Summary
현재 문서는 등칼로리 에 대한 자세한 프로토콜을 설명 2:1 간헐적 단식 보호하고 야생 형 및 ob / OB 마우스에서 비만 과 장애인 포도당 대사에 대해 치료.
Abstract
간헐적 단식 (IF), 주기적인 에너지 제한과 관련 된 식이 개입, 수많은 혜택을 제공 하 고 신진 대사 이상을 중화 간주 되었습니다. 지금까지 금식 및 수유 기간이 다양한 다양한 유형의 IF 모델이 문서화되었습니다. 그러나 이러한 모델 중 상당수는 시간 및 칼로리 제한 전략모두에서 다단계 기여를 포함하므로 결과를 해석하는 것은 어렵습니다. 예를 들어, 설치류 IF 처방으로 자주 사용되는 대체 금식 모델은 수유 를 저해 할 수 있으며,이 개입으로 인한 건강 상의 이점이 칼로리 제한 및 금식 재공급 주기를 통해 중재 될 가능성이 있음을 시사합니다. 최근에는 2:1 IF가 1일 간의 수유후2일로 구성된 IF가 전반적인 칼로리 섭취량의 감소 없이 식이요법으로 인한 비만 및 대사 개선을 예방할 수 있음을 성공적으로 입증했습니다. 여기에 제시된 것은 마우스에 있는 이 등칼로리 2:1 IF 내정간섭의 프로토콜이다. 또한 고파기와 같은 변경된 식습관이 있는 마우스 모델을 검사하는데 필요한 쌍-먹이(PF) 프로토콜이 기술되어 있다. 를 사용 하 여는 는 2:1 IF 처방, 그것은 isocaloric IF 감소 체중 증가에 이르게 입증, 향상 된 포도 당 항상성, 그리고 높은 에너지 지출. 따라서, 이러한 처방은 다양한 질병 상태에 대한 IF의 건강 영향을 조사하는 데 유용할 수 있다.
Introduction
현대 라이프 스타일은 더 긴 매일 음식 섭취 시간과 짧은 금식 기간과 연관1. 이것은 인간에서 보인 신진 대사 불이익을 가진 현재 글로벌 비만 전염병에 기여합니다. 금식은 인류 역사를 통해 실행되었습니다, 그 다양한 건강 혜택은 연장 된 수명을 포함, 감소 산화 손상, 최적화 된 에너지 항상성2,3. 금식을 연습 하는 여러 가지 방법 중, 주기적인 에너지 부족, 간헐적 단식 이라고 (IF), 널리 그것의 쉽고 간단한 처방으로 인해 일반 인구에 의해 실행 되는 인기 있는 식이 방법. 전임상 및 임상 모델의 최근 연구는 IF가 장기간의 금식 및 칼로리 제한에 필적하는 건강상의 이점을 제공할 수 있음을 입증하였으며, IF가 비만 및 대사질환에 대한 잠재적 치료 전략이 될 수 있음을시사2,3,4,5.
IF 처방은 금식 기간 및 빈도면에서 다릅니다. 대체 일 금식 (즉, 1 일 먹이/1 일 금식; 1:1 IF) 비만, 심혈 관 질환, 신경 퇴행성 질환 등에 그것의 유익한 건강 영향을 연구 하기 위해 설치류에서 가장 일반적으로 사용 되는 IF 처방되었습니다.2,3. 그러나, 이전 연구에서 와 같이6,7,그리고 더 기계적으로 우리의 에너지 섭취 량 분석에서 확인8,1:1 IF 결과 과소 공급 (~80%) 에너지 손실을 보상하기에 충분한 공급 시간이 부족하기 때문입니다. 이것은 1:1 IF에 의해 부여된 건강 이득이 열량 제한 또는 먹는 패턴의 수정에 의해 중재되는지 불분명합니다. 따라서, 새로운 IF 식이요법이 개발되어 여기에 도시되어, 2일 먹이/1일 금식(2:1 IF) 패턴으로 구성되며, 이는 마우스에게 음식 섭취량을 보상하기에 충분한 시간을 제공한다(~99%). 체중. 이들 마우스는 그 후 광고 리비텀(AL) 군과 비교된다. 이 식이요법은 야생형 마우스의 칼로리 감소가 없는 경우 등칼로리 IF의 효과를 검사할 수 있게 한다.
대조적으로, 변경된 공급 동작을 나타내는 마우스 모델에서 AL 공급은 2:1 IF의 효과를 비교하고 검사하는 적절한 제어 조건이 아닐 수 있습니다. 예를 들면, ob/ob 마우스 (비만에 대 한 일반적으로 사용 되는 유전 모델) 전시 hyperphagia 때문에 식욕과 포만 조절 leptin의 부족으로 인해, 그 2:1 IF 전시 ~20% AL 먹이와 ob/ob 쥐에 비해 감소 칼로리 섭취 량. 따라서, OB/ob 마우스에서 IF의 효과를 적절히 검사하고 비교하기 위해서는, 적절한 대조군으로서 쌍-공급 군을 채택할 필요가 있다.
전반적으로, 쌍 공급 제어의 사용을 포함하여 이소칼로리 2:1 IF를 수행하기 위한 포괄적인 프로토콜이 제공된다. 그것은 더 입증 그 등구경 2:1 IF 야생 형 및 ob/ob 마우스모두에서 고지방 다이어트 유도 비만 및/또는 대사 기능 장애로부터 마우스를 보호. 이 프로토콜은 신경 장애, 심혈관 질환 및 암을 포함한 다양한 병리학 적 조건에 대한 2:1 IF의 유익한 건강 영향을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
오타와 대학의 동물 관리 및 수의학 서비스 (ACVS)와 현상 유전체학 센터 (TCP)의 동물 관리 위원회의 모든 방법과 프로토콜은 캐나다 동물 관리 위원회의 표준을 준수합니다. 여기에 설명된 모든 절차는 기술적으로 능숙한 직원뿐만 아니라 기관 및 정부의 승인하에 수행되어야 합니다. 모든 마우스는 12h/12h 의 빛/암흑 주기(일반 하우징의 경우 21-22°C, 30%-60% 습도)와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 온도 및 습도 제어 실에서 표준 통풍 케이지에 보관되었습니다. 남성 C57BL/6J 및 ob/ob 마우스는 잭슨 연구소로부터 수득하였다.
1. 2:1 등칼로리 요법 IF 처방
- 엎드려 서 다이어트와 다이어트 유발 비만 마우스 모델에 대 한, 정상적인 다이어트를 준비 (17% 지방, ND) 또는 높은 지방 다이어트 (45% 지방, HFD).
참고: 60% HFD는 가혹한 규정식 유도한 비만을 유도하기 위하여 이용될 수 있습니다; 그러나, 음식 펠릿의 부드러움 으로 인해, 정확하게 매일 음식 섭취량을 측정하는 것은 상대적으로 어렵다. 자동화된 연속 측정 시스템은 다양한 유형의 식단에 대한 다기능성을 향상시킬 수 있습니다. - 체중 및 EchoMRI를 사용하여 7주에 각 마우스의 체중 및 체성분을 각각 측정하였다.
참고: 신체 구성 측정은 섹션 3을 참조하십시오. - 체중과 체성분 결과에 따라, 7주령의 남성 C57BL/6J 마우스를 2개의 그룹으로 무작위로 균등하게 나눕니다: 광고 리비텀(AL) 및 간헐적 단식(IF) 그룹.
- 케이지당 2~3마리의 생쥐를 놓고 식수에 무료로 접근할 수 있도록 합니다.
참고: 케이지 당 마우스의 수는 음식 섭취 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 연구 기간 동안 모든 그룹에서 케이지당 동일한 수의 마우스를 유지하는 것이 좋습니다. - IF 요법을 시작하기 전에 새로운 케이지 환경과 식단에 적응1주일 을 제공합니다.
- 금식 기간: 12:00 PM에 신선한 침구가 있는 깨끗한 케이지로 마우스를 옮기. AL 그룹에 계량 된 양의 음식을 제공하면서 IF 그룹에 대한 음식을 추가하지 마십시오.
참고: 각 금식 주기에 대해 AL 및 IF 그룹 모두에 대해 케이지를 변경하여 두 그룹이 동일한 처리 시간에 노출되도록 하는 것이 중요합니다. - 24 시간 후, AL 케이지에서 두 그룹 및 남은 음식 모두에서 마우스의 무게를 측정합니다.
참고: 쥐가 종종 호퍼에서 작은 펠릿 이나 음식의 조각을 제거 하 고 둥지 사이트 근처 그들을 유지 로, 특히 HFD를 사용 하는 경우, 식품 호퍼와 케이지의 바닥에 음식 부스러기의 무게를 포함 해야 합니다. 각 2:1 주기 (3 일)의 끝에 마우스 당 평균 에너지 섭취량은 약 35 kcal, 정상적인 식단에 대 한 ~10 g에 해당 (3.3 kcal/g) 그리고 HFD에 대 한 ~7 g (4.73 kcal/g). - 수유 기간: AL 및 IF 그룹 모두에 대해 12:00 PM에 계량된 양의 음식을 제공합니다.
- 음식을 제공하는 48 시간 후, 남은 음식과 마우스의 무게를 측정한다.
- 연구 기간 동안 1.6-1.10 단계를 반복합니다(예: 16주).
2. 쌍 공급 (PF) 대조군
참고: 마우스 모델(예: ob/ob 마우스에서의 하이퍼파지아)에서 변경된 수유 거동이 관찰되는 IF 실험의 경우, IF에 대한 적절한 칼로리 독립적 비교를 위한 대조군으로서 쌍-공급 그룹이 필요하다.
- PF 대조군의 경우, IF 군에서 소비하는 동일한 양의 식품이 PF 군에 제공되도록 실험 스케줄을 엇갈린다(도2).
- IF 그룹이 2일 간 재공급 기간 동안 섭취한 음식의 양을 측정합니다.
- IF 그룹에서 소비된 음식의 양을 3개의 비율로 균등하게 나누고 12:00 PM에 PF 그룹에 매일 제공합니다.
참고: 매일 동일한 양의 음식을 제공하는 것이 중요합니다. hyperphagia를 가진 마우스의 경우에, 쌍 공급 마우스는 한 번에 그들의 자발적인 소비 보다는 더 적은 음식의 양을 함께 제공 되는 경우, 그들은 가능성이 모든 제공 된 음식을 소비 하 고 효과적으로 금식 될 것 이다. 이 다음 IF 처리 된 쥐에 적절 한 비교를 방지 하 고 결과 혼동 수 있습니다. - 연구 기간 동안 2.1-2.3 단계를 반복합니다.
3. 신체 조성 분석
참고: 장기 IF는 마우스의 체중에 영향을 미치기 때문에, 체성분은 적절한 주기(예를 들어, 3주기 또는 4주기마다)에서 측정될 수 있으며, 체성분 분석기를 사용하여 살아있는 비마취 마우스에서 지방과 순수 질량을 정량화할 수 있다.
- 신체 구성 분석기를 켭니다.
참고: 프로그램을 시작하기 전에 기계를 2-3시간 동안 켜두어 따뜻하게 하십시오. - 신체 구성 분석기에서 시스템 테스트를 실행하여 측정 정확도를 테스트합니다. 필요한 경우 카놀라 유 및 물 샘플을 사용하여 시스템을 교정합니다.
- 각 마우스의 체중을 측정합니다.
- 작은 동물 실린드릭 홀더에 마우스를 놓습니다.
- 측정 중에 마우스의 물리적 움직임을 제한하기 위해 구분기를 삽입하고 홀더를 본체 조성 분석기에 넣습니다.
- 스캔 프로그램을 실행합니다.
참고: 분석하는 데 약 90~120s가 걸립니다. - 측정 후 장비에서 홀더를 제거하고 마우스를 케이지로 다시 가져옵니다.
참고: 더 자세한 프로토콜은 이전 발행물9에서찾을 수 있습니다.
4. 포도당과 인슐린 내성 시험
- 포도당 내성 검사(GTT)의 경우, 금식을 하기 전에 각 마우스의 체중과 체성분을 측정하고 꼬리를 영구 마커로 표시하여 쉽고 빠른 색인을 합니다.
- 하룻밤 금식을 위해 7:00 PM에 음식없이 새장에 마우스를 놓습니다.
참고: 야간 단식은 표준 프로토콜이지만, 마우스 생리학(예를 들어, 장기간 단식 후 포도당 이용률 증가10,11),짧은 단식(~6h)으로 인해 ITT에 대해 설명된 바와 같이 사용될 수 있다. - 14-16 h (다음 날 아침 9:00 AM)를 금식 한 후 각 마우스의 체중과 신체 구성을 측정하고 체중에 따라 포도당 복용량의 양을 계산합니다.
참고: 비만 마우스에서 포도당 과다증의 과대 평가를 피하기 위해, 체성분 분석으로부터 얻은 린 질량은 포도당 투여량12,13을계산하는데 사용될 수 있다. - 각 마우스에 대해 깨끗한 수술 용 가위를 사용하여 꼬리 끝 (0.5-1.0 mm)을 자른다. 혈액의 첫 번째 방울을 닦아 후, 꼬리에서 혈액의 신선한 방울을 그리고 글루컴터와 기준선 단식 혈액 포도당 수준을 측정합니다.
참고: GTT 또는 ITT 동안 모든 혈당 측정에 추가 적인 꼬리 절단이 필요하지 않습니다. 상처는 거즈로 마모시켜 혈액 한 방울을 뽑을 수 있습니다. - 복강 내 (즉) 포도당의 주입 (체중의 1 mg/g)을 대상 마우스.
참고: 실험의 목적에 기초하여 (예를들어, 인크레틴 효과를 검사), 포도당의 경구 투여는 경구 관장에 의해 수행 될 수있다. 경구 GTT (OGTT)에 대한 프로토콜은 다른 연구14에서찾을 수 있습니다. - 0, 5, 15, 30, 60 및 120 분 후 포도당 주사에서 꼬리에서 혈액 포도당을 측정합니다.
- GTT를 마친 후 충분한 양의 음식을 제공하십시오.
- 인슐린 내성 검사 (ITT)의 경우 9 :00 AM에 음식을 제거하십시오.
참고: GTT와 ITT는 혈당 수치를 높이고 생리학을 변경할 수 있는 쥐에 대한 스트레스 유발 경험이기 때문에 GTT 실험 후 적어도 2-3일 간의 회복을 제공한 후 ITT를 수행하는 것이 좋습니다. - 6 시간 (3:00 PM)에 대한 단식 후, 단계 4.4에 설명 된 대로 꼬리에서 기저 선혈당을 측정합니다.
- 대상 마우스는 인슐린의 i.p. 주입 (0.65 몸 무게의 mU/g).
- 0, 15, 30, 60, 90 및 120 분 후 인슐린 주사에서 꼬리에서 혈액 포도당을 측정합니다.
- ITT를 마친 후 충분한 양의 음식을 제공하십시오.
5. 간접 열량학
참고: IF 처리된 마우스의 에너지 대사는 IF의 단일 주기에 걸쳐 간접 열량계를 통해 추가로 평가될 수 있다. 이것은 산소 소비(VO2),이산화탄소 생산 (VCO2),호흡 교환 비율 (RER) 및 열 (kcal/h)을 측정합니다.
- 실험을 실행하기 전에 간접 열량계 시스템의 전원을 2시간 이상 켭니다.
참고: 이 시스템 예열은 정확한 측정을 위해 중요합니다. - 깨끗한 침구로 케이지를 준비하고, 물병을 채우고, 미리 계량된 양의 차우를 식품 호퍼에 추가합니다.
- 건조기와 라임 소다의 상태를 확인합니다. 건조기의 색상 표시등이 분홍색으로 나타나면 건조기의 수분을 많이 흡수했음을 나타내며 신선한 건조기로 교체하거나 위에 얹을 필요가 있습니다.
- 특정 조성물을 사용하여 시스템을 교정합니다(0.5%CO2,20.5%O2).
- VO2 및 VCO2 데이터를 정규화하는 데 사용되는 각 마우스의 체중과 신체 구성을 측정합니다.
- 케이지당 마우스 한 개를 가볍게 놓습니다.
- 신진 대사 케이지를 조립하고 온도 제어 환경 챔버에 넣고 가스 라인 및 활동 센서 케이블에 연결합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 적절한 실험 매개 변수를 추가하여 실험 프로파일을 설정한 후 측정을 위해 프로그램을 실행합니다. 첫날 측정의 목적은 적응 기간을 제공하고 기준 에너지 대사를 측정하는 것입니다.
- 다음날 오후 12:00에, 마우스를 케이지의 호퍼 및 바닥에서 음식과 부스러기를 제거하여 24 시간 의 금식을 실시한다. 필요한 경우 깨끗한 침구로 교체하십시오.
- 24시간 후, 재수유 기간 동안 미리 계량된 양의 차우를 식품 호퍼에 추가합니다.
- 다음 48시간 동안 계속 측정하십시오.
- 측정을 완료한 후 프로그램을 종료하고 마우스를 원래 케이지로 되돌리십시오. 음식 섭취량을 검사하기 위해 남은 음식의 양을 측정합니다.
- 간접 열량 측정에 대한 자세한 프로토콜은 이전 연구9에서찾을 수 있습니다.
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Representative Results
그림 1은 24시간 단식 후의 수유 분석과 1:1 과 2:1 간헐적 단식 간의 비교를 보여줍니다. 24시간 의 단식 기간은 체중의 ~10% 감소를 초래하였고, 이는 2일 간의 재수유 후 완전히 회복되었다(도1A). 24시간 의 단식 기간은 후속 2일 동안 과혈증을유도하였다(도 1B). 그럼에도 불구하고, 1:1 대체 금식과 2:1 간헐적 금식 사이의 에너지 섭취량을 비교한 결과, 1:1 IF에서 1일 의 재급식 기간이 충분하지 않은 것으로 나타났습니다(~80%). AL 조건에 비해 금식에 의한 열량 손실을보상한다(그림 1C). 한편, 2:1 IF에서 2일 간 재공급 기간 동안 에너지 섭취량의 99%를 완전히 보상하였다. 이 식이요법은 열량 섭취량 차이와 무관한 이소칼로리 IF의 효과를 검사할 수 있게 합니다.
도 2는 이소칼로리 2:1 IF 및 PF 요법에 대한 회로도 타임라인을 도시한다. 칼로리 섭취량의 차이를 최소화하기 위해, 대체 일 금식6,7에서만든 관찰,이 프로토콜은 야생 형 마우스에서 이소 칼로리 IF의 건강 효과의 검사를 가능하게 2 일 먹이 주기 와 1 일 금식 기간 (2:1IF)8로구성된 새로운 IF 처방을 확립했다. 그러나, 고파기 거동을 나타낸 ob/ob 마우스에서, 2:1 IF-처리된 OB/ob 마우스는 ob/ob AL 마우스15에비해 21% 칼로리 섭취 감소를 보였다. 이것은 적당한 열량 독립적인 비교를 방지하기 때문에, IF 처리된 ob/ob 마우스와 동일한 열량 섭취량을 유지하는 PF 대조군이 사용되었다. 간략하게, 2:1 에서 먹이의 2 일 동안 소비된 음식의 총량은 마우스를 3개의 일일 양으로 동등하게 나누어 진 다음 PF 단에 제공하였다.
2:1 IF의 대사 결과에 대한 포괄적인 개요를 위해, 우리는 AL의 효과 비교, IF, 그리고 몸 무게에 PF, 야생 형의 음식 섭취량과 신체 구성및 정상 식단에서 ob /ob 마우스 (ND) 및 HFD. AL에 비해, IF 치료는 음식 섭취량에 유의한 차이없이 ND 공급 및 HFD 공급 WT 마우스에서 낮은 체중 증가를 주도(그림 3A,B). 체성분 분석은 야생형 마우스에서 살상량의 변화 없이 지방량을 구체적으로 감소시킨 것으로나타났다(도 3C). IF 프로그램의 16주 동안 축적된 에너지 섭취량이 약간 낮더라도 IF 동물의 체중 증가가 감소할 수 있습니다. 그러나, 한쌍 먹이식이요법을 실험한 결과 IF에 의한 체중 증가가 에너지 섭취량의 변화때문이 아님을 확인하였다(도3D,E). 야생형 동물과 달리, IF(Ob-IF)를 받은 ob/ob 마우스의 체중은 Ob-AL 마우스의 체중보다 낮았다(그림3G). 이것은 ob/ob 마우스의 hyperphagia (과도한 먹기) 때문이, 약간 더 높은 지도 (21%) AL 마우스에서 음식 섭취량을 IF 처리 된 동물과 비교(그림 3H). 따라서, 칼로리 독립적 인 방식으로 IF의 대사 효과를 구체적으로 조사하기 위해, 쌍 공급 대조군이 채택되었다. 그러나, 야생형 마우스8과는 달리, Ob-PF 마우스는 체중 및체성분에서 Ob-IF 마우스와 비교하여 구별할 수 없었다(도3I). 이러한 결과는 렙틴이 쥐의 이소칼로리 IF 매개 체중 감소에 연루될 가능성이 있음을 시사한다.
이소칼로리 IF에 의해 부여 된 주요 신진 대사 혜택은 개선 된 포도당 항상성이다. 도 4A, B, C, D,HFD-IF 마우스에 도시된 바와 같이 포도당 항상성에서 유의한 개선을 나타내었다. GTT는 혈액 포도당이 IF 처리한 마우스에서 더 빨리 삭제된다는 것을 보여주었습니다, ITT는 HFD-IF 마우스에 있는 더 높은 인슐린 감도를, HFD-AL 또는 HFD-PF 마우스에 비교된 동안, 밝혔습니다. 예기치 않게, IF 매개 체중 감소의 실패에도 불구하고, Ob-IF 동물은 OB-PF 마우스(그림 4E)에비해 GTT에서 더 작은 포도당 소풍으로 현저하게 개선된 포도당 처리를 보였고, 반면 인슐린 감도는 Ob-IF와 Ob-PF 마우스 사이에서 구별할 수 없었다(그림4F). 이러한 Ob-IF 마우스에서의 개선된 포도당 항상성은 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 및 포도당 자극 인슐린 분비의 혈장 수준에서 증가에 의해 매개될 가능성이 있다(데이터는 도시되지 않음)15. 전반적으로, 이 2:1 IF 프로토콜과 적절한 칼로리 독립적 PF 대조군을 사용하여, 야생형 및 OB/OB 마우스에서 이소칼로리 IF의 대사 이점을 보여주었다.
야생형 마우스에서 IF의 대사 효과 중 하나는 총O2 소비량이 높고, 에너지 소비를 추정하는 데 사용된다(도5A,B). O2 소비에서 이러한 고도는 AL 마우스에 비해 IF 마우스에서 수유 기간 동안에만 발견되었지만, 금식 기간은 아니었다. 증가된 에너지 지출은 백색 지방 조직의 브라우닝 및 갈색 지방 조직(데이터 미도시)의 활성화와 같은 지방 열발생에 의해 크게 매개되었다(자료)8,16. IF-매개 지방 열발생은 아마도 IF를 실시한 야생형 마우스가 AL 마우스에 비해 음식 섭취량의 차이없이 체중 증가를 감소시키는 방법을 설명할 것입니다. 한편, IF는 OB/ob 마우스에서O2 소비를 증가시키지 못했으며(그림5C-D),심지어 금식 기간 동안 에너지 지출의 감소를 초래하였다. 일관되게, IF-유도 지방 열발생은 ob/ob 마우스에서 완전히 폐지되었다(데이터는 도시되지 않음). 이 데이터는 다른 유전및 환경 배경을 가진 개별을 위해 다르게 작동할 수 있기 때문에 IF의 가능한 제한을 건의합니다.
그림 1: 24시간 단식 후 수유 분석 및 1:1과 2:1 IF 간의 비교. (A)24시간 단식 전후에 마우스의 일일 체중 변화 (n = 10). (B)24시간 단식 전후의 일일 에너지 섭취량(n = 5케이지; 케이지당 마우스 2개). (C)대체 금식(즉, 1 일 먹이 / 1 일 금식, 1 :1 IF) 및 2 : 1 간헐적 금식 (즉, 2 일 먹이 / 1 일 금식) 사이의 에너지 섭취량을 비교합니다. 1:1 IF 처방에서, 음식 섭취량의 ~80%만이 2일 간 음식 섭취량에 비해 1일 간 재수유하는 동안 보상되었다. 다른 한편으로는, 99% 에너지 섭취는 2 일 의 재공급이 주어졌을 때 달성되었다, 그에 비해 3 공급의 일. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 이 그림은 김외8의허락을 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 등칼로리 2:1 IF 처방의 개략적 그림. PF 대조군을 위해, IF 처리된 마우스에 의해 공급의 2 일 동안 소비된 음식의 양은 3개의 동등한 부분으로 분할되고, 다음 주기 도중 PF 마우스에 매일 제공됩니다. AL = 광고 리니텀; PF = 쌍 공급. 이 그림의 일부는 김 외8의허가를 받아 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: AL, IF 및 PF 효과의 체중, 음식 섭취량 및 야생 형 및 ob/ob 마우스 간의 신체 구성에 대한 비교. (A, B, C) 정상 식이요법(ND) 또는 고지방 식이요법(HFD)에서 AL 또는 IF 처리야생형 마우스의 체중, 음식 섭취량 및 체성분은 IF 요법의 16주 동안. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다(ND-AL: n= 7; ND-IF: n = 8; HFD-AL: n = 7; 및 HFD-IF: n = 8); 학생 - 뉴먼 - 쿨스 포스트 혹 분석과 단방향 또는 양방향 ANOVA; ** p < 0.01 대. HFD-AL.(D,E,F)IF 식이요법의 12주 동안 고지방 식이요법(HFD)을 섭취한 쥐와 PF의 체중, 음식 섭취량 및 체성분을 섭취하였다. (PF: n = 6 및 IF: n = 6); 두 꼬리 가미 되지 않은 학생의 t-테스트; * p < 0.05 대. HFD-PF; NS = 중요하지 않습니다. (G, H,I) AL, PF, 또는 정상 차우로 공급된 IF 처리된 ob/ob 마우스에서의 체중, 음식 섭취량 및 체성분(Ob-AL: n=4; Ob-PF: n = 7; Ob-IF: n = 6); Ob-AL 대. Ob-PF: *p< 0.05; Ob-AL 대. Ob-IF: *p< 0.05; Ob-PF 대. Ob-IF. 패널 A-F는 김등8의 허가를 받아재현되었다. 패널 G-I는 김 외15의허가를 받아 복제되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 야생형 및 OB/OB 마우스 모두에서 IF에 의한 포도당 항상성 개선. (A, B) 복강 내 GTT 및 ITT를 HFD-AL 및 HFD-IF 야생형 마우스에서 IF 요법의 16주 후에. 인세트는 곡선 아래 영역을 보여줍니다(AUC); *p< 0.05 대 HFD-AL.(C,D)GTT 및 ITT를 HFD-PF에서 IF 처방의 12주 후 HFD-IF 야생형 마우스와 비교하였다. 인세트는 AUC를 보여줍니다. *p< 0.05 대 HFD-PF.(E,F)GTT 및 ITT는 IF 요법의 16주 후에 Ob-PF 마우스와 비교하였다. 인세트는 AUC (*p & 0.05 대.05)를 보여줍니다. Ob-PF)를 참조하십시오. 패널 A-D는 김등8의 허가를 받아재현되었다. 패널 E와 F는 김외15의허가를 받아 복제되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: IF 처리된 야생형 및 OB/OB 마우스의 에너지 지출 분석. (A)야생형 마우스에서 2:1 IF의 1주기 동안O2 소비량의 흔적(즉, 1일 금식 후 2일간 먹이주기). (B)금식, 수유 중 시간당 평균O2 소비량, 1회 주기 2:1 IF. 데이터는 평균 ± SEM(HFD-AL: n= 6; 및 HFD-IF: n=12);; * p < 0.05 대. HFD-AL.(C)O2 소비 추적 의 1 주기 동안 ob/ob 마우스 2:1 IF. (D)금식, 수유 및 1주기 2:1 IF(Ob-PF: n = 7) 동안 시간당 평균O2 소비량; Ob-IF: n = 6); * p < 0.05 대. Ob-PF. 패널 B는 김외8의허가를 받아 복제되었다. 패널 C와 D는 김외15의허가를 받아 복제되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IF가 인간과 동물 모두에서 다양한 질병에 유익한 건강 효과를 제공한다는 것을 잘 문서화되어 있다8,15, 16,17,18,19. 그것의 기본 메커니즘, autophagy 및 창 자 미생물 등, 최근 해명 되었습니다. 제시된 프로토콜은 식이 유발 비만 및 관련 대사 기능 장애에 대한 IF의 칼로리 독립적 인 신진 대사 혜택을 조사하기 위한 마우스의 등칼로리 2:1 IF 처방을 설명합니다. 대체 일 금식 (1:1 IF) 프로토콜과는 달리 전체 칼로리 섭취량의 감소를초래하는 6,7,2:1 IF 요법에서 재수유1일을 더 제공하면 야생 형 마우스에서 등칼로리 상태를 유지 보수 할 수 있습니다.
또한, 1:1 IF에 비해, 2:1 IF 처방은 마우스20에서 가능한 공복 매개 스트레스 또는 토퍼를 감소시킬 수 있으며 또한 대중적인 식이 방법인 5:2 다이어트2와비교할 수 있다. 그 효과 테스트 되지 않은, 처방은 다시 공급의 추가 일을 제공 하 여 수정될 수 있다 (예를 들어, 3:1 또는 4:1 IF). 더욱이, 제시된 이 프로토콜은 시간 제한 공급(TRF)이라고 불리는 시간별 규모로 용이하게 조절될 수 있으며, 이때 활성 단계21동안 식품에 대한 접근이 하루 8시간으로 제한되며, 이는 등칼로리 식이요법을 달성하고 HFD 유발 비만 및 당뇨병19,21,22에대한 대사 적 이점을 제공하는 것으로 알려져 있다.
수유 분석(도1B)에나타낸 바와 같이, 24시간 후 의 공복 직후의 고파기 거동은 야생형 마우스에서 서서히 감소하며, 이는 등칼로리 IF를 가능하게 한다. 그러나, 이러한 등칼로리 상태는 ob/ob 마우스에서 달성될 수 없으며, 렙틴 신호-매개 포만및 에너지 대사가 부족하기 때문에, 지속적인 고파기 표현형23,24로이어진다. 따라서 IF 실험을 수행하기 전에 관심 있는 마우스 모델의 공급 동작을 검사하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 설명된 바와 같이, 쌍-공급 군을 이프로토콜에 설명한 바와 같이, 고파성 마우스 모델(예를 들어, ob/ob, db/db, Sim1+/-, MC4R-/-)24,25,26을사용하여 IF의 효과를 검사하기 위해, 등소열성 실험 대조군으로서 쌍 공급 군의 고용은 적절한 비교를 하기 위해 중요하다. 또한 저산소 표현형(예를 들어, 멜라닌 함유 호르몬 KO 마우스)으로 마우스 모델을 테스트할 때 신중한 계획이필요하다(27.
IF 연구를 위해 고려해야 할 중요한 요소는 마우스의 다양한 생리적 및 행동 적 매개 변수에 영향을 미치는 하우징 온도입니다. 특히, 감기 에노출(4-6°C)은 핵심 체온28을유지하기 위해 에너지 섭취량을 크게 증가시킨다. 대조적으로, 열 이득이 열 손실에 의해 균형되는 열 중립 조건 (30 °C)에서, 음식 소비의 감소는 현저하게감소8. 신진 대사 결과에 관하여, 차가운 노출은 열중성 조건에 의해 방해되는 지방 열발생을 유도합니다. 따라서 하우징 온도는 IF의 대사 표현형과 적절한 공급:공복비율에 영향을 주어 이소칼로리 IF를 달성할 것으로 예상된다.
실제로, 이소칼로리 2:1 IF가 열중성 조건에서 달성될 수 있다는 것이 입증되었으며, IF와 AL 군 사이의 음식 섭취량의 차이 없이 식이 유발 비만 및 대사 기능 장애에서 향상된 대사 건강을 이끌어 내고8. 그러나, 등칼로리 IF는 차가운 노출하에 있는 마우스가 IF 군에서 과소 공급으로 이끌어 내는 고파 현상형을 보여주기 때문에 차가운 온도에서 2:1 비율로 달성되지 않을 수 있습니다. 감기 노출 및 IF 디스플레이 비교 신진 대사 결과 및 메커니즘 (즉, 지방 열 발생 및 향상 된 포도 당 항상성) 비만 싸움을 하는 데 도움이 있기 때문에, 신진 대사 영향을 극대화 하기 위해이 두 가지 개입을 결합에 관심이 있다. 따라서 이를 적절히 테스트하려면 IF 실험을 실행하기 전에 수유 분석을 수행하고 차가운 노출 하에서 쌍 수유 대조군을 활용하는 것이 좋습니다.
잠재적으로 IF 연구의 결과에 영향을 미칠 수 있는 그밖 요인은 주택 조밀도를 포함합니다. 이전 연구와 유사, 더 조밀 하 게 수용 된 쥐에서 감소 식품 소비를 보여 주었다29,5의 케이지에서 마우스 2의 케이지에서 보다 훨씬 적은 음식을 소비 (게시 되지 않은 결과). 또한, 하우징 밀도가 주변 온도에 유의하게 영향을 미치는 것으로 입증되었으며, 케이지 하우징 5마리의 마우스 내부의 온도는 1~2마리의마우스(30)를수용하는 것보다 1-2°C 더 높다. 이 연구는 주택 밀도가 음식 섭취량에 크게 영향을 미치지 않았다는 결론을 내렸지만 (5 주 동안 검사), 12-16 주 지속되는 IF 연구에서, 주택 밀도에 의해 영향을받는 케이지 내부의 온도는 여전히 음식 섭취와 에너지 대사에 영향을 미칠 수 있습니다. 함께, 케이지에 보관 된 마우스의 동일한 수를 유지하고 연구의 과정을 통해 케이지 당 수를 변경을 최소화하는 것이 중요합니다.
요약하면, 이 보고서는 마우스에서 등칼로리 2:1 IF를 테스트하기 위한 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 현재 연구는 규정식 유도한 비만 및 신진 대사 역기능에 있는 IF의 신진 대사 이득에 집중되더라도, 심장 혈관과 같은 그밖 조건에 대하여 이소칼로리 IF의 보호 그리고 치료 효력을 조사하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다 및 신경 질환.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
K.-H.K는 캐나다 그랜트 인 에이드 (G-18-0022213), J. P. Bickell 재단 및 오타와 심장 연구소 창업 기금의 심장 과 뇌졸중 재단의 지원을 받았습니다. H.-K.S.는 캐나다 보건연구원(PJT-162083), 르우벤과 헬렌 데니스 학자, 선라이프 파이낸셜 뉴 조사관상을 통해 당뇨병 연구 센터(BBDC) 및 자연과학의 보조금을 지원받았습니다. (RGPIN-2016-06610)의 공학 연구 위원회 (NSERC) R.Y.K.는 오타와 대학교 심장학 연구 인다우먼트 기금의 펠로우십을 통해 지원되었습니다. J.H.L.은 NSERC 박사 장학금과 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받았습니다. Y.O.는 UOHI 엔다우먼트 대학원 상과 엘리자베스 2세 여왕 과학 기술 장학금의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Indirect calorimeter | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | For GTT |
| EchoMRI 3-in-1 | EchoMRI | EchoMRI 3-in-1 | Body composition analysis |
| Glucometer and strips | Bayer | Contour NEXT | These are for GTT and ITT experiments |
| High Fat Diet (45% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12451 | 3.3 Kcal/g |
| High Fat Diet (60% Kcal% fat) | Research Diets Inc. | #D12452 | 4.73 Kcal/g |
| Insulin | El Lilly | Humulin R | For ITT |
| Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J | The Jackson Laboratory | #000632 | Ob/Ob mouse |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | #000664 | |
| Normal chow (17% Kcal% fat) | Harlan | #2918 | |
| Scale | Mettler Toledo | Body weight and food intake measurement |
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