Summary
Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.
Abstract
Os ensaios de cocultura celular têm sido amplamente utilizados para estudar as interações célula-célula entre diferentes tipos de células para entender melhor a biologia das doenças, incluindo o câncer. No entanto, é desafiador esclarecer o complexo mecanismo de interações intercelulares em populações de células altamente heterogêneas usando sistemas de cocultura convencionais, pois a heterogeneidade da subpopulação celular é obscurecida pelos valores médios; os sistemas convencionais da cocultura podem somente ser usados para descrever o sinal da população, mas são incapazes de controlar o comportamento individual das pilhas. Além disso, os métodos experimentais convencionais de célula única têm baixa eficiência na manipulação celular por causa da distribuição de Poisson. Os dispositivos microfabricados são uma tecnologia emergente para estudos de célula única porque eles podem manipular com precisão células individuais em alta taxa de transferência e podem reduzir o consumo de amostras e reagentes. Aqui, nós descrevemos o conceito e a aplicação de uma microplaqueta microfluídicos para coculturas da único-pilha múltipla. A microplaqueta pode eficientemente capturar tipos múltiplos de únicas pilhas em uma câmara da cultura (~ 46%) e tem um espaço de cultura suficiente útil para estudar o comportamento das células (por exemplo, migração, proliferação, etc.) interação célula-célula no nível de célula única. As pilhas endothelial linfáticas e a carcinoma de pilha Squamous oral foram usadas para executar um experimento da cocultura da único-pilha na plataforma microfluídicos para estudos múltiplos vivos da interação da único-pilha.
Introduction
A captura eficiente de diferentes tipos de células individuais e o fornecimento de espaço de cultura suficiente são necessários para experimentos de cocultura de célula única de vários tipos de células individuais1. A diluição limitante é o método mais comumente utilizado para preparar as células individuais para tais experimentos, devido ao baixo custo do equipamento necessário. No entanto, devido à limitação da distribuição de Poisson, a probabilidade máxima de aquisição de célula única é de apenas 37%, tornando a operação experimental trabalhosa e demorada2. Por outro lado, usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) pode superar a limitação de distribuição de Poisson para preparar as células únicas3de alta eficiência. No entanto, o FACS pode não estar acessível a alguns laboratórios devido à dispendiosa instrumentação e custo de manutenção. Os dispositivos microfabricados foram desenvolvidos recentemente para a única pilha que interceptação4, única pilha que emparelha5, e únicas aplicações da cultura da pilha. Esses dispositivos são vantajosos com base em sua capacidade de manipular com precisão as células únicas6, realizar experimentos de alta taxa de transferência ou reduzir o consumo de amostras e reagentes. No entanto, realizar experimentos de cocultura de célula única com vários tipos de células com os atuais dispositivos microfluílicos ainda é desafiador devido à limitação da distribuição de Poisson1,7,8ou incapacidade de os dispositivos para capturar mais de dois tipos de células individuais4,5,6,9,10.
Por exemplo, Yoon et al. relataram um dispositivo microfluídico para o estudo de interação célula-célula11. Este dispositivo usa o método probabilístico para emparelhar as células em uma câmara. No entanto, ele só pode alcançar o emparelhamento de dois tipos de células diferentes devido a restrições geométricas na estrutura do dispositivo. Outro relato de Lee et al. demonstrou um método determinístico para capturar e emparelhar células individuais12. Este dispositivo é aumenta a eficiência de emparelhamento pelo método determinístico mas é limitado pelo tempo prolongado da operação exigido para emparelhar pilhas. Especificamente, a segunda captura de célula só pode ser realizada depois que a primeira célula capturada é anexada à superfície após 24 h. Zhao et al. relataram um dispositivo microfluídico baseado em gotas para capturar dois tipos de uma única célula13. Podemos encontrar que o dispositivo microfluídico baseado em gotas ainda está limitado à distribuição de Poisson e só pode ser usado em células não anexadas, e não é possível alterar a solução de cultura durante o processo de cultivo.
Anteriormente, desenvolvemos um microfluídico "chip de shuttling hidrodinâmico" que utiliza forças hidrodinâmicas determinísticas para capturar vários tipos de célula única na câmara de cultura e pode subsequentemente realizar experimento de cocultura celular para analisar comportamento de migração de células individuais em interações Cell-Cell14. O chip de shuttling hidrodinâmico compreende um conjunto de unidades vestiu que cada um contém um canal de passagem por serpentina, um local de captura e uma câmara de cultura. Usando a diferença na resistência do fluxo entre a canaleta serpentina do by-pass e a câmara da cultura, e um procedimento especialmente projetado da operação, os tipos diferentes de únicas pilhas podem repetidamente ser capturados na câmara da cultura. Notavelmente, o amplo espaço da câmara de cultura não só pode impedir que a célula seja lavada durante a captura de células, mas também fornecer espaço suficiente para as células se espalham, proliferam e migram, permitindo a observação de interações de células únicas ao vivo. Neste artigo, nós nos concentramos na produção deste dispositivo e etapas detalhadas do protocolo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricação de um molde da bolacha pela litografia macia
Nota: os dados do padrão de máscara estão disponíveis em nossa publicação anterior14.
