Summary
Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.
Abstract
Los ensayos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones de células celulares entre diferentes tipos de células para comprender mejor la biología de las enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, es difícil aclarar el complejo mecanismo de interacciones intercelulares en poblaciones celulares altamente heterogéneas utilizando sistemas de cocultivo convencionales porque la heterogeneidad de la subpoblación celular está oscurecida por los valores medios; los sistemas de cocultivo convencionales sólo se pueden utilizar para describir la señal de población, pero son incapaces de rastrear el comportamiento de las células individuales. Además, los métodos experimentales convencionales de una sola célula tienen baja eficiencia en la manipulación celular debido a la distribución de Poisson. Los dispositivos microfabricados son una tecnología emergente para estudios de una sola célula porque pueden manipular con precisión células individuales a un alto rendimiento y pueden reducir el consumo de muestras y reactivos. Aquí, describimos el concepto y la aplicación de un chip microfluídico para múltiples cocultivos de una sola célula. El chip puede capturar de manera eficiente varios tipos de células individuales en una cámara de cultivo (46%) y tiene un espacio de cultivo suficiente útil para estudiar el comportamiento de las células (por ejemplo, migración, proliferación, etc.) bajo la interacción célula-célula a nivel de una sola célula. Las células endoteliales linfáticas y el carcinoma de células escamosas orales se utilizaron para realizar un experimento de cocultivo de una sola célula en la plataforma microfluídica para estudios de interacción de células únicas en vivo.
Introduction
Se necesita una captura eficiente de diferentes tipos de celdas individuales y proporcionar suficiente espacio de cultivo para experimentos de cocultivo de una sola célula de varios tipos de celdas individuales1. Limitar la dilución es el método más utilizado para preparar las células individuales para tales experimentos, debido al bajo costo del equipo requerido. Sin embargo, debido a la limitación de distribución de Poisson, la probabilidad máxima de adquisición de una sola célula es de solo 37%, lo que hace que la operación experimental sea laboriosa y requiera mucho tiempo2. Por el contrario, el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede superar la limitación de distribución de Poisson para preparar de manera alta células individuales3. Sin embargo, es posible que algunos laboratorios no puedan acceder a FACS debido a los costosos costos de instrumentación y mantenimiento. Los dispositivos microfabricados se han desarrollado recientemente para el reventado de una sola célula4,el emparejamiento de una sola célula5y las aplicaciones de cultivo de una sola célula. Estos dispositivos son ventajosos en función de su capacidad para manipular con precisión celdas individuales6,realizar experimentos de alto rendimiento o reducir el consumo de muestras y reactivos. Sin embargo, realizar experimentos de cocultivo de una sola célula con varios tipos de células con los dispositivos microfluídicos actuales sigue siendo un desafío debido a la limitación de la distribución de Poisson1,7,8,o la incapacidad de los dispositivos para capturar más de dos tipos de células individuales4,5,6,9,10.
Por ejemplo, Yoon y otros informaron de un dispositivo microfluídico para el estudio de interacción célula-célula11. Este dispositivo utiliza el método probabilístico para emparejar celdas en una cámara. Sin embargo, sólo puede lograr el emparejamiento de dos tipos de celda diferentes debido a restricciones geométricas en la estructura del dispositivo. Otro informe de Lee y otros demostró un método determinista para capturar y emparejar celdas individuales12. Este dispositivo aumenta la eficiencia de emparejamiento por el método determinista, pero está limitado por el tiempo de operación prolongado necesario para emparejar celdas. Específicamente, la segunda captura de célula sin capacidad sólo se puede realizar después de que la primera celda capturada se une a la superficie después de 24 h. Zhao et al. informaron de un dispositivo microfluídico basado en gotas para capturar dos tipos de una sola celda13. Podemos encontrar que el dispositivo microfluídico basado en gotas todavía se limita a la distribución de Poisson y sólo se puede utilizar en células no conectadas, y no es posible cambiar la solución de cultivo durante el proceso de cultivo.
