCs og 2 x 106 MSCs i 2 ml mikro-rør.
      Merk: Dette er den optimale celle tettheten for merking av celler med fargestoffer. Bruk av et stort antall celler forårsaker dårlig og heterogen farging, mens bruk av for få celler gir dårlig celler utvinning.
    3. Sentrifuger rørene på 100 x g i 5 min på RT for å få en celle pellet. Forsiktig aspirer supernatanten og etterlater ikke mer enn 15-25 μL av restvolum.
    4. Re-suspendere ECFCs og MSCs i 250 μL av fortynningsvæske C fra fargestoff settet. Pipetter celle fjæringen forsiktig for å sikre fullstendig spredning.
      Merk: Fortynningsvæske C er en fysiologiske salt, og kan redusere farging effektiviteten av fargestoff ved å danne miceller. Derfor ikke la cellene stå i fortynningsvæske C for lang, og ikke Vortex rørene.
    5. Klargjør farge løsningen for ECFCs ved å tilsette 5 μL av PKH67 til 250 μL av fortynningsvæske C (endelig konsentrasjon på 20 μM) og for MSCs ved å tilsette 3 μL av PKH26 til 250 μL av fortynningsvæske C (siste konsentrasjon på 12 μM).
      Merk: De endelige fargestoff konsentrasjonene er forskjellige fra produsentens anbefalinger. Høy konsentrasjon ville føre til celle klumper og celle toksisitet. Lav konsentrasjon ville ikke være tilstrekkelig for farging.
    6. Tilsett 250 μL av ECFCs celle fjæring til 250 μL av PKH67 fargestoff løsning, og 250 μL av MSCs til 250 μL av PKH26 fargestoff løsning. Bland umiddelbart cellene med fargestoffer ved å pipettering opp og ned og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. For bedre resultater, dekk røret med aluminiumsfolie og plasser på en shaker for å sikre tilstrekkelig miksing under farging.
    7. Stopp farging prosessen ved å legge 0,5 mL FBS til farget celle suspensjonen, og deretter ruge i 1 min for å tillate FBS å binde overflødig ubundet fargestoff. Sediment de fargede cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 5 min.
      Merk: ECFCs og MSCs pellets er lys gul og rosa, henholdsvis etter farging.
    8. Fjern forsiktig supernatanten og vask cellene to ganger med komplett medium for å fjerne overflødig fargestoff. Sentrifuger rørene ved 100 x g i 5 min og re-suspendere pellet i 2 ml av hvert komplett medium.
  3. Genererer ECFC-, MSC-eller ECFC + MSC-spheroids
    Merk: Påfør hengende slipp-teknikken for å generere spheroids som beskrevet tidligere28. Trinnene for utarbeidelse av spheroids er gitt nedenfor.
    1. Telle farget ECFCs og MSCs.
    2. Suspendere beiset ECFCs, MSCs eller ECFCs + MSCs i ECGM-MV2 inneholder 20% methylcellulose løsning og 5% FBS. Forbered deg på en celle tetthet på 4 x 104 celler/ml for ECFCs eller MSCs (25 μL av celle fjæring inneholder 1 000 celler). For to celle suspensjon av ECFCs og MSCs, forberede i en celle tetthet på 2 x 104 celler/ml ECFCs og 0,4 x 104 celle/ml MSCS (25 μL inneholder 500 ECFCs og 100 MSCS).
      Merk: Ratio på ECFCs til MSCs bør ikke overstige 5:1. Et større antall MSCs kan føre til overdreven migrasjon og uregelmessig spire morfologi. Et mindre antall MSCs kan forårsake dårlig samspill mellom celler, gir dårlig spirende.
    3. Forbered en hydration enhet ved å legge 15 mL PBS i bunnen av en 150 mm kultur plate.
    4. Overfør celle fjæringen i sterilisert polystyren rektangulært reservoar for bruk av flerkanals pipette. Sprer cellene suspensjonen jevnt av pipettering.
    5. Depositum 25 μL dråper celle fjæring på forsiden av en 150 mm kultur plate med en flerkanals pipette (ca. 100 dråper/deksel på 150 mm plate). Inverter dekselet over en PBS-fylt hydration enhet og ruge i en cellekultur inkubator for 24 h.
      Merk: Methylcellulose løsning gir en riktig viskositet til fjærings løsningen. Når hengende dråpe metoden ble utført uten methylcellulose løsning, dråper ble lett gled ned når dekselet var invertert (supplerende figur 1). Videre, etter natten inkubasjons, spheroids var ikke perfekt formet uten methylcellulose løsning. Dette resultatet indikerer at riktig viskositet ved methylcellulose løsning er nødvendig for å danne rund form av spheroids.

