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Bioengineering

एक Microfluidic चिप के साथ एक निर्धारणात्मक मैनर में एकल सेल आधारित सह संस्कृति की स्थापना

Published: September 27, 2019 doi: 10.3791/60202
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University, 3National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes

Summary

यह रिपोर्ट एकल कोशिका संस्कृति प्रयोग स्थापित करने के लिए एक माइक्रोफ्लूइड चिप-आधारित विधि का वर्णन करती है जिसमें कई एकल कोशिकाओं के उच्च दक्षता युग्मन और सूक्ष्म विश्लेषण प्राप्त किए जा सकते हैं।

Abstract

सेल सह संस्कृति परख व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार के बीच सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए बेहतर कैंसर सहित रोगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके अत्यधिक विषम कोशिका आबादी में अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रियाओं के जटिल तंत्र को स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिका उपजनसंख्या की विषमता औसत मूल्यों से अस्पष्ट है; पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग केवल जनसंख्या संकेत का वर्णन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, पारंपरिक एकल सेल प्रयोगात्मक तरीकों क्योंकि Poison वितरण के सेल हेरफेर में कम दक्षता है. Microfabricated उपकरणों एकल सेल अध्ययन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है क्योंकि वे सही उच्च throughput पर एकल कोशिकाओं में हेरफेर कर सकते हैं और नमूना और अभिकर्मक खपत को कम कर सकते हैं. यहाँ, हम अवधारणा और कई एकल सेल सह संस्कृति के लिए एक microfluidic चिप के आवेदन का वर्णन. चिप कुशलतापूर्वक एक संस्कृति कक्ष में एकल कोशिकाओं के कई प्रकार पर कब्जा कर सकते हैं ($46%) और एकल-सेल स्तर पर सेल-सेल इंटरैक्शन के तहत कोशिकाओं के व्यवहार (उदा., माइग्रेशन, प्रसार, आदि) का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त संस्कृति स्थान उपयोगी है। लसीका endothelial कोशिकाओं और मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा जीने के लिए कई एकल सेल बातचीत अध्ययन के लिए microfluidic मंच पर एक एकल सेल सह संस्कृति प्रयोग करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

Introduction

एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के कुशल कब्जा और पर्याप्त संस्कृति स्थान प्रदान एकल कोशिकाओं के कई प्रकार के एकल सह संस्कृति प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं1. कमजोर पड़ने को सीमित करना आवश्यक उपकरणों की कम लागत के कारण, ऐसे प्रयोगों के लिए एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, Poison वितरण सीमा के कारण, अधिकतम एकल सेल अधिग्रहण संभावना केवल 37% है, प्रयोगात्मक आपरेशन कठिन और समय लेने वाली2बना रही है. इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर उच्च कुशलता से एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए Poison वितरण सीमा को दूर कर सकते हैं3. तथापि, महंगे इंस्थाइनेशन और अनुरक्षण लागत के कारण एफएसीएस कुछ प्रयोगशालाओं तक सुलभ नहीं हो सकता है। माइक्रोफेब्रिडेभित उपकरणों को हाल ही में एकल सेल ट्रैपिंग4,सिंगल सेल युग्मन5,और एकल सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है। इन उपकरणों को सही एकल कोशिकाओं में हेरफेर करने की क्षमता के आधार पर फायदेमंद होते हैं6,उच्च throughput प्रयोगों प्रदर्शन, या नमूना और अभिकर्मक खपत को कम. हालांकि, वर्तमान microfluidic उपकरणों के साथ कई सेल प्रकार के साथ एकल सेल सह संस्कृति प्रयोगों प्रदर्शन अभी भी Poisson वितरण1,7,8, या की अक्षमता की सीमा के कारण चुनौतीपूर्ण है उपकरणों एकल कोशिकाओंकेदो से अधिक प्रकार पर कब्जा करने के लिए 4,5,6,9,10.