- Desidratar uma bolacha de silício de 4 polegadas num forno a 120 ° c durante 15 min.
- O revestimento da rotação 4 g do fotororesist negativo SU-8 2 em um wafer do silicone de 4 polegadas em 1.000 rpm para 30 s para criar uma camada grossa de 5 μm (camada #1).
- A camada macia do Bake #1 em um fogão de 65 ° c por 1 minuto e transfere então a camada #1 a um fogão de 95 ° c por 3 minutos.
- A camada fresca #1 à temperatura ambiente, coloc a no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe-a com a camada #1 a máscara de cromo-chapeada (camada da captação-local).
- Expor camada #1 com 365 nm de luz UV em uma dose de 150 mJ/cm2.
- Remova a camada #1 do alinhador e pós-assar em uma placa de 65 ° c por 1 min. camada de transferência #1 para uma placa de 95 ° c por 1 min.
- Camada fresca #1 à temperatura ambiente. Mergulhe em uma solução de acetato de propileno glicol monometil éter para lavar afastado o fotoresistente reticulado por 2 min. seque suavemente com gás nitrogênio para revelar uma camada #1 marca de alinhamento.
- Cubra a camada #1 marca de alinhamento por uma fita adesiva, revestimento da rotação 4 g de fotoresistista negativo SU-8 10 na camada #1 em 1.230 rpm por 30 s para criar uma camada grossa de 25 μm #2.
- Retire a fita, Soft Bake Layer #2 em uma placa de 65 ° c por 3 min e, em seguida, transfira a camada #2 para uma placa de 95 ° c por 7 min.
- A camada fresca #2 à temperatura ambiente, coloc a camada #2 no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe a camada #2 a máscara de cromo-chapeada (camada do canal do desvio) à marca da camada #1 do alinhamento.
- Expor camada #2 com 365 nm de luz UV em uma dose de 200 mJ/cm2.
- Remova a camada #2 do alinhador e pós-asse em uma placa de 65 ° c durante 1 min e transfira a camada #2 para uma placa de fogão de 95 ° c por 3 min.
- A camada fresca #2 à temperatura ambiente, e cobre a camada #1 a marca do alinhamento pela fita adesiva. O revestimento da rotação 4 g do fotororesist negativo SU-8 2050 na camada #2 em 1.630 rpm para 30 s para criar uma camada grossa de 100 μm #3.
- Retire a fita, Soft Bake Layer #3 em uma placa de 65 ° c por 5 min e, em seguida, transfira a camada #3 para uma placa de 95 ° c por 20 min.
- A camada fresca #3 à temperatura ambiente, coloc a camada #3 no suporte do alinhador semiautomático da máscara, e alinhe a camada #3 a máscara cromada do Fotomáscara (camada da câmara da cultura) à marca da camada #1 do alinhamento.
- Expor camada #3 com 365 nm de luz UV em uma dose de 240 mJ/cm2.
- Retire a camada #3 do alinhador e pós-assar em uma placa de 65 ° c para 5 min. camada de transferência #3 para uma placa de 95 ° c por 10 min.
- Camada fresca #3 à temperatura ambiente. Mergulhe em uma solução de acetato de propileno glicol monometil éter para lavar afastado o fotoresistente reticulado por 10 min, e seque suavemente com gás nitrogênio.
2. preparação do dispositivo PDMS para captura de célula única múltipla
- Coloque o molde da bolacha e o prato de pesagem contendo 100 μL de triclorosilano num dessecador (apenas para silanização) e aplique um vácuo (-85 kPa) durante 15 min.
Nota: silanize a superfície da bolacha com o triclorosilano para criar propriedades hidrofóbicas da superfície antes do castingso de PDMS que pode facilmente ser descascado fora do molde do PDMS da bolacha. - Pare o vácuo, e então, silanize o molde da bolacha no exsicador (somente para o silanization) em 37 ° c por pelo menos 1 h.
- Misture a base de PDMS e o agente de cura de PDMS em uma relação de 10:1. Despeje um total de 20 g de PDMS mista sobre o molde wafer em um prato de 15 cm.
- Coloque o prato de 15 cm em um dessecador e aplique vácuo (-85 kPa) por 1,5 min. Em seguida, retire o prato de 15 cm do dessecador. Manter por 20 min à temperatura ambiente. Finalmente, remova as bolhas de ar residuais em PDMS com gás de nitrogênio.
- Coloque o prato de 15 cm em um forno a 65 ° c por 2-4 h para curar o PDMS.
- Retire a réplica do PDMS do molde da bolacha e, em seguida, perfure uma entrada de 1,5 mm e uma tomada de 0,5 mm no PDMS utilizando um diâmetro interno de 1,5 mm e um perfurador de diâmetro interno de 0,5 mm (Figura 1C).
- Limpe a réplica do PDMS e a superfície do slide com fita removível e, em seguida, trate a superfície com plasma de oxigênio (100 W para 14 s).
- Alinhe manualmente as réplicas do PDMS com o slide e coloque-as em contato entre si.
- Coloque o slide PDMS em um forno de 65 ° c por 1 dia.
Nota: a ligação permanente entre o diapositivo e a réplica do PDMS é conseguida para formar o dispositivo. - Mergulhe o dispositivo PDMS em um recipiente preenchido com tampão fosfato salina e coloque em um dessecador. Em seguida, aplique vácuo (-85 kPa) por 15 min para remover as bolhas de ar.
- Coloc o dispositivo de PDMS em uma capa da cultura da pilha e esterilize o dispositivo com luz UV (comprimento de onda claro: 254 nanômetro) por 30 minutos.
- Substitua o tampão do dispositivo PDMS por meio (meio basal DMEM-F12 contendo 1% de antibiótico e 10% de soro bovino fetal) e incubar o dispositivo PDMS a 4 ° c durante 1 dia. Isso impede que as células aderindo à superfície PDMS.
3. preparação de uma suspensão de uma única célula
Nota: os tipos de células incluem células endoteliais linfáticas humanas (LECs), células OSCC TW 2.6 humanas expressando shRNA WNT5B-specific (WNT5B SH4) e controle vetorial (pLKO-GFP) que foram obtidas em nosso estudo anterior15. Refira por favor nossa publicação precedente para etapas detalhadas do cultivation.
- Remova o meio de cultura quando as células alcançarem 70-80% de confluência. Em seguida, lave suavemente as células com 5 mL de PBS estéril três vezes.
- Adicione 1 mL de meio DMEM-F12 contendo 1 μM de corante fluorescente em células WNT5B sh4 e pLKO-GFP (use MV2 Medium para LECs) e, em seguida, incubar as células por 30 min à temperatura ambiente.
Nota: os LECs foram manchados com corante verde do diacetato do chloromethylfluorescein (CMFDA), WNT5B sh4 as pilhas foram manchadas com o corante azul de 7-amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) e as pilhas de pLKO-GFP foram manchadas com o corante fluorescente do Dil vermelho. - Lave suavemente as células com 5 mL de PBS estéril três vezes.
- Retire o PBS e adicione 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA (0, 5% Trypsin-EDTA para LECs).
- Incubar as células por 4 min à temperatura ambiente e, em seguida, Bata suavemente o prato de cultura do tecido para promover o destacamento de células.
- Adicione 4 mL de meio DMEM-F12 para dispersar as células WNT5B sh4 e pLKO-GFP (para LECs use 3 mL de meio MV2 e 1 mL de solução de neutralizador de tripsina). Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mL e Centrifugue a 300 x g durante 3 min.
- Retire o sobrenadante, e ressuscitem a pelota da pilha em 1 mL do meio DMEM-F12 delicadamente. Conte o número de células ao vivo em um hemocitometro usando o método de exclusão padrão trypan Blue16. Prepare 1 mL de suspensão celular a 3 x 105 células/ml de concentração no meio DMEM-F12 e, em seguida, mantenha as células no gelo para evitar a agregação celular.
Nota: a fim melhorar a eficiência da captação da único-pilha, a preparação cuidadosa da única suspensão da pilha com bem-Dissociated é exigida.
4. múltipla única-célula de captura e tripla single-cultura de células
- Conecte um tubo de poli-tetrafluoroethene (PTFE) entre a tomada do dispositivo e a bomba da seringa. Retire o meio e adicione 1 μL de suspensão celular a uma concentração de 3 x 105 células/ml na entrada do dispositivo PDMS.
- Coloque a suspensão da célula no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 0,3 μL/min (Figura 2a). O sentido do fluxo é da entrada à tomada.
Nota: carregue imediatamente após ter adicionado a suspensão da pilha na entrada para impedir o sedimentation da pilha. - Adicione 1 μL de meio DMEM-F12 na entrada do dispositivo PDMS após a etapa 4.2. Carregue o meio DMEM-F12 no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 0,3 μL/min (Figura 2B). O sentido do fluxo estava fluindo da entrada à tomada.
- Carregar 0,3 μL de meio DMEM-F12 no dispositivo por uma bomba de seringa a um caudal de 10 μL/min (Figura 2C). O sentido do fluxo estava fluindo da tomada à entrada.
- Repita as etapas 4,1 a 4,4 para carregar outros tipos de célula no dispositivo.
- Após ter terminado a captação da pilha, use um microscópio com a lente 4x à imagem cada câmara da cultura.
Nota: as emissões de fluorescência das células foram utilizadas para identificar e contar o número de células individuais em cada câmara de cultura. - Retire o tubo de PTFE e sele a entrada e a tomada com fita de poliolefina para criar um sistema de cultura fechado.
- Mova o dispositivo PDMS para um prato de cultura de 10 cm e adicione 10 mL de PBS estéril em torno do dispositivo PDMS para evitar a evaporação do meio do dispositivo.
- Transfira o prato de cultura para uma incubadora (37 ° C, 5% CO2 e 95% de umidade) para a cultura de célula única tripla.
- Microscopicamente observar e fotografar o crescimento celular a cada 12 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O dispositivo tem uma estrutura de três camadas, como mostrado pela fotografia de seção transversal de um dispositivo PDMS cortado (Figura 1a). A primeira camada contém um local de captura (6,0 μm de largura e 4,6 μm de altura) que conecta a câmara de cultura e o canal de passagem. A diferença na resistência de fluxo entre a câmara de cultura e o canal de passagem faz com que as células fluam para a posição de captura e preencham a entrada do pequeno caminho. Depois que uma célula é capturada na posição de captura, a resistência de fluxo do pequeno caminho é aumentada, fazendo com que a próxima célula de entrada para ir em direção e através do canal de passagem para a próxima captura downstream-site. O projeto serpentino do canal de passagem (25,0 μm de largura e 26,4 μm de altura) da segunda camada é usado para aumentar sua resistência ao fluxo. As dimensões da câmara da cultura na terceira camada (500,3 μm no diâmetro e no μm 111,3 na altura) são projetadas fornecer o suficiente espaço para a experiência da cultura de pilha, e para reduzir a taxa de fluxo na câmara para manter as pilhas do liberado fora da câmara.
As ferramentas necessárias para o procedimento de operação (Figura 2) são comuns em laboratórios gerais, incluindo microscópio, bomba de seringa, seringa de vidro, tubo de centrífuga, tubulação e pipeta. O dispositivo é aproximadamente 1/5 de um lamela com uma espessura de 2 milímetros e é apropriado para observar um microscópio com a lente 4x a 20x. Com este método, um tipo para as únicas pilhas pode ser capturado nas câmaras da cultura 7 minutos, assim que o tempo total da operação para únicas pilhas triplas era menos de 21 minutos. As eficiências de captura de células únicas das três células demonstradas foram 70,83% ± 15,42% (LECs), 73,96% ± 14, 9% (WNT5B SH4) e 78,13% ± 3,13% (pLKO-GFP), respectivamente. A eficiência de captura de célula única tripla foi de 47,92% ± 7,86% (Figura 3B). A etapa de operação de refluxo é usada para liberar as células dos locais de captura simultaneamente e fluir as células para as câmaras de cultura (Figura 2C). Durante esse processo, se uma célula não for liberada de seu site de captura, a célula liberada em seu local de captura a jusante não entrará na câmara de cultura devido ao canal de passagem com uma resistência de fluxo menor do que a câmara de cultura. Esta é a razão principal pela qual o HSC tem uma eficiência tripla da captação da única pilha de somente 47,92 ± 7,86%, que é ainda significativamente maior do que a probabilidade de uma distribuição de Poisson (~ 5%).
Os resultados da cultura celular mostraram que múltiplas coculturas de células uniosas linfáticas e células de câncer escamoso podem ser realizadas por 24 h, e a proliferação e morfologia das células podem ser observadas microscópio (Figura 4, Complementar vídeos 1-3). Na presença de células pLKO-GFP, as células WNT5B sh4 e LECs apresentaram melhor capacidade proliferativa e mostraram que a morfologia se aproximou do lamellipodia. Esses resultados demonstram a capacidade deste dispositivo para capturar de alta eficiência vários tipos de células individuais em uma câmara de cultura e fornecer um espaço de cultura suficiente útil para estudar várias interações de tipo de célula única.