Dag 2

  1. Innebygging spheroids i nøytralisert kollagen gel
    1. Varm FBS og ECGM-MV2 (uten FBS og GPS) i et vannbad (37 ° c). Plasser kald methylcellulose løsning på en arbeidsbenk for å bringe til romtemperatur.
    2. Plasser en 24-brønn plate i en cellekultur inkubator (37 ° c) for oppvarming.
    3. Skjær den spisse 1 mL pipette Tips 3-5 mm til aspirer spheroids og tyktflytende suspensjoner, for eksempel methylcellulose løsning og type I kollagen, komfortabelt og nøyaktig.
    4. Klargjør 3 mg/mL nøytralisert type I kollagen gel på isen etter typen jeg kollagen gel produsentens instruksjon.
      Merk: Nøytralisering bør utføres på isen for å unngå gelation av kollagen ved romtemperatur. For en brønn av en 24-brønn plate, er 500 μL av nøytralisert kollagen nødvendig. Forbered alltid 1 mL ekstra volum av kollagen. Kollagen gel kan brukes opp til 2-3 h etter nøytralisering hvis holdt på isen.
    5. Høste spheroids ved å skylle trekket som inneholder spheroids med 5 mL PBS. Samle spheroid løsning i et 50 mL konisk rør. Skyll dekselet på nytt med 5 mL PBS for å få tak i de resterende spheroids.
      Merk: Under innhøstingen, nøye observere å bekrefte eksistensen av spheroids. For mer visuell inspeksjon, overføring ca 50-100 μL av spheroid løsning på glassplaten, og kontroller den runde formen på spheroids under mikroskopet.
    6. Sediment spheroids ved sentrifugering ved 282 x g i 5 min. kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre spheroids som etterlater seg ikke mer enn 100-200 μL av restvolum.
    7. Trykk forsiktig på veggen av røret slik at spheroids er fritt suspendert i den resterende 100-200 μL gjenværende oppløsning.
    8. Legg ECGM-MV2 som inneholder 5% FBS og 40% methylcellulose løsning på spheroid-inneholdende rør. Volumet som legges til, fastsettes basert på omtrent 100 spheroids/mL. Bland forsiktig spheroid suspensjonen ved å pipettering med en stump 1 mL pipette spiss.
      Merk: Methylcellulose løsning er mye brukt som en suspendere agent som ikke tillater spheroids til sediment. FBS konsentrasjon bør være 5%. Høyere FBS-konsentrasjon forårsaker unormal spirende på grunn av overdreven vekstfaktorer. Lavere FBS konsentrasjon kan ikke opprettholde sunne forhold for celler.
    9. Bland spheroid-suspensjon løsning og nøytralisert-type I kollagen gel (3 mg/mL) på et 1:1 ratio på isen. Bruk en stump 1 mL pipette tupp for å unngå å bryte spheroids.
      Merk: 1 ml av spheroids-suspendere kollagen gel løsning er nødvendig for en brønn av en 24-brønn plate. Lag en ekstra blandet suspensjon løsning hvis mulig.
    10. Hvis angiogenic egenskaper eller kjemikalier må testes, overfører du 1 mL av spheroid kollagen gel i et 1 mL mikro-rør og legger til agent (er) eller kjemiske (s) etterfulgt av skånsom blanding med en stump 1mL pipette spissen (e).
      Merk: Volumet av agent og kjemiske kan summere til 200 mL, som utvanner den typen jeg kollagen gel konsentrasjon fra 1,5 mg/mL til 1,25 mg/mL, men påvirker ikke type I kollagen gel polymerisering. Legg samme volum av kjøretøyet til kontroll spheroids.
    11. Tilsett spheroid-suspendere kollagen gel løsning i brønner av en forvarmet 24-brønn plate (0,9 mL/brønn) ved pipettering, og deretter ruge i 30 min i en cellekultur inkubator for polymerisering.
      Merk: Under spheroid embedding, ikke forstyrr gelen ved å agitating platen.
    12. Dekk til spheroid-suspendere kollagen gel ved å tilsette 100 μL av ECGM-MV2 inneholdende 2,5% FBS med/uten VEGF. For ECFC-bare spheroids, stimulere cellene med eksogene tilsetning av VEGF (endelig konsentrasjon av 50 ng/mL) for å danne riktig spirer. ECFC + MSC spheroids krever ikke eksogene stimulering av noen vekstfaktorer.
    13. Plasser platen i en sanntids celle opptaker installert i en cellekultur inkubator (37 ° c og 5% CO2), og tilfeldig fokus på 5-10 spheroids (10x objektiv objektiv). Overvåk den spirende dannelsen av hver fluorescens-merket spheroids hver 1 h for 24 timer uten forstyrrelse.