Anteriormente, hemos desarrollado un microfluido "chip de cierre hidrodinámico" que utiliza fuerzas hidrodinámicas deterministas para capturar múltiples tipos de una sola célula en la cámara de cultivo y posteriormente puede realizar experimentos de cocultivo celular para analizar comportamiento de migración de celda sindividual en las interacciones de célulascelulares 14. El chip de cierre hidrodinámico comprende un conjunto de unidades de matriz que cada una contiene un canal de derivación de serpentina, un sitio de captura y una cámara de cultivo. Mediante el uso de la diferencia en la resistencia al flujo entre el canal de derivación de serpentina y la cámara de cultivo, y un procedimiento de operación especialmente diseñado, diferentes tipos de células individuales se pueden capturar repetidamente en la cámara de cultivo. En particular, el amplio espacio de la cámara de cultivo no sólo puede evitar que la célula se enjuague durante la captura de células, sino que también proporcione suficiente espacio para que las células se propaguen, proliferen y migren, lo que permite observar interacciones en vivo de una sola célula. En este artículo, nos centramos en la producción de este dispositivo y los pasos detallados del protocolo.
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Protocol
1. Fabricación de un molde de oblea por litografía suave
NOTA: Los datos del patrón de máscara están disponibles en nuestra publicación anterior14.
- Deshidratar una oblea de silicio de 4 pulgadas en un horno de 120 oC durante 15 min.
- Capa de giro 4 g de SU-8 2 fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 1.000 rpm durante 30 s para crear una capa de 5 m de espesor (capa #1).
- La capa de horneado suave #1 en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y luego transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.
- Enfríe la capa #1 a temperatura ambiente, colóquela en el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee con la capa #1 fotomáscara cromada (capa de sitio de captura).
- Exponga la capa #1 con luz UV de 365 nm a una dosis de 150 mJ/cm2.
- Retire la capa #1 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min. Transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 1 min.
- Capa fría #1 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de éter monometil propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 2 min. Seque suavemente con gas nitrógeno para revelar una capa #1 marca de alineación.
- Cubrir la capa #1 la marca de alineación por una cinta adhesiva, capa de espín 4 g de SU-8 10 fotorresistente negativo en la capa #1 a 1.230 rpm durante 30 s para crear una capa de 25 m de espesor #2.
- Retire la cinta, la capa de horneado suave #2 en una placa de cocción de 65 oC durante 3 minutos y, a continuación, transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 7 minutos.
- Enfríe la capa #2 a la temperatura ambiente, coloque la capa #2 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #2 fotomáscara cromada (capa de canal de derivación) con la capa #1 la marca de alineación.
- Exponga la capa #2 con luz UV de 365 nm a una dosis de 200 mJ/cm2.
- Retire la capa #2 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.
- Enfríe la capa #2 a temperatura ambiente y cubra la capa #1 la marca de alineación por cinta adhesiva. Capa de giro 4 g de fotorresistente negativo SU-8 2050 sobre la capa #2 a 1.630 rpm durante 30 s para crear una capa de 100 m de espesor #3.
- Retire la cinta, la capa de horneado suave #3 en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos y, a continuación, transfiera la capa #3 a una placa de cocción de 95 oC durante 20 minutos.
- Enfríe la capa #3 a la temperatura ambiente, coloque la capa #3 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #3 fotomáscara cromada (capa de cámara de cultivo) con la capa #1 la marca de alineación.
- Exponga la capa #3 con luz UV de 365 nm a una dosis de 240 mJ/cm2.
- Retire la capa #3 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos #3.
- Capa fresca #3 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de acetato de monometil de propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 10 minutos, y secar suavemente con gas nitrógeno.
2. Preparación del dispositivo PDMS para la captura de varias células individuales
- Colocar el molde de oblea y la placa de pesaje que contiene 100 ml de triclorosilano en un desecador (solo para la silanización) y aplicar un vacío (-85 kPa) durante 15 minutos.
NOTA: Silanize la superficie de la oblea con triclorosilano para crear propiedades de superficie hidrófobas antes de la fundición PDMS para que pueda ser pelada sin esfuerzo desde el molde PDMS de oblea. - Detenga la aspiradora y, a continuación, silanize el molde de oblea en el desecador (sólo para la silanización) a 37 oC durante al menos 1 h.
- Combine la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de 10:1. Vierta un total de 20 g de PDMS mezclados en el molde de obleas en un plato de 15 cm.
- Coloque el plato de 15 cm en un desecador y aplique vacío (-85 kPa) durante 1,5 min. A continuación, retire el plato de 15 cm del desecador. Mantener durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por último, elimine las burbujas de aire residuales en PDMS con gas nitrógeno.