Figura 1: fotografia e microscópio imagens de chip de shuttling hidrodinâmico. (A) imagem do microscópio da vista secional de PDMS. (B) uma unidade de trapping de célula única de vista ampliada. (C) aparência do chip contendo 48 unidades. Barra de escala: 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: procedimento de operação de chip de shuttling hidrodinâmico. (A) devido à alta resistência hidrodinâmica do canal de passagem, uma única célula está presa no local de captura. (B) depois que a primeira célula estiver presa e tiver fechado o local de captura, as células a seguir fluem em direção ao canal de passagem devido à maior resistência ao fluxo. Use o meio para lavar as células restantes no canal. (C) refluxo da célula para a câmara de cultura. Barra de escala: 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: eficiência de captura de células individuais de LECs, WNT5B sh4 e pLKO-GFP no chip de shuttling hidrodinâmico. (A) imagem do microscópio de pilhas únicas triplas capturadas na câmara da cultura. (B) as barras verde, azul e vermelha representam a eficiência de captura de células individuais, respectivamente, e as barras amarelas representam a eficiência de captura de uma única célula tripla. Barra de escala: 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: cocultura de célula única emparelhada e cocultura tripla de célula única no chip de shuttling hidrodinâmico por 24 h. (A) imagem do microscópio da cocultura tripla das únicas pilhas para 0, 12 e 24 h. (B) imagem do microscópio da Cocultura das pilhas de PLKO-GFP e de WNT5B sh4 para 0, 12 e 24 h. os LECS foram manchados com a tintura verde de cmfda, WNT5B sh4 as pilhas foram manchadas com tintura azul de CMAC e as pilhas de pLKO-GFP foram manchadas com corante vermelho do DiI fluorescente. Barra de escala: 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo complementar 1: carregamento de células. Por favor, clique aqui para ver este vídeo (clique direito para baixar).
Vídeo complementar 2: célula refluxing. Por favor, clique aqui para ver este vídeo (clique direito para baixar).
Vídeo complementar 3: refluxo do tipo segunda célula para a câmara de cultura. Por favor, clique aqui para ver este vídeo (clique direito para baixar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As interações intercelular de várias pilhas no microambiente do tumor jogam um papel importante na progressão do tumor17. A fim compreender o mecanismo de interações da pilha-pilha, os sistemas da cocultura são usados como um método analítico comum. Entretanto, os tipos múltiplos da pilha e a heterogeneidade das pilhas elas mesmas conduziram à complexidade experimental e às dificuldades analíticas.
O chip de shuttling hidrodinâmico permite o carregamento múltiplo da único-pilha na câmara da cultura por um método determinístico, sem ser limitado pela limitação da distribuição de Poisson no método da diluição e na plataforma do de micropoços. Ao fornecer uma alta eficiência de captura de célula única tripla (maior que 45%, o método de distribuição de Poisson é 5%) e demonstrando que na câmara de cultura, o espaço é suficiente para o crescimento e proliferação celular (Figura 4). Devido à sua capacidade de executar eficientemente várias capturas de célula única e observações de cultura de células ao vivo com configuração e protocolo simples, nós imaginamos esses dispositivos microfluílicos como ferramentas úteis para uma extensa gama de aplicações, incluindo células celulares interações entre células múltiplas18, triagem de drogas19e biologia do câncer20. Por outro lado, a estrutura do dispositivo é moldável, e a estrutura e o tamanho do local de captura podem ser alterados e aplicados a outros campos, como microrganismos e células vegetais. Em teoria, nosso método também é adaptável para estabelecer e rastrear coculturas microbianas (por exemplo, bactérias, leveduras, etc.).
A principal limitação dessa abordagem é que o nível de precisão exigido para a fabricação do dispositivo é alto. Isto é principalmente porque o fluxo resiste do canal o menor pode dramàtica ser mudado se suas dimensões fabricadas são ligeiramente offset. O controle das resistências das microcanaletas é crucial para a captação da único-pilha da elevado-eficiência do dispositivo. Por outro lado, durante a cultura celular, não há fechamento entre as câmaras. Conseqüentemente, o secretion parácrina das pilhas na câmara pode espalhar em outras câmaras para afetar outras pilhas. Finalmente, a atenção deve ser dada à limpeza do canal e da tubulação durante a preparação do dispositivo. O meio de cultura e qualquer buffer usado no experimento precisam ser filtrados para evitar que partículas e detritos bloqueiem o canal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Ministério da ciência e tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e o programa de doutorado em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, Universidade Nacional Chung Hsing e institutos nacionais de pesquisa em saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