4. quantitate spheroid spirende

  1. Importer bildefilene til ImageJ programvare for å quantitate antall spirer og måle lengden på hver spire. For co-kultur spheroids, etiketten ECFCs med grønt fluorescerende fargestoff før du gjør spheroids. Deretter måler du antall og lengden på spirer beiset med grønne fluorescens (supplerende figur 2). Fem tilfeldig valgte spheroids ble kvantifisert per eksperimentell gruppe.
    Merk: Spirer er i samarbeid langstrakte strukturer dannet av flere ECFCs strekker seg ut av spheroids. Spire lengde måles som lengden fra det punktet av spirer opprinnelse fra overflaten av spheroids til tuppen av spirer.
  2. Uttrykke verdiene som betyr ± SEM av minst tre uavhengige eksperimenter. Bestem den statistisk signifikante forskjellen med enveis ANOVA for flere sammenligninger eller student t-test for sammenkoblede sammenligninger.
    Merk: P ≤ 0,05 regnes som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligning eksperimenter ble utført ved hjelp av mono-kultur spheroids (ECFCs-Only) og co-kultur spheroids (ECFCs + MSCs) for å undersøke om MSCs spille en betydelig rolle i ECFCs-mediert angiogenese. Spirende formasjon fra hver spheroid ble overvåket i 24 timer av en sanntids celle opptaker som kunne fange progresjon av angiogenic spirende fra spheroids. Angiogenic potensiale ble kvantifisert ved å telle antall spirer og måle den kumulative lengden av spirer generert fra individuelle spheroids. Fem tilfeldig valgte spheroids per eksperimentell gruppe ble analysert. For ECFCs + MSCs spheroids, antall spirer og kumulativ spire lengde var signifikant høyere sammenlignet med de av ECFCs-bare spheroids på alle tid-poeng (figur 1A-C). Spire antall og lengde av ECFCs + MSCs spheroids økt kontinuerlig i 12 h, men antallet og lengden av ECFCs-Only spheroids økte for 6 h og endret ikke på senere tidspunkt-poeng (figur 1B, C). I tillegg spirer dannet av ECFCs + MSCs spheroids var tykkere og mer holdbare enn de som ble dannet av ECFCs-bare spheroids med/uten VEGF behandling (figur 1A, og supplerende video 1a, B, D). MSCs-bare spheroids ikke danne spirer, men viste individuell migrering av MSCs utenfor spheroids (figur 1A og supplerende video 1C). Disse resultatene viser betydelig bidrag av MSCs, pericyte forløpere, til mobilnettet angiogenese av ECFCs. MSCs er kjent for å skille ut ulike vekstfaktorer29 som kan stimulere ECFCs til å danne spirer og rørformede strukturer.