उदाहरण के लिए, योन एट अल. सेल सेल बातचीत अध्ययन11के लिए एक microfluidic डिवाइस की सूचना दी. यह डिवाइस कोशिकाओं को एक कक्ष में युग्मित करने के लिए गुणनात्मक विधि का उपयोग करता है. हालांकि, यह केवल डिवाइस संरचना में ज्यामितीय प्रतिबंधों के कारण दो अलग-अलग सेल प्रकारों की युग्मन प्राप्त कर सकता है। ली एट अल से एक और रिपोर्ट पर कब्जा करने और एकल कोशिकाओं12जोड़ी के लिए एक नियतात्मक विधि का प्रदर्शन किया. इस डिवाइस नियतात्मक विधि से बाँधना दक्षता बढ़ जाती है, लेकिन यह लंबे समय तक आपरेशन कोशिकाओं जोड़ी के लिए आवश्यक समय तक सीमित है. विशेष रूप से, दूसरा सेल कैप्चर केवल 24 ज के बाद सतह से जुड़ा हुआ है के बाद किया जा सकता है. झाओ एट अल. एक एकल सेल13के दो प्रकार पर कब्जा करने के लिए एक छोटी बूंद आधारित microfluidic डिवाइस की सूचना दी। हम यह पाया जा सकता है कि छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस अभी भी पॉइसन वितरण तक सीमित है और केवल गैर-अनुलग्न कोशिकाओं पर उपयोग किया जा सकता है, और खेती की प्रक्रिया के दौरान संस्कृति समाधान को बदलना संभव नहीं है।

पहले, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक "हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप" विकसित की है जो नियतात्मक हाइड्रोडायनामिक बलों का उपयोग संस्कृति कक्ष में एकल-सेल के कई प्रकार ों पर कब्जा करने के लिए करता है और बाद में सेल सह-संस्कृति प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन कर सकता है व्यक्तिगत सेल प्रवास व्यवहार के तहत सेल सेल बातचीत14| हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप में इकाइयों के एक सरणीवाले ससेट शामिल होते हैं जिनमें प्रत्येक में सर्पाकार उप-पास चैनल, एक कैप्चर-साइट, और एक संस्कृति कक्ष होता है। सर्पिन बाइ-पास चैनल और संस्कृति कक्ष के बीच प्रवाह प्रतिरोध में अंतर का उपयोग करके, और एक विशेष रूप से डिजाइन आपरेशन प्रक्रिया, एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार बार बार संस्कृति कक्ष में कब्जा कर लिया जा सकता है. विशेष रूप से, संस्कृति कक्ष के पर्याप्त स्थान न केवल सेल पर कब्जा करने के दौरान बाहर निकाल दिया जा रहा से सेल को रोका जा सकता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं के प्रसार के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करते हैं, proliferate और माइग्रेट, लाइव एकल सेल बातचीत के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. इस आलेख में, हम इस डिवाइस और विस्तृत प्रोटोकॉल चरणों के उत्पादन पर ध्यान केंद्रित।