- Colocar el plato de 15 cm en un horno a 65oC durante 2-4 h para curar PDMS.
- Retire la réplica PDMS del molde de oblea y, a continuación, golpee una entrada de 1,5 mm y una salida de 0,5 mm en el PDMS utilizando un diámetro interior de 1,5 mm y un punzonador de diámetro interior de 0,5 mm(figura 1C).
- Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la corredera con cinta extraíble y, a continuación, trate la superficie con plasma de oxígeno (100 W durante 14 s).
- Alinee manualmente las réplicas de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí.
- Coloque la diapositiva PDMS en un horno de 65 oC durante 1 día.
NOTA: Se logra la unión permanente entre la diapositiva y la réplica de PDMS para formar el dispositivo. - Sumerja el dispositivo PDMS en un recipiente lleno de solución salina tamponada de fosfato y colóquelo en un desecador. A continuación, aplique vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.
- Coloque el dispositivo PDMS en una campana de cultivo celular y esterilice el dispositivo con luz UV (longitud de onda de luz: 254 nm) durante 30 min.
- Sustituya el búfer del dispositivo PDMS por un medio (medio basal DMEM-F12 que contenga un 1% de antibióticos y un 10% de suero bovino fetal) e incubar el dispositivo PDMS a 4oC durante 1 día. Esto evita que las celdas se adhieran a la superficie de PDMS.
3. Preparación de una suspensión de una sola célula
NOTA: Los tipos de células incluyen células endoteliales linfáticas humanas (LEC), células humanas OSCC TW2.6 que expresan el ARNS específico de WNT5B (WNT5B sh4) y el control vectorial (pLKO-GFP) que se obtuvieron de nuestro estudio anterior15. Consulte nuestra publicación anterior para conocer los pasos detallados del cultivo.
- Retire el medio de cultivo cuando las células alcancen un 70-80% de confluencia. Luego lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.
- Añadir 1 ml de medio DMEM-F12 que contenga 1 tinte fluorescente M en células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (utilice el medio MV2 para LEC) y luego incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Los LEC se tiñieron con el diacetato de clorometilfluoresceína verde (CMFDA) Tinte, las células WNT5B sh4 se teñieron con azul 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC) Las células de tinte y pLKO-GFP se tejieron con tinte fluorescente Dil rojo. - Lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.
- Retire el PBS y agregue 2 mL de 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA para LECs).
- Incubar las células durante 4 minutos a temperatura ambiente y luego toque suavemente el plato de cultivo de tejido para promover el desprendimiento de células.
- Añadir 4 ml de dMEM-F12 medio para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (para leC sutilizan 3 ml de medio MV2 y 1 ml de solución neutralizadora de trippsina). A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 3 minutos.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio DMEM-F12 suavemente. Cuente el número de celdas vivas en un hemocofómetro utilizando el método de exclusión estándar Trypan Blue16. Prepare 1 ml de suspensión celular a 3 x 105 células/ml de concentración en medio DMEM-F12, y luego mantenga las células en hielo para evitar la agregación celular.
NOTA: Para mejorar la eficiencia de captura de una sola célula, se requiere una preparación cuidadosa de la suspensión de una sola célula con una sola disociación.
4. Captura múltiple de una sola célula y triple cultivo de una sola célula
- Conecte un tubo de politetrafluoroethene (PTFE) entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue 1 l de suspensión celular a una concentración de 3 x 105 celdas/ml en la entrada del dispositivo PDMS.
- Cargue la suspensión de la célula en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2A). La dirección del flujo es desde la entrada hasta la salida.
NOTA: Cargue inmediatamente después de agregar la suspensión celular en la entrada para evitar la sedimentación celular. - Añadir 1 l de medio DMEM-F12 a la entrada del dispositivo PDMS después del paso 4.2.Cargue el medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2B). La dirección del flujo fluyó de la entrada a la salida.
- Cargar 0,3 l de medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 10 l/min(figura 2C). La dirección del flujo fluyó desde la salida hasta la entrada.
- Repita los pasos 4.1 a 4.4 para cargar otros tipos de celda en el dispositivo.
- Después de completar la captura celular, utilice un microscopio con lente 4x para crear imágenes de cada cámara de cultivo.
NOTA: Las emisiones de fluorescencia de las células se utilizaron para identificar y contar el número de células individuales en cada cámara de cultivo. - Retire el tubo de PTFE y selle la entrada y la salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado.
- Mueva el dispositivo PDMS a una placa de cultivo de 10 cm y agregue 10 ml de PBS estéril alrededor del dispositivo PDMS para evitar la evaporación del medio del dispositivo.
- Transfiera el plato de cultivo a una incubadora (37oC, 5% CO2 y 95% de humedad) para un cultivo triple de una sola célula.
- Observar y fotografiar microscópicamente el crecimiento celular cada 12 h.
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Representative Results
El dispositivo tiene una estructura de tres capas como se muestra en la fotografía transversal de un dispositivo PDMS cortado(Figura 1A). La primera capa contiene un sitio de captura (6,0 m de ancho y 4,6 m de altura) que conecta la cámara de cultivo y el canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación hace que las celdas fluyan hacia la posición de captura y llenen la entrada de la pequeña trayectoria. Después de que una célula se captura en la posición de captura, la resistencia de flujo de la trayectoria pequeña se incrementa, haciendo que la siguiente celda entrante vaya hacia y a través del canal de derivación al siguiente sitio de captura descendente. El diseño de la serpentina del canal de derivación (25,0 m de ancho y 26,4 m de altura) de la segunda capa se utiliza para aumentar su resistencia al flujo. Las dimensiones de la cámara de cultivo en la tercera capa (500,3 m de diámetro y 111,3 m de altura) están diseñadas para proporcionar suficiente espacio para el experimento de cultivo celular y para reducir el caudal en la cámara para evitar que las células se expulsen de la cámara.
Las herramientas necesarias para el procedimiento de operación(Figura 2)son comunes en laboratorios generales, incluyendo microscopio, bomba de jeringa, jeringa de vidrio, tubo centrífugo, tubo y pipeta. El dispositivo es de aproximadamente 1/5 de un cubreobjetos con un espesor de 2 mm y es adecuado para observar bajo un microscopio con lente de 4x a 20x. Con este método, un tipo para celdas individuales se puede capturar en las cámaras de cultivo de menos de 7 min, por lo que el tiempo total de operación para las celdas individuales triples fue inferior a 21 min. Las eficiencias de captura de una sola célula de las tres células demostradas fueron del 70,83% al 15,42% (LEC), del 73,96% al 14,09% (WNT5B sh4) y del 78,13% al 3,13% (pLKO-GFP), respectivamente. La eficiencia de captura de tres células individuales fue del 47,92% a 7,86%(Figura 3B). El paso de operación de reflujo se utiliza para liberar las celdas de los sitios de captura simultáneamente y fluir las celdas en las cámaras de cultivo(Figura 2C). Durante este proceso, si una célula no se libera de su sitio de captura, la celda liberada en su sitio de captura aguas abajo no entrará en la cámara de cultivo debido a que el canal de derivación tiene una resistencia de flujo menor que la cámara de cultivo. Esta es la razón principal por la que el HSC tiene una eficiencia de captura de una sola célula triple de sólo 47,92 a 7,86%, que sigue siendo significativamente mayor que la probabilidad de una distribución de Poisson (5%).
Los resultados del cultivo celular mostraron que múltiples cocultivos de células unicas de células endoteliales linfáticas y células cancerosas escamosas se pueden realizar durante 24 h, y la proliferación y morfología de las células se puede observar bajo el microscopio(Figura 4, Videos Suplementarios 1-3). En presencia de células pLKO-GFP, las células WNT5B sh4 y los LEC mostraron una mejor capacidad proliferativa y mostraron que la morfología se acercaba a lamellipodia. Estos resultados demuestran la capacidad de este dispositivo para capturar de alta eficiencia varios tipos de celdas individuales en una cámara de cultivo y proporcionan un espacio de referencia cultural suficiente útil para estudiar múltiples interacciones de tipo de celda única.
Figura 1: Fotografía y microscopio Imágenes de chip de cierre hidrodinámico. (A) Imagen del microscopio de la vista seccional PDMS. (B) Una unidad de reventado de una sola celda de vista ampliada. (C) Apariencia del chip que contiene 48 unidades. Barra de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de operación del chip de cierre hidrodinámico. (A) Debido a la alta resistencia hidrodinámica del canal de derivación, una sola célula está atrapada en el sitio de captura. (B) Después de que la primera celda está atrapada y ha ocluido el sitio de captura, las siguientes celdas fluyen hacia el canal de derivación debido al aumento de la resistencia al flujo. Utilice medio para lavar las células restantes en el canal. (C) Reflujo de la célula a la cámara de cultivo. Barra de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Eficiencia de captura de células únicas de LECs, WNT5B sh4 y pLKO-GFP en el chip de cierre hidrodinámico. (A) Imagen del microscopio de las células individuales triples capturadas en la cámara de cultivo. (B) Las barras verdes, azules y rojas representan la eficiencia de captura de celdas individuales, respectivamente, y las barras amarillas representan la eficiencia de captura de la triple célula. Barra de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cocultivo de célula única emparejado y cocultivo de triple célula única en el chip de cierre hidrodinámico durante 24 horas. (A) Imagen del microscopio de cocultivo de células individuales triples para 0, 12 y 24 h. (B) Imagen del microscopio de cocultivo de células pLKO-GFP y WNT5B sh4 para 0, 12 y 24 h. Los LECs se teñiron con tinte CMFDA verde, las células WNT5B sh4 se tejieron con tinte CMAC azul y se tiñieron cMAC teñidas azules y se tiñieron cMAC teñidas azules y se tiñen con tinte CMAC azul y se tiñeron con tinte CMAC azul y se tiñe con tinte CMAC azul y se tiñe con tinte CMAC azul y se tiñó cMAC azul y se tiñó CMAC teñidos azules y se tiñeron con tinte CMAC azul y se tiñaron cMAC teñidos azules y se tiñen con tinte CMAC azul y se tiñó CMAC dye azul y se tiñe con tinte CMAC azul y se tiñó CMAC dye azul y se tiñe con tinte CMAC azul y Las células pLKO-GFP se teñieron con un tinte fluorescente DiI rojo. Barra de escala: 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo suplementario 1: Carga de celdas. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).
Vídeo Suplementario 2: Reflujo celular. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).
Vídeo suplementario 3: Reflujo de tipo de segunda célula en la cámara de cultivo. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Las interacciones intercelulares de varias células en el microambiente tumoral juegan un papel importante en la progresión del tumor17. Para comprender el mecanismo de las interacciones célula-célula, los sistemas de cocultivo se utilizan como un método analítico común. Sin embargo, múltiples tipos de células y la heterogeneidad de las propias células han llevado a complejidad experimental y dificultades analíticas.
El chip de cierre hidrodinámico permite la carga de múltiples células individuales en la cámara de cultivo por un método determinista, sin estar limitado por la limitación de distribución de Poisson en el método de dilución y la plataforma de micropoque. Al proporcionar una alta eficiencia de captura de una sola célula triple (superior al 45%, el método de distribución de Poisson es del 5%) y demostrando que en la cámara de cultivo, el espacio es suficiente para el crecimiento celular y la proliferación(Figura 4). Debido a su capacidad para realizar de manera eficiente múltiples capturas de una sola célula y observaciones de cultivo de células en vivo con una configuración y protocolo simples, concebimos estos dispositivos microfluídicos como herramientas útiles para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo células celulares interacciones entre múltiples células18,detección de drogas19,y biología del cáncer20. Por otro lado, la estructura del dispositivo es moldeable, y la estructura y el tamaño del sitio de captura se pueden cambiar y aplicar a otros campos como microorganismos y células vegetales. En teoría, nuestro método también es adaptable para establecer y rastrear cocultivos microbianos (por ejemplo, bacterias, levaduras, etc.).
La principal limitación de este enfoque es que el nivel de precisión requerido para la fabricación del dispositivo es alto. Esto se debe principalmente a que la resistencia de flujo del canal más pequeño se puede cambiar drásticamente si sus dimensiones fabricadas se desplazan ligeramente. El control de las resistencias de los microcanales es crucial para la captura de una sola célula de alta eficiencia del dispositivo. Por otro lado, durante el cultivo celular, no hay cierre entre las cámaras. Por lo tanto, la secreción paracrina de células en la cámara puede propagarse a otras cámaras para afectar a otras células. Por último, se debe prestar atención a la limpieza del canal y del tubo durante la preparación del dispositivo. El medio de cultivo y cualquier búfer utilizado en el experimento deben filtrarse para evitar que las partículas y los desechos bloqueen el canal.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (105-2628-E-400-001-MY2), y el Programa de Doctorado en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, national Chung Hsing University e National Health Research Institutes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
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