ECFCs ble merket med grønn-fluorescerende fargestoff og MSCs ble merket med rød-fluorescerende fargestoff før kombinere å generere ECFCs + MSCs spheroids. Sammen med sanntids opptak, denne live celle fluorescens merkingsteknikker kan spore cellulære bevegelser av ECFCs og MSCs under spire formasjon. Fluorescerende Imaging viste at ECFCs-mediert spire strukturer ble dekket med MSCs (figur 2 og supplerende video 2). Dette tyder på at kombinert MSCs-funksjonen som inflammasjon celler under spire formasjon, som forbedrer spire stabilitet og holdbarhet av stramme foreningen mellom to vaskulære celler.

Det ny-bebygget tilpasse-kulturen spheroid analysen system var testet med bevacizumab, en FDA-anerkjent angiogenese inhibitor, å bekrefte dens muligheter å skjermen anti-angiogenic medikamenter. ECFCs + MSCs spheroids forbehandlet med bevacizumab viste redusert spire antall og kumulativ spire lengde i en dose avhengig måte sammenlignet med kontroll ECFCs + MSCs spheroids (Figur 3a, B). I parallelle eksperimenter viste ECFCs-Only spheroids forbehandlet med bevacizumab etterfulgt av stimulering med VEGF (50 ng/mL) også redusert VEGF-indusert spire tall og kumulativ spire lengde i en dose avhengig måte (Figur 3C, D) . Av notatet, IC50 verdier for bevacizumab for hemme kumulativ spire lengde i ECFCs + MSCs-spheroids var 46 ganger større enn i ECFCs-bare Spheroids (tabell 1). Dette resultatet innebærer sterkt at høyere konsentrasjon er nødvendig for å hemme fysiologisk-relevant vaskulær dannelse av ECFCs og MSCs sammenlignet med konsentrasjonen som trengs for å hemme bare EC-mediert vaskulær formasjon.

Neste, en xenograft svulst musen modell var utført med bevacizumab handling å avsløre hvilke spheroid system skaffe forutsigbar data samkjøre med inne vivo effektiv plasmakonsentrasjonen. Human-avledet glioblastom U87MG-rød-svingninger cellelinje ble subkutant injisert med immun-mangelfull mus. Etter å ha bekreftet tumor dannelse på 1 uke, ble musene tilfeldig delt inn i 3 grupper som fikk forskjellige behandlinger: kontroll (0 mg/kg), lav dose (1 mg/kg) og høy dose (30 mg/kg). Tumor veksten ble betydelig hemmet i gruppen på 30 mg/kg behandlet sammenlignet med kontrollgruppe (supplerende figur 3A). 1 mg/kg-behandlet gruppe viste en tendens til tumor nedgang, men det var ingen statistisk forskjell sammenlignet med kontrollgruppen. Plasmakonsentrasjon av mus ved 3 ukers bevacizumab behandling ble 568.0 ± 40.62 μg/mL ved 30 mg/kg og 38.1 ± 0.72 μg/mL ved 1 mg/kg (supplerende figur 3b). Signifikant oppnås Plasmakonsentrasjon av bevacizumab som viser effektiv hemming (568.0 ± 40.62 μg/mL ved 30 mg/kg for 3 ukers behandling), ved ECFCs + MSCs-spheroids (1261.5 ± 214.49 μg/mL), men ikke ECFCs-bare spheroids (27.0 ± 9.97 μg/mL). Således, det ECFCs + MSCs spheroid angiogenese analysen system kan betraktet som som passende analysen system for forutsi effektiv plasmakonsentrasjonen i forkant av dyr eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: spire formasjon fra ECFCs-bare, MSCs-bare, og ECFCs + MSCs spheroids. (A) representative bilder av dannelse av spire fra ECFCs, MSCs-Only og ECFCS + MSC spheroids innebygd I type i kollagen gel ved 0, 6, 12, 18 og 24 h (Scale bar = 100 μm). (B) kvantitativ graf av spire tall dannet fra ECFCs-Only og ECFCs + MSCs spheroids (MEAN ± SEM, n = 3). (C) kvantitativ graf kumulativ spire lengde dannet fra ECFCs-Only og ECFCs + MSCs spheroids (MEAN ± SEM, n = 3). * indikerer signifikant forskjell mellom ECFCs-Only og ECFCs + MSCs-spheroids på samme tidspunkt-punkter (p ≤ 0,05). # indikerer signifikant forskjell mellom grupper indikert av en brakett (p ≤ 0,05). Dette tallet er endret fra en tidligere pubication30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: lokalisering av ECFCs og MSCs i spire strukturer. Representative bilder som viser steder av to celletyper i spire strukturer etter 24 h. ECFCs og MSCs ble fluorescensmerkete merket med PKH67 (grønn) og PKH26 (rød), henholdsvis, og utførte 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese analysen. Pilene viser at MSCs var dekket med ECFCs-mediert spire strukturer (Scale bar = 100 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: hemmende effekt av bevacizumab på spire formasjon fra ECFCs + MSCs og ECFCs-Only spheroids. ECFCs + MSCs og ECFCs-Only spheroids ble behandlet med bevacizumab, og spire formasjon ble overvåket for 24 h. (B) kvantitativ graf av kumulativ spire lengde fra ECFCs + MSCS spheroids behandlet med bevacizumab (MEAN ± SEM, n = 3). (C) kvantitativ graf av spire tall fra VEGF-stimulert ECFCs-Only spheroids behandlet med bevacizumab (MEAN ± SEM, n = 3). (D) kvantitativ graf av kumulativ spire lengde fra VEGF-stimulert ECFCs-bare spheroids behandlet med bevacizumab (MEAN ± SEM, n = 3). * indikerer signifikant forskjell fra kontrollgruppen (hvit bar) (p ≤ 0,05). # indikerer signifikant forskjell fra VEGF-behandlet gruppe (svart linje) (p ≤ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tid
h		 IC50 (μg/ml) av Avastin p-verdi
ECFCs-bare spheroid ECFCs + MSCs-spheroid
6 94,62 ± 38,53 3058,21 ± 373,31 0,003
12 58,61 ± 17,80 2006 ± 484,73 0,015
18 83,38 ± 54,54 1509,51 ± 483,88 0,042
24 27,04 ± 9,97 1261,51 ± 214,49 0,0045