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Protocol

1. नरम लिथोग्राफी द्वारा एक वेफर मोल्ड का निर्माण

नोट: मास्क पैटर्न डेटा हमारे पिछले प्रकाशन14में उपलब्ध है।

  1. 15 मिनट के लिए एक 120 डिग्री सेल्सियस ओवन में एक 4 इंच सिलिकॉन वेफर निर्जलीकरण।
  2. स्पिन कोट 4 जी SU-8 2 नकारात्मक photoresist पर एक 4-इंच सिलिकॉन वेफर पर 1,000 आरपीएम के लिए 30 s के लिए एक 5 डिग्री मोटी परत बनाने के लिए (#1 परत).
  3. नरम सेंकना परत 1 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस hotplate पर #1 और फिर 3 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस hotplate के लिए #1 परत हस्तांतरण।
  4. कमरे के तापमान के लिए #1 कूल परत, अर्द्ध स्वचालित मुखौटा aligner के धारक पर जगह है, और क्रोम चढ़ाया photomask (कैप्चर साइट परत) #1 परत के साथ संरेखित करें।
  5. 150 mJ/cm2की एक खुराक पर 365 एनएम यूवी प्रकाश के साथ #1 परत का पर्दाफाश.
  6. 1 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर संरेखण और पोस्ट-बेक से #1 परत निकालें। स्थानांतरण परत 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर #1।
  7. कमरे के तापमान #1 कूल परत। एक प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमेथिल ईथर ऐसीटेट समाधान में विसर्जित 2 मिनट के लिए uncrosslinked photoresist दूर धोने के लिए. धीरे नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी संरेखण निशान #1 एक परत प्रकट करने के लिए.
  8. एक चिपकने वाला टेप द्वारा परत #1 संरेखण चिह्न को कवर, स्पिन कोट 4 जी SU-8 10 नकारात्मक photoresist परत पर #1 1,230 आरपीएम के लिए 30 s के लिए एक 25 डिग्री मोटी परत बनाने के लिए #2.
  9. टेप निकालें, नरम सेंकना परत 3 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस hotplate पर #2, और फिर 7 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस hotplate के लिए #2 परत हस्तांतरण.
  10. कूल परत कमरे के तापमान के लिए #2, अर्द्ध स्वचालित मुखौटा संरेखण के धारक पर #2 परत जगह है, और परत #2 क्रोम चढ़ाया photomask (पासपास चैनल परत) संरेखण निशान करने के लिए परत #1 संरेखित करने के लिए संरेखित करें।
  11. 200 mJ/cm2की एक खुराक पर 365 एनएम यूवी प्रकाश के साथ #2 परत का पर्दाफाश.
  12. 1 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर #2 और पोस्ट-बेक से परत निकालें और 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर #2 परत हस्तांतरण करें।
  13. कूल परत कमरे के तापमान #2, और चिपकने वाला टेप द्वारा संरेखण चिह्न #1 परत को कवर। स्पिन कोट 4 ग्राम SU-8 2050 नकारात्मक photoresist परत पर #2 1,630 आरपीएम के लिए 30 s के लिए एक 100 डिग्री मोटी परत #3 बनाने के लिए.
  14. टेप निकालें, नरम सेंकना परत 5 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस hotplate पर #3, और फिर 20 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस hotplate के लिए #3 परत हस्तांतरण.
  15. कमरे के तापमान के लिए #3 कूल परत, अर्द्ध स्वचालित मुखौटा संरेखण के धारक पर #3 परत जगह है, और परत #1 संरेखण चिह्न #3 क्रोम चढ़ाया photomask (संस्कृति कक्ष परत) के लिए परत संरेखित करें।
  16. 240 mJ/cm2की एक खुराक पर 365 एनएम यूवी प्रकाश के साथ #3 परत का पर्दाफाश.
  17. 5 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर संरेखण और पोस्ट-बेक से #3 परत निकालें। स्थानांतरण परत 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट के लिए #3।
  18. कमरे के तापमान #3 कूल परत। एक प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमेथिल ईथर ऐसीटेट समाधान में विसर्जित करने के लिए 10 मिनट के लिए uncrosslinked photoresist दूर धोया, और धीरे नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी.