Tabell 1: IC50 -verdier for bevacizumab for hemming av Kumulativ spire lengde i enten ECFCs-Only eller ECFCs + MSCs spheroids. ECFCs-Only spheroids ble behandlet med bevacizumab etterfulgt av stimulering med VEGF (50 ng/mL), som er nødvendig for dannelse av spire fra ECFCs-Only spheroids. ECFCs + MSCs spheroids ble behandlet med bevacizumab uten VEGF stimulering. Begge spheroids innebygd i type I kollagen gel, og spire formasjon fra hver spheroid ble observert i 24 timer ved hjelp av en sanntids celle opptaker. Data representeres som gjennomsnittet ± SEM (n = 3).

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 2
Supplerende figur 2: Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 3
Supplerende figur 3: Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental Video 1A
Tilleggs video 1a: Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplemental Video 1B
Tilleggs video 1B: Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplemental Video 1C
Supplerende video 1C: Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplemental Video 1D
Tilleggs video 1d: Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplemental Video 2
Tilleggs video 2: Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nåværende studien introduserer en forbedret in vitro angiogenese analysen system utnytte co-kultur spheroids dannet av to menneskelige vaskulær celle forfedre, ECFCs og MSCs. co-kultur spheroid systemet kan etterligne in vivo vaskulær spire formasjon, som er oppnås ved samhandling og innlemmelse mellom endothelial celler og pericytes. Sammenlignet med andre in vitro angiogenese analyser som reflekterer bare ECs-mediert angiogenese, denne co-kultur analysen systemet er mer representativt for flertrinns kaskade av fysiologiske angiogenese inkludert mobilnettet interaksjon, spirende, tube formasjon, og fartøy modning. Denne nyetablerte analysen systemet også ligner in vivo ekstracellulære mikromiljøet av seeding spheroids inn i type I kollagen gel. Vi foreslår at 3D co-kulturen spheroid angiogenese analysen systemet er pålitelig, repeterbar, lett målbare, og viktigst fysiologisk relevant.