2. कई एकल सेल पर कब्जा करने के लिए PDMS डिवाइस की तैयारी

  1. वेफर मोल्ड और वजन ी डिश को ट्राइक्लोरोसिलेन के 100 डिग्री सेल्सियस में रखें (केवल सिलेनाइजेशन के लिए) और 15 मिनट के लिए एक वैक्यूम (-85 केपीए) लागू करें।
    नोट: पीडीएमएस कास्टिंग सो से पहले हाइड्रोफोबिक सतह गुण बनाने के लिए ट्राइक्लोरोसिलेन के साथ वेफर सतह को सिलनाइज करें ताकि इसे आसानी से वेफर पीडीएमएस मोल्ड से छीला जा सके।
  2. वैक्यूम बंद करो, और फिर कम से कम 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर desiccator (केवल silanization के लिए) में वेफर मोल्ड silanize.
  3. 10:1 के अनुपात में पीडीएमएस बेस और पीडीएमएस इलाज एजेंट मिलाएं। एक 15 सेमी पकवान में वेफर मोल्ड पर मिश्रित PDMS के कुल 20 ग्राम डालो.
  4. एक desiccator में 15 सेमी पकवान प्लेस और 1.5 मिनट के लिए वैक्यूम (-85 kPa) लागू होते हैं. फिर desiccator से 15 सेमी पकवान हटा दें. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए रखें. अंत में, नाइट्रोजन गैस के साथ PDMS में अवशिष्ट हवा बुलबुले को हटा दें।
  5. PDMS का इलाज करने के लिए 2-4 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में 15 सेमी पकवान रखें।
  6. वेफर मोल्ड से PDMS प्रतिकृति निकालें, और फिर एक 1.5 मिमी इनलेट पंच और एक 1.5 मिमी आंतरिक व्यास और एक 0.5 मिमी आंतरिक व्यास पंचर का उपयोग कर PDMS पर एक 0.5 मिमी आउटलेट (चित्र 1सी) .
  7. PDMS प्रतिकृति और हटाने योग्य टेप के साथ स्लाइड सतह को साफ करें और फिर सतह को ऑक्सीजन प्लाज्मा (100 डब्ल्यू के लिए 14 s) के साथ इलाज करें।
  8. मैन्युअल रूप से PDMS प्रतिकृतियों को स्लाइड के साथ संरेखित करें और उन्हें एक-दूसरे के संपर्क में लाएँ.
  9. 1 दिन के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में PDMS स्लाइड रखें।
    नोट: स्लाइड और PDMS प्रतिकृति के बीच स्थायी संबंध डिवाइस के रूप में हासिल की है.
  10. फॉस्फेट बफर नमकीन से भरा एक कंटेनर में PDMS डिवाइस विसर्जित कर दिया और एक desiccator में जगह है। फिर हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए 15 मिनट के लिए वैक्यूम (-85 kPa) लागू होते हैं।
  11. एक सेल संस्कृति हुड में PDMS डिवाइस प्लेस और यूवी प्रकाश (प्रकाश तरंगदैर्ध्य: 254 एनएम) के साथ 30 मिनट के लिए डिवाइस बाँझ.
  12. मध्यम के साथ PDMS डिवाइस बफर बदलें (DMEM-F12 बेसल माध्यम युक्त 1% एंटीबायोटिक और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम) और 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर PDMS डिवाइस incubate. यह कोशिकाओं को PDMS सतह का फ़ार्म करने से रोकता है.

3. एक एकल सेल निलंबन की तैयारी

नोट: सेल प्रकार मानव लसीका endothelial कोशिकाओं (LECs), मानव OSCC TW2.6 कोशिकाओं WNT5B-विशिष्ट shRNA (WNT5B sh4) और वेक्टर नियंत्रण (pLKO-GFP) जो हमारे पिछले अध्ययन से प्राप्त किए गए थे व्यक्त शामिल हैं15. कृपया विस्तृत खेती चरणों के लिए हमारे पिछले प्रकाशन को देखें.

  1. संस्कृति माध्यम निकालें जब कोशिकाओं को प्राप्त 70-80% संगम. फिर धीरे से बाँझ पीबीएस के 5 एमएल तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लो.
  2. DMEM-F12 मध्यम के 1 एमएल जोड़ें जिसमें WNT5B sh4 और pLKO-GFP कोशिकाओं में 1 $M फ्लोरोसेंट डाई युक्त जोड़ें (एलईसी के लिए MV2 माध्यम का उपयोग करें) और फिर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: LECs हरे क्लोरोमेथिलfluorescein diacetate (CMFDA) डाई, WNT5B sh4 कोशिकाओं नीले 7-एमिनो-4-क्लोरोमेथिलकोउमारिन (CMAC) डाई और pLKO-GFP कोशिकाओं के साथ दाग थे लाल दिल फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग थे.
  3. 5 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से तीन बार धो लें।
  4. पीबीएस निकालें और 0.25% Trypsin-EDTA के 2 एमएल जोड़ें (0.05% LECs के लिए Trypsin-EDTA).
  5. कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और फिर कोशिकाओं को टुकड़ी को बढ़ावा देने के लिए ऊतक संस्कृति पकवान को टैप करें।
  6. WNT5B sh4 और pLKO-GFP कोशिकाओं को फैलाने के लिए DMEM-F12 माध्यम के 4 एमएल जोड़ें (एलईसी का उपयोग करने के लिए 3 एमएल MV2 मध्यम और trypsin तटस्थ समाधान के 1 एमएल). फिर कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रण।
  7. supernatant निकालें, और DMEM-F12 मध्यम धीरे से 1 एमएल में सेल गोली resuspend. मानक Trypan ब्लू बहिष्करण विधि16का उपयोग करके एक हेमोसाइटोमीटर में जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। DMEM-F12 माध्यम में 3 x 105 कोशिकाओं/एमएल सांद्रता पर सेल निलंबन के 1 एमएल तैयार करें, और फिर सेल एकत्रीकरण को रोकने के लिए कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
    नोट: एकल सेल कब्जा दक्षता में सुधार करने के लिए, अच्छी तरह से अलग के साथ एकल सेल निलंबन की सावधान तैयारी की आवश्यकता है।

4. एकाधिक एकल सेल पर कब्जा और ट्रिपल एकल सेल संस्कृति

  1. डिवाइस और सिरिंज पंप के आउटलेट के बीच एक पाली-टेट्राफ्लोरोएथीन (PTFE) ट्यूब कनेक्ट करें। माध्यम निकालें और PDMS डिवाइस के प्रवेश में 3 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर सेल निलंबन के 1 $L जोड़ें।
  2. 0.3 $L/min की प्रवाह दर पर एक सिरिंज पंप द्वारा डिवाइस में सेल निलंबन लोड(चित्र 2ए)। प्रवाह दिशा इनलेट से आउटलेट के लिए है.
    नोट: सेल अवसादन को रोकने के लिए इनलेट में सेल निलंबन जोड़ने के तुरंत बाद लोड करें।
  3. चरण 4.2.Load DMEM-F12 माध्यम के अंदर DMEM-F12 माध्यम का 1 $L जोड़ें 0.3 $L/min की प्रवाह दर पर एक सिरिंज पंप द्वारा डिवाइस में DMEM-F12 माध्यम लोड (चित्र 2बी)। प्रवाह दिशा इनलेट से आउटलेट के लिए बह रहा था.
  4. 10 डिग्री प्रति न्यूनतम की प्रवाह दर पर एक सिरिंज पंप द्वारा डिवाइस में डीएमईएम-एफ 12 माध्यम का 0ण्3 डिग्री सेल्सियस लोड करें (चित्र 2ब्)। प्रवाह दिशा आउटलेट से प्रवेश करने के लिए बह रहा था.
  5. डिवाइस में अन्य कक्ष प्रकारों को लोड करने के लिए चरण 4.1 से 4.4 दोहराएँ.
  6. सेल पर कब्जा पूरा करने के बाद, प्रत्येक संस्कृति कक्ष छवि के लिए 4x लेंस के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की पहचान करने और प्रत्येक संस्कृति कक्ष में अलग-अलग कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  7. PTFE ट्यूब निकालें और एक बंद संस्कृति प्रणाली बनाने के लिए इनलेट और polyolefin टेप के साथ आउटलेट सील.
  8. एक 10 सेमी संस्कृति पकवान करने के लिए PDMS डिवाइस ले जाएँ और डिवाइस से माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए PDMS डिवाइस के आसपास बाँझ पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें।
  9. ट्रिपल एकल सेल संस्कृति के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता) के लिए संस्कृति पकवान स्थानांतरण।
  10. सूक्ष्म रूप से निरीक्षण और फोटोग्राफ सेल वृद्धि हर 12 ज.

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Representative Results

थे डिवाइस है a थ्री-लेयर स्ट्रक्चर अस showed बी द क्रॉस-सेक्शन फोटोग्राफ ऑफ़ a कट पीडीएमएस डिवाइस (चित्र 1A). पहली परत में एक कैप्चर-साइट (6.0 डिग्री चौड़ाई में और 4.6 डिग्री मीटर ऊंचाई में) होता है जो संस्कृति कक्ष और उप-पास चैनल को जोड़ता है। संस्कृति कक्ष और बाइ-पास चैनल के बीच प्रवाह प्रतिरोध में अंतर कोशिकाओं को कब्जा स्थिति में प्रवाह और छोटे रास्ते के प्रवेश द्वार को भरने का कारण बनता है. एक सेल पर कब्जा कर लिया है के बाद, छोटे रास्ते के प्रवाह प्रतिरोध बढ़ जाती है, अगले आने वाली सेल की ओर जाने के लिए और अगले बहाव पर कब्जा साइट के लिए द्वारा-पास चैनल के माध्यम से जाने के लिए जिसके कारण. दूसरी परत के बाइ-पास चैनल (25.0 डिग्री मीटर की चौड़ाई और ऊंचाई में 26.4 डिग्री मी) की सर्पाकार डिजाइन का उपयोग इसके प्रवाह प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए किया जाता है। तीसरी परत में संस्कृति कक्ष के आयाम (500.3 मीटर व्यास में और 111.3 डिग्री ऊंचाई में) सेल संस्कृति प्रयोग के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, और कक्ष में प्रवाह दर को कम करने के लिए कक्ष से बाहर निकाल दिया जा रहा से कोशिकाओं को रखने के लिए.

ऑपरेशन प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरण (चित्र 2) सामान्य प्रयोगशालाओं में आम हैं, जिनमें माइक्रोस्कोप, सिरिंज पंप, कांच सिरिंज, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, ट्यूबिंग, और पिपेट शामिल हैं। थे डिवाइस इस अलंब 1/5 ऑफ़ a कवरस्लिप विथ a 2 मम थिकनेस एंड इस फफेक्ट फॉर observing अंडर a माइक्रोस्कोप विथ 4x तो 20x लेंस. इस विधि के साथ, एकल कोशिकाओं के लिए एक प्रकार 7 मिनट के तहत संस्कृति कक्षों में कब्जा कर लिया जा सकता है, तो ट्रिपल एकल कोशिकाओं के लिए कुल आपरेशन समय कम से कम 21 मिनट था. प्रदर्शन तीन कोशिकाओं की एकल सेल पर कब्जा क्षमता 70.83% थे - 15.42% (LECs), 73.96% - 14.09% (WNT5B sh4) और 78.13% - 3.13% (pLKO-GFP), क्रमशः. ट्रिपल एकल सेल कैप्चर दक्षता 47.92% थी - 7.86% (चित्र 3ठ) । भाटा प्रचालन चरण का उपयोग कोशिकाओं को कैप्चर साइटों से एक साथ छोड़ने और कोशिकाओं को संस्कृति कक्षों में प्रवाहित करने के लिए किया जाता है (चित्र 2ब्) । इस प्रक्रिया के दौरान, यदि कोई सेल अपनी कैप्चर-साइट से जारी नहीं किया जाता है, तो इसके डाउनस्ट्रीम कैप्चर-साइट पर रिलीज़ किया गया कक्ष संस्कृति कक्ष से कम प्रवाह प्रतिरोध वाले चैनल के कारण संस्कृति कक्ष में प्रवेश नहीं करेगा। यह प्रमुख कारण है कि एचएससी के पास केवल 47.92 - 7.86% की ट्रिपल एकल सेल कैप्चर दक्षता है, जो अभी भी एक पॉइसन वितरण ($5%) की संभावना से काफी अधिक है।

कोशिका संस्कृति के परिणामों से पता चला है कि लसीका endothelial कोशिकाओं और स्क्वैमस कैंसर कोशिकाओं के कई एकल सेल सह संस्कृति 24 ज के लिए किया जा सकता है, और कोशिकाओं के प्रसार और आकृति विज्ञान माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जा सकता है (चित्र 4, अनुपूरक वीडियो 1-3). PLKO-GFP कोशिकाओं की उपस्थिति में, WNT5B sh4 कोशिकाओं और LECs बेहतर proliferative क्षमता से पता चला है और पता चला कि आकृति विज्ञान lamellipodia संपर्क किया. ये परिणाम एक संस्कृति कक्ष में एकल कोशिकाओं के कई प्रकार पर उच्च-दक्षता पूर्वक कैप्चर करने के लिए इस डिवाइस की क्षमता प्रदर्शित करते हैं और एकाधिक एकल कक्ष प्रकार इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोगी पर्याप्त संस्कृति स्थान प्रदान करते हैं.

Figure 1
चित्र 1: हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप की फोटोग्राफ और माइक्रोस्कोप छवियां। (क)पीडीएमएस अनुभागीय दृश्य की माइक्रोस्कोप छवि। (बी)बढ़ाया दृश्य की एक एकल सेल ट्रैपिंग इकाई। (ग)48 इकाइयों वाली चिप की उपस्थिति। स्केल बार: 100 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप प्रचालन प्रक्रिया। (ए) बाइ-पास चैनल के उच्च द्रवगतिक प्रतिरोध के कारण, एक एकल कोशिका कैप्चर-साइट में फंस जाती है। (बी)पहले सेल के फंस जाने के बाद और कब्जा साइट को रोक दिया गया है, वृद्धि प्रवाह प्रतिरोध के कारण निम्नलिखित कोशिकाओं को उप-पास चैनल की ओर प्रवाहित किया गया है। चैनल में शेष कोशिकाओं को धोने के लिए माध्यम का उपयोग करें। (ग) कोशिका को संस्कृति कक्ष में प्रवाहित करता है। स्केल बार: 100 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप में एलईसी, WNT5B sh4 और pLKO-GFP की एकल सेल कैप्चर दक्षता। (क)संस्कृति कक्ष में कब्जा कर लिया ट्रिपल एकल कोशिकाओं के माइक्रोस्कोप छवि. (बी)हरे, नीले और लाल सलाखों के व्यक्तिगत कोशिकाओं के कब्जा दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः, और पीले सलाखों ट्रिपल एकल सेल के कब्जा दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार: 100 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 24 ज के लिए हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप में युग्मित एकल सेल सह-संस्कृति और ट्रिपल एकल सेल सह-संस्कृति। (ए) ट्रिपल एकल कोशिकाओं सह संस्कृति के माइक्रोस्कोप छवि 0, 12 और 24 एच के लिए (बी) pLKO-GFP और WNT5B sh4 कोशिकाओं के माइक्रोस्कोप छवि 0, 12 और 24 एच के लिए सह संस्कृति LECs हरे CMFDA डाई के साथ दाग थे, WNT5B sh4 कोशिकाओं नीले CMAC डाई के साथ दाग थे और PLKO-GFP कोशिकाओं लाल DiI फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग थे. स्केल बार: 100 डिग्री मी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video 1
अनुपूरक वीडियो 1: कक्ष लोड हो रहा है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

Video 2
अनुपूरक वीडियो 2: सेल refluxing. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

Video 3
अनुपूरक वीडियो 3: संस्कृति कक्ष में दूसरा सेल प्रकार भाटा. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

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Discussion

ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में विभिन्न कोशिकाओं के अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रिया ट्यूमर17की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . सेल-सेल अन्योन्यक्रियाओं के तंत्र को समझने के लिए सह-संवर्धन प्रणालियों का उपयोग एक सामान्य विश्लेषणात्मक विधि के रूप में किया जाता है। हालांकि, कई सेल प्रकार और खुद कोशिकाओं की विषमता प्रयोगात्मक जटिलता और विश्लेषणात्मक कठिनाइयों के लिए नेतृत्व किया है.

हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप कमजोर पड़ने विधि और माइक्रोवेल मंच में पॉइसन वितरण सीमा द्वारा सीमित किए बिना, एक नियतात्मक विधि द्वारा संस्कृति कक्ष में कई एकल सेल लोडिंग की अनुमति देता है। एक उच्च ट्रिपल एकल सेल पर कब्जा दक्षता प्रदान करके (45% से अधिक, Poison वितरण विधि 5% है) और यह प्रदर्शित करता है कि संस्कृति कक्ष में कोशिका वृद्धि और प्रसार के लिए स्थान पर्याप्त है (चित्र 4)। कुशलतापूर्वक सरल सेटअप और प्रोटोकॉल के साथ कई एकल सेल कब्जा और लाइव सेल संस्कृति टिप्पणियों प्रदर्शन करने की क्षमता के कारण, हम अनुप्रयोगों की एक व्यापक रेंज के लिए उपयोगी उपकरण के रूप में इन microfluidic उपकरणों कल्पना, सेल सेल सहित कई कोशिकाओं के बीच बातचीत18, दवा स्क्रीनिंग19, और कैंसर जीव विज्ञान20. दूसरी ओर, डिवाइस संरचना moldable है, और संरचना और कब्जा साइट के आकार को बदला जा सकता है और सूक्ष्मजीवों और संयंत्र कोशिकाओं के रूप में अन्य क्षेत्रों के लिए लागू किया. सिद्धांत रूप में, हमारी विधि भी स्थापित करने और माइक्रोबियल सह संस्कृति (जैसे, बैक्टीरिया, खमीर, आदि) को ट्रैक करने के लिए अनुकूल है।

इस दृष्टिकोण की मुख्य सीमा है कि सटीक डिवाइस निर्माण के लिए आवश्यक स्तर उच्च है. यह मुख्य रूप से है क्योंकि इसके गढ़े आयाम थोड़ा ऑफसेट कर रहे हैं, तो छोटी चैनल के प्रवाह का विरोध नाटकीय रूप से बदला जा सकता है. microchannels के प्रतिरोध का नियंत्रण डिवाइस के उच्च दक्षता एकल सेल पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. दूसरी ओर, सेल संस्कृति के दौरान, कक्षों के बीच कोई बंद नहीं है। इसलिए, कक्ष में कोशिकाओं के पैराक्रिन स्राव अन्य कक्षों में फैल सकता है अन्य कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए. अंत में, डिवाइस की तैयारी के दौरान चैनल और ट्यूबिंग की सफाई पर ध्यान दिया जाना चाहिए। चैनल को अवरुद्ध करने से कणों और मलबे को रोकने के लिए प्रयोग में प्रयुक्त संस्कृति माध्यम और किसी भी बफर को फ़िल्टर करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2628-ई-400-001-MY2) से अनुदान और ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा, राष्ट्रीय चुंग सिंग विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों में पीएच.डी. कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape 3M Company 9795R
Antibiotics Biowest L0014-100 Glutamine-Penicillin-Streptomycin
AutoCAD software Autodesk AutoCAD LT 2011 Part No. 057C1-74A111-1001
CellTracke Blue CMAC Dye Invitrogen C2110
CellTracker Green CMFDA Dye Invitrogen C7025
Conventional oven YEONG-SHIN company ovp45
Desiccator Bel-Art Products F42020-0000 Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
DiIC12(3) cell membrane dye BD Biosciences 354218 Used as a cell tracker
DMEM-F12 medium Gibco 11320-082
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 PromoCell C-22022
Fetal bovine serum Hyclone Thermo SH30071.03HI
Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) Hamilton 80630 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15075 with 1.5mm inner-diameter
Harris Uni-Core puncher Ted Pella Inc. 15071 with 0.5mm inner-diameter
Hotplate YOTEC company YS-300S
Msak aligner Deya Optronic CO. A1K-5-MDA
Oxygen plasma NORDSON MARCH AP-300
Plasma cleaner Nordson AP-300 Bench-Top Plasma Treatment System
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit Dow corning Sylgard 184
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) Ever Sharp Technology, Inc. TFT-23T inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm
Removable tape 3M Company Scotch Removable Tape 811
Silicon wafer Eltech corperation SPE0039
Spin coater Synrex Co., Ltd. SC-HMI 2" ~ 6"
Stereomicroscope Leica Microsystems Leica E24
SU-8 10 negative photoresist MicroChem Y131259
SU-8 2 negative photoresist MicroChem Y131240
SU-8 2050 negative photoresist MicroChem Y111072
SU-8 developer Grand Chemical Companies GP5002-000000-72GC Propylene glycol monomethyl ether acetate
Syringe pump Harvard Apparatus 703007
Trichlorosilane Gelest, Inc SIT8174.0 Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Trypsin Neutralizer Solution Gibco R-002-100

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 151 एकल सेल microfluidics सेल सेल बातचीत प्रयोगशाला पर एक चिप
एक Microfluidic चिप के साथ एक निर्धारणात्मक मैनर में एकल सेल आधारित सह संस्कृति की स्थापना
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He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (151), e60202, doi:10.3791/60202 (2019).

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