Mens du utfører co-kulturen spheroid analysen, er det viktig å legge spheroids i gel med passende konsentrasjon av nøytralisert type I kollagen og FBS. Den beste endelige konsentrasjonen av nøytralisert type jeg kollagen er 1,5 mg/mL, og prosentandelen av FBS er 2,5%. I de foreløpige eksperimentene resulterte høyere konsentrasjoner av kollagen i stiv gel og hemmet kvaliteten og mengden av spirer som stammer fra spheroids. Mindre konsentrasjoner av kollagen ga myk og skjør gel som ikke kunne opprettholde integriteten til spheroids. Tilsvarende økte mengder FBS forårsaket plethoric spirende fra spheroids på basal nivå uavhengig av angiogenic faktor stimulering. Lavere FBS konsentrasjon førte til dårlige forhold av celler. For konsistente og reproduserbar resultater bør et riktig antall spheroid bygges inn (omtrent 50 spheroids/brønn). Mer enn 50 spheroids/brønn kan føre til nærhet til spheroids innenfor brønnen, som kan unormalt påvirke kvaliteten og mengden av spirer generert.

Det er viktig å opprettholde typen jeg kollagen i kjølt forhold under nøytralisering og miksing trinn med spheroid suspensjon fordi kollagen kan Clot ved romtemperatur, noe som resulterer i en uregelmessig matrise. Mens blande spheroid suspensjon med kollagen løsning, er det anbefalt å bruke 1 mL pipette spissen med 3-5 mm kutt på slutten for å gjøre bredt hull. Dette muliggjør enkel håndtering av den tyktflytende kollagen oppløsningen og beskytter spheroids mot brudd. Omrøring av platen etter embedding spheroid-suspendert kollagen løsning kunne forstyrre integriteten av gel og resultere i brudd som kan hemme normal spire generasjon.

I co-kulturen spheroid analysen bruker ECFCs og MSCs, 5:1 ratio bør opprettholdes. Bruk av et større antall MSCs årsaker sprer seg rundt spheroid på grunn av trekk fenotype av MSCs, som kan påvirke ideelle spire generasjon. Et mindre antall MSCs er utilstrekkelig for å stimulere ECFCs spirende og dekke spirer riktig. I tillegg er det viktig å sjekke celle forhold under vekst. Hvis det observeres dårlig spirende, anbefales det å bruke en annen sunn passasjer av cellene. For bedre utfall, bruk av ECFCs og MSCs på passasje mindre enn 10 anbefales sterkt.

Her presenterer vi en forbedret 3D angiogenese analysen system ved hjelp av co-kultur spheroids som tett fange in vivo angiogenese. Sammenlignet med 2D enkelt celle analysen systemer, denne co-kulturen spheroid analysen systemet reflektere mer trofast cellulære reaksjoner mellom to vaskulære celletyper for å danne rørformede strukturer i fysiologiske forhold. Men dette systemet forblir unyansert sammenlignet med den komplekse flertrinnsprosessen av in vivo angiogenese. Vaskulær generasjon in vivo oppstår vanligvis gjennom flere interaksjoner av ulike andre celletyper, inkludert epitelceller, fibroblaster, immunceller, og også rikelig ECM proteiner. Fremtidige anvendelser av dette nye systemet inkluderer innføring av andre celletyper og ECM til mer presist reflektere fysiologiske og/eller patologiske angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av et stipend (17172MFDS215) fra departementet for mat og narkotika sikkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), og Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2016R1A6A1A03007648).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
  3. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  4. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  5. Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
  6. Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
  7. Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
  8. Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
  9. Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
  10. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
  11. Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
  12. Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
  13. Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
  14. Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
  15. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  16. Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
  17. Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
  18. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
  19. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  20. Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
  21. Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
  22. Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
  23. Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
  24. Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
  25. Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
  26. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
  27. Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
  28. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  29. Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
  30. Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).

Tags

Utviklingsbiologi angiogenese co-kultur spheroid endothelial koloni forming celler Mesenchymal stamceller type I kollagen gel spirende bevacizumab
Tredimensjonale angiogenese analysen system bruker co-kultur Spheroids dannet av endothelial Colony forming celler og Mesenchymal stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H.,… More

Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. T. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter