Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

एनईएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

हम एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा एनओएमओ के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन के संरचना निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तरीकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के साथ-साथ सफल क्रिस्टल अनुकूलन और प्रोटीन के संरचना निर्धारण के लिए रणनीतियां शामिल हैं।

Abstract

NEMO एक मचान प्रोटीन है जो किनेस IKKα और IKKο के साथ IKK-परिसर कोडांतरण द्वारा एनएफ-बी मार्ग में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। सक्रियण पर, आईकेके कॉम्प्लेक्स फॉस्फोरेलेट्स IFB अणुओं को एनएफ-बी परमाणु स्थानांतरण और लक्ष्य जीन की सक्रियता के लिए अग्रणी बनाता है। निमो/आईकेके इंटरैक्शन का अवरोध एनएफ-बी पाथवे गतिविधि के मॉड्यूलेशन के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय प्रतिमान है, जिससे निमो अवरोधक डिजाइन और खोज के लिए एक लक्ष्य बन गया है । निमो अवरोधकों की खोज और अनुकूलन की प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए, हमने निमो के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का एक बेहतर निर्माण इंजीनियर किया जो एपीओ रूप में प्रोटीन के संरचना निर्धारण के लिए अनुमति देगा और छोटे आणविक वजन अवरोधकों से बंधे। यहां, हम निमो के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन के डिजाइन, अभिव्यक्ति और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उपयोग की गई रणनीति प्रस्तुत करते हैं। प्रोटीन ई. कोलाई कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जो डेन्टुरिंग स्थितियों के तहत घुलनशील होता है और तीन क्रोमेटोग्राफिक चरणों के माध्यम से शुद्ध होता है। हम संरचना निर्धारण के लिए क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण रणनीतियों का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल NEMO और छोटे अणु अवरोधकों के परिसरों की संरचना निर्धारण के लिए व्यापक प्रयोज्यता मिल जाएगा ।

Introduction

भड़काऊ और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, सेल डेथ या अस्तित्व और प्रसार1के लिए जिम्मेदार लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए साइटोकिन्स, माइक्रोबियल उत्पादों और तनाव सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में एनएफ-बी बी मार्ग सक्रिय होता है। भड़काऊ और ऑटोइम्यून रोगों और कैंसर2,3,4,5 सहित विकृतियों को मार्ग के हाइपरएक्टिवेशन से सहसंबद्ध किया गया है, जिसने एनएफ-बी गतिविधि के मॉड्यूलेशन को नए उपचारों के विकास के लिए एक प्रमुख लक्ष्य बना दिया है6,7।

विशेष रूप से विहित एनएफ-बी मार्ग को गैर-विहित मार्ग से प्रतिष्ठित किया गया है, जो लिम्प्रोगेनोजेनेसिस और बी-सेल सक्रियण के लिए जिम्मेदार है, मचान प्रोटीन नीमो (एनएफ-बी आवश्यक मॉड्यूलेटर8)पर पूर्व की निर्भरता के द्वारा किनास IKKα और IKKο के साथ आईसीएके-कॉम्प्लेक्स की असेंबली के लिए। आईकेके कॉम्प्लेक्स IinBα (IB के अवरोधक) के फॉस्फोरिलाइजेशन के लिए जिम्मेदार है जो इसे गिरावट के लिए लक्षित करता है, एनएफ-बी डिमर्स को जीन ट्रांसक्रिप्शन1 के लिए नाभिक में स्थानांतरित करने के लिए मुक्त करता है और इसलिए एनएफ-बी गतिविधि को संग्राहक करने के लिए अवरोधकों के विकास के लिए एक आकर्षक लक्ष्य है।

हमारा शोध निमो और IKKο के बीच प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है, जो IKK परिसर गठन के छोटे अणुओं अवरोधकों के विकास के लिए निमो को लक्षित करता है। IKKο को बांधने के लिए आवश्यक निमो का न्यूनतम बाध्यकारी डोमेन, अवशेषों को 44-111 शामिल करता है, और इसकी संरचना को IKKο अनुक्रम 701-7459के अनुरूप पेप्टाइड के साथ जटिल रूप से निर्धारित किया गया है। NEMO और IKKο एक चार हेलिक्स बंडल बनाते हैं जहां NEMO डिमर एक विस्तारित इंटरैक्शन इंटरफेस के साथ एक विस्तारित खुली नाली में IKKο (701-745) के दो हेलीज को समायोजित करता है। IKKο (734-742), जिसे नीमो-बाध्यकारी डोमेन (एनबीटी) के रूप में भी जाना जाता है, बाध्यकारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण हॉट-स्पॉट को परिभाषित करता है, जहां दो आवश्यक ट्रिप्टोफंस (739,741) निमो जेब के भीतर गहराई से दफनाते हैं। जटिल संरचना का विवरण एनएमओ को लक्षित करने वाले छोटे अणु अवरोधकों के संरचना-आधारित डिजाइन और अनुकूलन में सहायता कर सकता है। इसके साथ ही, यह मुश्किल है कि एक छोटे अणु या पेप्टाइड के बंधन NEMO में पूर्ण संरचना परिवर्तन विश्राम होगा (यानी, NEMO कुंडलित कुंडल-कुंडल डिमर के व्यापक उद्घाटन) लंबे IKKο (701-745) के बंधन के कारण, के रूप में क्रिस्टल में मनाया, और अबाध्य NEMO या NEMO की संरचना एक छोटे अणु अवरोधक के लिए बाध्य

आईकेआर-बाध्यकारी डोमेन को शामिल करने वाले पूर्ण लंबाई नीमो और छोटे ट्रंकेशन निर्माण एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) विधियों10के माध्यम से अनबाउंड रूप में संरचना निर्धारण के लिए असभ्य साबित हुए हैं, जिसने हमें एनओएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का एक बेहतर संस्करण डिजाइन करने के लिए प्रेरित किया। दरअसल, अनबाउंड रूप में निमो (44-111) केवल आंशिक रूप से मुड़ा हुआ है और प्रवर्तक आदान-प्रदान से गुजरता है और इसलिए हम IKKο के लिए बाध्यकारी आत्मीयता को संरक्षित करते हुए अपनी मंद संरचना, कुंडलित-कुंडली गुना और स्थिरता को स्थिर करने के लिए तैयार हैं। प्रोटीन के एन-और सी-टर्मिनी में आदर्श डिमेरिक कॉइल-कॉइलदृश्यों 11 के तीन हेप्टाड को जोड़कर, और चार सूत्री म्यूटेशन की एक श्रृंखला, हमने निमो-ईईएए उत्पन्न की, जो पूरी तरह से मंद और एक कुंडलित कुंडली में मुड़ा हुआ है, जिसने पूरी लंबाई NEMO12के लिए मनाया गया नैनोमोलर रेंज के लिए IKK-बाध्यकारी आत्मीयता को बचाया। एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, हमें आशा है कि कुंडलित-कुंडली एडाप्टर (जीसीएन4 अनुक्रम के आधार पर) क्रिस्टलीकरण की सुविधा होगी और अंततः आणविक प्रतिस्थापन के माध्यम से एक्स-रे संरचना निर्धारण में सहायता करेगा। कुंडलित-कुंडलित एडाप्टर का उपयोग इसी प्रकार स्थिरता बढ़ाने, समाधान व्यवहार में सुधार करने और ट्रिमेरिक कुंडलित कुंडल और एंटीबॉडी टुकड़ों13,14के लिए क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए किया गया है। NEMO-EEAA आसानी से व्यक्त किया जाता है और एस्चेरिचिया से शुद्ध किया जाता है। कोलाई कोशिकाएं एक क्लेवबल हिस्टिडीन टैग के साथ, घुलनशील है, एक स्थिर मंद कुंडलित कुंडलित कुंडली में मुड़ा हुआ है और आसानी से क्रिस्टलीकृत है, जिसमें 1.9 Å तक विवर्तन होता है। जीसीएन4 के आदेश ित कुंडलित-कुंडलक्षेत्रों की उपस्थिति जीसीएन415की ज्ञात संरचना का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा एनएमओ-ईईएए के क्रिस्टल से डेटा को चरणबद्ध रूप से चरणबद्ध रूप से चरणबद्ध रूप से प्राप्त करने में सहायता कर सकती है।

एपीओ-NEMO-EEAA के साथ प्राप्त परिणामों को देखते हुए, हमारा मानना है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी छोटे पेप्टाइड्स (NBD पेप्टाइड की तरह) या छोटे अणु अवरोधकों की उपस्थिति में NEMO-EEAA के क्रिस्टलीकरण के लिए लागू किया जा सकता है, NEMO अवरोध और संरचना के लिए आवश्यकताओं को समझने के लक्ष्य के साथ उच्च समृद्धि के लिए प्रारंभिक सीसा अवरोधकों के अनुकूलन आधारित । कई कुंडलित-कुंडलित डोमेन16की प्लास्टिसिटी और गतिशील प्रकृति को देखते हुए, कुंडलित-कुंडली अनुकूलकों के उपयोग से संरचनात्मक निर्धारण को सहायता करने में अधिक सामान्य प्रयोज्यता मिल सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. क्रिस्टलोग्राफी के लिए निर्माण का डिजाइन

  1. एक एन-टर्मिनल हेक्सा-हिस्टीडीन टैग और एक शागिर्द दरार साइट सहित टी 7 प्रमोटर का उपयोग करई कोलाई में अभिव्यक्ति के लिए एक वेक्टर में पिछले प्रकाशन 12 में पिछले प्रकाशन12 में NEMO-EEAA के अनुक्रम क्लोन ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, हमने एन-टर्मिनल हेक्सा-हिस्टिडीन टैग और तंबाकू ईट वायरस (टीईवी) क्लीवेज साइट10शामिल करने के लिए संशोधित एक वेक्टर का उपयोग किया। यह वेक्टर प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए अपने टैग के दरार की सुविधा देता है और वांछित प्रोटीन अनुक्रम की शुरुआत से पहले केवल जीएसडब्ल्यू अवशेषों का छोटा विस्तार छोड़ देता है। वेक्टर जिससे यह प्राप्त किया गया था, और वैकल्पिक वेक्टर सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं। इस प्रोटोकॉल में, मूल NEMO (44-111) अनुक्रम में बाद के संशोधनों को स्टेपवाइज पेश किया गया था, जैसा कि पहले10वर्णित था, पक्ष निर्देशित म्यूटाजेनेसिस का उपयोग करके। हमने शुरू में एन-टर्मिनल या सी-टर्मिनल अंत या दोनों के लिए आदर्श कुंडलित-कुंडली एडाप्टर (कम से कम तीन हेप्टाड की लंबाई में) को स्थिर करने का प्रयास किया। डबल कुंडलित कुंडली पहले क्रिस्टलीकरण परीक्षणों से सबसे आशाजनक थी और बाद में इसे क्रिस्टलीकरण में सुधार करने के लिए उत्परिवर्तन शुरू करने में संशोधित किया गया था जैसा कि पहले12वर्णित है ।

2. अपने6 टैग NEMO-EEAA की बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति

  1. निर्माण को BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं में बदलें। सेल ग्लाइसेरोल स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 1 दिन - एक सेल स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। एक १२५ mL Erlenmeyer फ्लास्क में, भयानक शोरबा समाधान के 20 mL और एक १०० मिलीग्राम/Ampicillin के mL स्टॉक के 20 μL जोड़ें । वेक्टर के साथ तब्दील होने वाली BL21 (DE3) सक्षम कोशिकाओं के -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण (से- 80 डिग्री सेल्सियस) सेल ग्लिसरोल स्टॉक के कुछ माइक्रोलीटर जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 220 आरपीएम (लगभग 15 घंटे) पर रात भर 10 मिलीएल स्टार्टर संस्कृति हिलाएं।
  4. 2 दिन - स्टार्टर से, भयानक शोरबा के 250 मीटर में एक ओडी600 = 0.1 को पतला करें। 100 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में एम्पिसिलिन जोड़ें। एक ओडी600 = 0.8-1.0 के लिए बढ़ो।
    1. आइसोप्रोपिल को 500 माइक्रोन में आइसोप्रोपिल-डी-1-थिओगलक्टोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए बढ़ें।
    2. उपाय OD600 प्रेरित संस्कृति के बाद 4 एच संस्कृति एक ओडी600 = 6-10 तक पहुंचना चाहिए.

3. उनके6 टैग NEMO-EEAA की शुद्धि

  1. स्पिन सेल संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 3,800 x ग्राम नीचे।
  2. सेल पैलेट को बचाएं और माध्यम को त्याग दें।
    नोट: सेल गोली को बाद में शुद्धिकरण के लिए इस बिंदु पर -20 डिग्री सेल्सियस पर सहेजा और संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल, 2 एमएम एमजीसीएल2,0.5 एम एम फिनाइलमिथिलसुलफॉइल फ्लोराइड, 2 एम एम डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी), और बेंजोनास न्यूलीज के 3 माइक्रोन लमेंट्स में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: निकेल स्थिर धातु आयन एफ़िनिटी क्रोममेटोग्राफी (आईमैक) कॉलम का उपयोग 2 एमएम डीटीटी के साथ संगत है। वैकल्पिक रूप से, 0.2 एमएम ट्रिस (2-कार्बोसेथिल) फॉस्फिन (टीसीईपी) का उपयोग किया जा सकता है।
  4. दो 20-25 mL aliquots में विभाजित कोशिकाओं को निलंबित कर दिया।
  5. फ्रांसीसी प्रेस (अनुमानित दबाव 25,000 साई) का उपयोग करके कोशिकाओं को लाइसे, प्रत्येक एलिकोट (ठंडे कमरे में) के लिए 2-3 बार दोहराना।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को सोनिकेशन (इस प्रोटोकॉल में परीक्षण नहीं) द्वारा किया जा सकता है।
  6. 8 मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल लिसेट में यूरिया जोड़ें, कम से कम 2 घंटे या रात तक के लिए एक कमाल के मंच पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। यह और सभी निम्नलिखित शुद्धिकरण कदम, डायलिसिस के अपवाद के साथ, कमरे के तापमान पर किया जा सकता है।
  7. तीसरा दिन - लाइसेट को अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज ट्यूब और बैलेंस वेट में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि लाइसेट ट्यूबको कम से कम 3/4 पूर्ण तक भरता है। 45 मिन के लिए 125,000 x ग्राम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर लाइसेट स्पिन करें। कॉलम पर लोड करने के लिए एक 100 मीटर बीकर में अधिनात को डिडेंट करें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइजिंग यूरिया के कारण बाहर निकल जाएगा।
  8. एक तेज तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली पर, 5 मीटर/मिन पर अल्ट्राप्योर एच2ओ के 25 मिलील के साथ आईमैक 5 एमएएल कॉलम से इथेनॉल निकालें, इसके बाद 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 500 एमएम इमिडाजोल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0, फिर 20 एमएम ट्रिस, 150 मीटर एम एनएसीएल, 10 एम एम इमिडाजोल, 2 एमएम डीटीटी, 8 एम यूरी, पीएच 80 युक्त एलुशन बफर का 25 मिलील, पीएच 8 0
  9. लोड यूरिया इनक्यूबेटेड सुपरनेटेंट पर 3 mL/min IMAC कॉलम पर, के माध्यम से प्रवाह का संग्रह । 3 mL/min पर बाध्यकारी बफर के साथ 10 कॉलम संस्करणों के लिए कॉलम धोएं ।
  10. 3 mL/min पर 20 कॉलम वॉल्यूम के लिए रीफोल्डिंग बफर के साथ कॉलम धोने के द्वारा कॉलम पर रीफोल्ड करें, जिसमें 20 मीटर ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 10 एम एम इमिडाजोल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0 शामिल हैं।
  11. 12-कॉलम वॉल्यूम ग्रेडिएंट पर 10 से 500 एमएम इमिडाजोल से नेमो-ईईएए के ढाल एलुशन का प्रदर्शन करें, अंश संग्रह प्लेट (1 एमएल अंश) में सभी एल्यूएट एकत्र करें।
  12. दो कॉलम वॉल्यूम के लिए 500 mM इमिडाजोल पर एल्यूशन जारी रखें, इकट्ठा करना जारी रखें।
  13. एल्यूशन अंशों में निमो-ईईएए उपस्थिति निर्धारित करने के लिए अंशों के सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडी) - पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) चलाएं।
    नोट: हम 10% एक्रिलामाइड, एमईएस बफर का इस्तेमाल किया ।
  14. शुद्ध लक्ष्य प्रोटीन युक्त पूल अंश।
  15. ब्रैडफोर्ड परख17द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
    नोट: टैग क्लीवेज के लिए प्रोटीज़ की मात्रा का अनुमान लगाना आवश्यक है।

4. उसका6 टैग दरार और शुद्धि

  1. TEV के एक 1:10 वजन अनुपात में TEV जोड़ें: NEMO-EEAA प्रोटीन अपने6 टैग क्लीव करने के लिए । टीईवी प्रॉटीज़ को घर में शुद्ध किया गया था।
    नोट: पूर्ण दरार के लिए आवश्यक टीईवी, समय और तापमान की मात्रा को अलग से अनुकूलित करें।
    1. एक्सप्रेस TEV प्रोटीज़, BL21 (DE3) में S219V उत्परिवर्ती18-RIL कोशिकाओं और शुद्ध के रूप में पहले19वर्णित है । संक्षेप में कोशिकाओं के रूप में चरण 2 में वर्णित हो जाना, फ्रेंच प्रेस द्वारा lyse और एक IMAC कॉलम का उपयोग कर शुद्ध । 25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.8, 150 एमएम एनसीएल, 1 एमएम ईटीए, 2 एमएम डीटीटी, 20% v/v ग्लाइसेरोल में फाइनल प्रोटीन स्टोर करें।
  2. 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0 के 4 एल में नमूना रातोंरात (लगभग 15 घंटे) को उबालकर, दरार के लिए अनुमति देने और बाद में शुद्धिकरण के लिए नमूने से अतिरिक्त इमिडाजोल को हटाने के लिए।
  3. 4 दिन - डायलिसिस से नमूना निकालें। क्लीवेज पूरा हो गया है सुनिश्चित करने के लिए TEV दरार से नमूने का एक एसडीएस-पेज जेल चलाएं।
  4. एक तेज तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली पर, 5 मीटर/मिन पर अल्ट्राप्योर एच2ओ के 25 मिलील के साथ आईमैक 5 मिलीएल कॉलम से इथेनॉल निकालें, इसके बाद 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 500 एमएम इमिडाजोल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0, फिर 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0 युक्त एलुशन बफर का 25 मिलील।
  5. TEV-cleaved NEMO-EEAA के साथ 1 mL/min पर कॉलम लोड करें । क्लीव्ड निमो-ईईएए प्रवाह-थ्रू में एकत्र होगा: 96 अच्छी तरह से अंश संग्रह प्लेट (1 एमएल अंश) में एकत्र करें। 20 एमएम ट्रिस, 150 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल के पांच कॉलम वॉल्यूम के लिए कॉलम को 1 एम/मिन में धोएं, जो अंश संग्रह प्लेट में इकट्ठा करना जारी रखता है ।
  6. Elute TEV और 20 mM Tris, १५० mM NaCl, ५०० mM imidazole, 2 m DTT, पीएच ८.० के तीन कॉलम संस्करणों के साथ अपने 6-NEMO-EEAA चाचा, एक ५० mL कुप्पी में elution इकट्ठा ।
  7. क्लीव्ड निमो-ईईएए की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए प्रवाह-थ्रू अंशों के एसडीएस-पेज जेल चलाएं।
  8. पूल प्रवाह के माध्यम से क्लीव्ड NEMO-EEAA निर्माण युक्त अंशों, और 5 mL के लिए एक उभारा सेल केंद्रित का उपयोग कर ध्यान केंद्रित । झिल्ली आणविक वजन कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) = 3 केडीए।
  9. एक 3 केडीए MWCO झिल्ली का उपयोग करना, 20 एमएम Tris के 2 एल में डायलिसि केंद्रित नमूना, १०० mM NaCl, 2 mM DTT, पीएच 8.0 के लिए 2 घंटे के लिए । डायलिसिस बफर को रात भर डायलिसिस बफर के लिए ताजा डायलिसिस बफर (लगभग 15 घंटे) के लिए 2 एल में बदलें, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
  10. दिन 5 - एक आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) 16 मिमी x 60 सेमी कॉलम (34 माइक्रोमीटर औसत कण आकार) पर 2 एमएम ट्रिस, 100 एमएम नैल, 2 एम एम डीटीटी, पीएच 8.0 पर डायलाइज नमूना का लोड 5 मिलीएल। नमूना मात्रा के आधार पर अतिरिक्त स्तंभों के साथ दोहराएं।
  11. मंदनिमो-ईईएए के अनुरूप अंशों को पूल करें।
    नोट: निमो-ईईएए 60-65 मिलील के बीच बढ़ जाता है, जो एक बड़े आणविक वजन प्रोटीन के अनुरूप होता है, जो मंदकुंडली कुंडलित कुंडली की विस्तारित प्रकृति के कारण होता है।
  12. एक उभारा सेल केंद्रित कर्ता और एक MWCO = 3 केडीए झिल्ली का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करें 113 माइक्रोन (1.65 मिलीग्राम/mL) की अंतिम एकाग्रता के लिए।
  13. अलीकोट प्रोटीन और स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस (1 महीने से अधिक के लिए स्थिर) पर स्टोर करें।

5. विरल मैट्रिक्स स्क्रीनिंग

नोट: प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीन का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण परीक्षण करता है और क्रिस्टलीकरण रोबोट का उपयोग करके बैठे ड्रॉप प्रयोगों की स्थापना करता है। क्रिस्टल छवियों को स्वचालित रूप से एक इमेजर द्वारा एकत्र किया जाता है।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरल मैट्रिक्स स्क्रीन का उपयोग करना (सामग्री की तालिकादेखें), एक 2 ड्रॉप-चैंबर क्रिस्टलीकरण प्लेट के 96 कुओं में से प्रत्येक में स्पर्स मैट्रिक्स समाधान के पिपेट 60 μL बैठे ड्रॉप वाष्प प्रसार (जलाशय समाधान) के लिए।
  2. एक रोबोट ड्रॉप सेटर का उपयोग करना, २०० nL की एक अंतिम मात्रा के लिए ड्रॉप 1 में जलाशय समाधान के साथ एक 1:1 अनुपात में १.६५ मिलीग्राम/mL पर प्रोटीन समाधान के १०० nL बांटना; फिर ड्रॉप 2 (1:2 अनुपात) में 200 nL की अंतिम मात्रा के लिए जलाशय समाधान के 134 nL के साथ प्रोटीन समाधान के 66 nL।
  3. वितरण के तुरंत बाद 3 इंच चौड़े सीलिंग टेप का उपयोग कर प्लेट सील करें।
    नोट: बूंदें बाहर सूख जाएगा अगर 2-3 मिन से अधिक समय के लिए वातावरण के संपर्क में छोड़ दिया ।
  4. ट्रे को क्रिस्टलीकरण इमेजर स्टोरेज में स्टोर करें, 20 डिग्री सेल्सियस पर, क्रिस्टल उपस्थिति के लिए स्वचालित रूप से एकत्र की गई छवियों की जांच करें, दो दिनों के बाद शुरू करें।
    नोट: क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग निर्माण अनुकूलन के समानांतर आगे बढ़ी। निम्नलिखित स्थितियों में गठित प्रारंभिक क्रिस्टल (सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध वाणिज्यिक स्क्रीन): ए) 0.1 एम ट्रिस, पीएच 8.0, 30% v/v पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) एमएमई 550, 5% पॉली--ग्लूटामिक एसिड, 200-400 केडीए कम आणविक वजन बहुलक (पीजीए-एलएम); ख) 0.1 एम ट्रिस, पीएच 7.8, 20% w/v खूंटी एमएमई 2k, 5% पीजीए-एलएम; ग) 0.1 एम ट्रिस, पीएच 7.8, 20% w/v खूंटी 3350, 5% पीजीए-एलएम। विरल मैट्रिक्स स्क्रीन क्रिस्टल खराब जाली एकरूपता होगा; इसलिए, वे क्रॉस-पोलर्ड इमेजिंग का उपयोग करके खराब दिखेंगे। यह सुनिश्चित करने के लिए यूवी इमेजिंग का उपयोग करें कि क्रिस्टल में प्रोटीन हो। अंतिम विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित बीज स्टॉक उत्पादन चरण आवश्यक है।

6. बीज स्टॉक जनरेशन

नोट: हम 0.1 एम ट्रिस पीएच 8.0, 5% पीजीए-एलएम, 3.6% w/v खूंटी 20k में बीज उत्पादन के लिए क्रिस्टल प्राप्त करते हैं। हालांकि, क्रिस्टल उच्च मोज़ेकता दिखाएगा और इस स्तर पर डेटा संग्रह के लिए अनुपयुक्त हैं।

  1. बीज उत्पादन के लिए एक किट का उपयोग करना, क्रिस्टल वर्तमान के साथ पूरी बूंद बाहर pipetting द्वारा बीज स्टॉक तैयार है, और प्रदान की शीशी में क्रिस्टलीकरण हालत समाधान के ५० μL में जगह है ।
  2. भंवर 3 मिन के लिए बीज स्टॉक, स्पंदन 20 एस पर और 10 एस बंद ।
  3. 1:10 वेतन वृद्धि में क्रमिक रूप से कमजोर बीज स्टॉक 1:10,000 तक नीचे। आगे के उपयोग के लिए, सभी कमजोरियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. ठीक स्क्रीन

  1. डिजाइन ठीक स्क्रीन Tris, पीजीए-एलएम, और खूंटी के लिए शर्तों बदलती । अलग-अलग ट्रे के लिए खूंटी की लंबाई भिन्न करें।
    नोट: निमो-ईईएए के संरचना निर्धारण के लिए उपयोग किए गए क्रिस्टल का उत्पादन करने वाली ठीक स्क्रीन ने निम्नलिखित शर्तों को नियोजित किया: 0.1 एम ट्रिस पीएच 8; पीजीए-एलएम कॉलम 1-12 में 8 से 0% तक भिन्न होते हैं। पंक्तियों ए-एच ने विभिन्न पीईजी की जांच की, जिसमें सांद्रता कॉलम 1-12 में भिन्न होती है। एक: खूंटी २०० (0-40% v/v); बी: खूंटी 400 (0-40% v/v); सी: खूंटी MME ५०० (0-40% v/v); डी: खूंटी १००० (0-30% w/v); ई: खूंटी ३३५० (0-30% w/v); एफ: खूंटी 6k (0-30% w/v); जी: खूंटी 10k (0-20% w/v); एच: खूंटी 20k (0-20% w/v) । क्रिस्टल अच्छी तरह से H4 में दिखाई दिया (५.४५% w/v खूंटी 20k, ५.८% w/v पीजीए-एलएम) । इस प्रोटोकॉल में स्क्रीन बनाने के लिए प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी स्क्रीन बिल्डर लिक्विड हैंडलर का इस्तेमाल किया गया था।
  2. बीज 1:1,000 बीज कमजोर पड़ने के 1:25 मात्रा अनुपात में एक प्रोटीन स्टॉक।
    नोट: निमो-EEAA की एकाग्रता थोड़ा छोड़ देंगे, लेकिन क्रिस्टल अभी भी फार्म का होगा ।
  3. 1:10,000 बीज कमजोर पड़ने का उपयोग करके चरण 2 दोहराएं, वही 1:25 वॉल्यूम अनुपात।
  4. ड्रॉप सेटर का उपयोग करके, 1.65 मिलीग्राम/mL पर प्रोटीन समाधान के 100 nL को वितरित करें, बीज स्टॉक के 1:1,000 कमजोर पड़ने के साथ 1:1 अनुपात में जलाशय समाधान के साथ 1 बूंद में जलाशय समाधान के साथ 200 nL की अंतिम मात्रा के लिए। ड्रॉप 2 के लिए दोहराएं, लेकिन बीज स्टॉक के 1:10,000 कमजोर पड़ने के साथ मौजूद हैं।
  5. वितरण के तुरंत बाद 3 इंच चौड़े सीलिंग टेप का उपयोग कर प्लेट सील करें।
    नोट: बूंदें बाहर सूख जाएगा अगर 2-3 मिन से अधिक समय के लिए वातावरण के संपर्क में छोड़ दिया ।
  6. ट्रे को इमेजर स्टोरेज में स्टोर करें, 20 डिग्री सेल्सियस पर, क्रिस्टल उपस्थिति के लिए दो दिनों के बाद एकत्र की गई छवियों की जांच करें।
  7. जाली एकरूपता के लिए क्रॉस-पोलाराइजर इमेजर के साथ क्रिस्टल की जांच करें, ट्रे के बाद स्थापित करने के लिए एकल शर्तों के लिए चयन करें।

8. डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल की पीढ़ी

  1. ट्रिस, पीजीए-एलएम और खूंटी स्थिति के आसपास एकल शर्त स्क्रीन डिजाइन करें, जिसने क्रॉस-ध्रुवीकृत छवियों द्वारा विश्लेषण के रूप में समान क्रिस्टल का उत्पादन किया, और सबसे बड़ा क्रिस्टल संभव है।
    नोट: इन स्थितियों से क्रिस्टल आकार में अनियमित हैं, ज्यादातर आयताकार पतली चादरें । यह एक ऐसी स्थिति का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है जहां क्रिस्टल के किनारों को अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और सबसे बड़ी मोटाई संभव है।
  2. क्रिस्टलीकरण की स्थिति के 20 मीटर हाथ से बनाओ।
  3. एक बहु चैनल पाइपेटर का उपयोग करना, एक 2 ड्रॉप कक्ष में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से ६० μL बांटना, ९६ अच्छी तरह से ड्रॉप वाष्प प्रसार बैठे के लिए क्रिस्टलीकरण प्लेट ।
  4. चरण 6.2 में वर्णित बीज स्टॉक तैयार करें।
  5. चरण 6.3 में वर्णित प्रोटीन को वितरित करें।
  6. वितरण के तुरंत बाद 3 इंच चौड़े सीलिंग टेप का उपयोग कर प्लेट सील करें।
    नोट: बूंदें बाहर सूख जाएगा अगर 2-3 मिन से अधिक समय के लिए वातावरण के संपर्क में छोड़ दिया ।
  7. ट्रे को इमेजर में 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और हर दिन क्रिस्टल उपस्थिति के लिए छवियों की जांच करें।
  8. डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल का चयन करने के लिए, जाली एकरूपता के लिए क्रिस्टल की क्रॉस-ध्रुवीकृत छवियों की जांच करें।

9. क्रायो-रक्षक का निर्धारण

  1. क्रायो-प्रोटेक्टेंट्स का परीक्षण करने के लिए, क्रिस्टलीकरण की स्थिति के अनुरूप स्टॉक समाधान बनाएं, लेकिन जिसमें प्रत्येक घटक की 30%, 20%, 10%और 5% अधिक एकाग्रता होती है। क्रायो-प्रोटेक्टेंट वॉल्यूम के अलावा घटकों की अंतिम एकाग्रता होगी जो क्रिस्टलीकरण की स्थिति के समान है।
    नोट: 0.1 एम ट्रिस क्रिस्टलीकरण स्थिति के लिए मात्रा द्वारा 30% एकाग्रता पर क्रायो-प्रोटेक्टेंट का परीक्षण करने के लिए, क्रायो-प्रोटेक्ट जोड़ने से पहले 0.143 एम ट्रिस के स्टॉक समाधान के साथ शुरू करें।
  2. क्रायो-रिएजेंट्स किट से, मूल क्रिस्टलीकरण की स्थिति में 30% क्रायो-प्रोटेक्टेंट की अंतिम एकाग्रता के लिए क्रिस्टलीकरण स्थिति स्टॉक समाधान के 70% में क्रायो स्थिति की मात्रा द्वारा 30% मिश्रण करके क्रायो-प्रोटेक्टेंट परीक्षण के लिए 10 माइक्रोन बनाएं। अच्छी तरह मिला लें।
    1. 10 μL पिपेट का उपयोग करके, परीक्षण क्रायो-संरक्षित समाधान के 5 μL लें और तरल नाइट्रोजन में पिपेट टिप को डुबकी दें। यदि बर्फ देखी जाए तो त्याग दें।
    2. 30% पर सभी क्रायो-प्रोटेक्टेंट्स का परीक्षण करें। सफल समाधानों के लिए, प्रक्रिया को 20% पर दोहराएं, फिर क्रायो-प्रोटेक्टेंट के 10% और 5%।
    3. क्रायो-प्रोटेक्टिव के सबसे छोटे प्रतिशत के साथ सफल क्रायो-प्रोटेक्टिव समाधान का उपयोग करते हुए, मौजूद क्रिस्टल के साथ परीक्षण ड्रॉप में समाधान के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें, समय कितनी देर तक क्रिस्टल हालत में रहता है, नहीं तो अनिश्चितकालीन ।
      नोट: ये क्रिस्टल केवल परीक्षण के लिए हैं और उन्हें छोड़ दिया जाएगा। NEMO-EEAA के लिए, 12% 1,2-प्रोपेनेडियोल इष्टतम क्रायो-प्रोटेक्टेंट समाधान है। 10% के 1,2-प्रोपेनेडियोल की अनुमानित अंतिम एकाग्रता के लिए, लगभग 100 nL की क्रिस्टल ड्रॉप में जोड़े जाने पर क्रायो-प्रोटेक्ंट समाधान को कमजोर करने के लिए 12% खाते अनुभव करेंगे।

10. क्रिस्टल लूपिंग

  1. लूप क्रिस्टल सिंक्रोट्रॉन के लिए शिपमेंट से 1-2 दिन पहले।
    नोट: क्रिस्टल व्यास में लगभग 60-100 माइक्रोन होंगे: 0.05 - 0.10 मिमी लूप लूपिंग के लिए आदर्श हैं।
  2. कुएं के ऊपर से टेप काट लें।
  3. 12% 1,2-प्रोपेनेडियोल क्रायो-प्रोटेक्टिव युक्त क्रिस्टलीकरण समाधान के 0.5 माइक्रोन जोड़ें सीधे कुएं में।
    नोट: 1,2-प्रोपेनेडियोल की अंतिम एकाग्रता अब लगभग 10% पर है, ड्रॉप समाधान के 100 nL द्वारा कमजोर पड़ने के कारण (वाष्प प्रसार के कारण प्रारंभिक 200 nL से अनुमानित ड्रॉप वॉल्यूम में कमी)।
  4. कुएं से क्रिस्टल लूप करें।
    नोट: क्रिस्टल अक्सर अच्छी तरह से नीचे पर बढ़ने लेकिन पाश से एक कोमल नज के साथ उखाड़ फेंकना होगा । एक बार उखाड़ फेंकने के बाद लूप।
  5. तरल एन2में डूबे पक में क्रायो-लूप युक्त क्रिस्टल स्टोर करें।
  6. इन पकों को देवर फ्लास्क में तरल एन2 में स्टोर करें जब तक कि वे सिंक्रोट्रॉन में एक्स-रे विवर्तन के लिए शिपमेंट के लिए तैयार न हों।

11. डेटा संग्रह

  1. एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करें। इस प्रोटोकॉल में, AMX बीमलाइन (आईडी: 17-ID-1), राष्ट्रीय सिंक्रोट्रॉन लाइट सोर्स II का उपयोग करें।
    नोट: डेटा साइट पर एकत्र किया गया था, लेकिन दूर से एकत्र किया जा सकता है । क्रिस्टल के क्षेत्र में डेटा एकत्र करें जिसमें क्रॉस-ध्रुवीकृत छवियों में जाली एकरूपता दिखाई गई। लूप में क्रिस्टल की स्थिति ताकि डेटा संग्रह में क्रिस्टल के "गरीब" क्षेत्र शामिल न हो जबकि क्रिस्टल गोनिओमीटर में घूमता है। डेटा जो सबसे अच्छा संकल्प प्रदान की आकार में 5 x 5 μm के बारे में एक क्रिस्टल के विस्तार के किनारे पर संग्रह से आया था । क्रिस्टल पर सबसे अच्छे क्षेत्रों की पहचान करने के लिए20का उपयोग करें ।

12. एक्स-रे डेटा प्रोसेसिंग

  1. अंतरिक्ष समूह, इकाई सेल और विलायक सामग्री निर्धारित करने के लिए XDS IDXREF कार्यक्रम के साथ एकत्र किए गए उच्चतम रिज़ॉल्यूशन (1.8 Å) के लिए डेटासेट की प्रक्रिया करें।
  2. XDS एकीकृत कार्यक्रम का उपयोग कर डेटा को एकीकृत करें।
  3. प्रक्रिया STARANISO सर्वर का उपयोग कर XDS XSCALE कार्यक्रम से तीव्रता पहुंचा, मैं का उपयोग कर/डेटा के लिए विवर्तन सीमा सतह के लिए १.२ का मतलब है ।
    नोट: डेटा सच अंडाकार में कटौती नहीं की जाएगी । 1.2 कटऑफ के I/1I से ऊपर सभी डेटा बनाए रखें। गोलाकार पूर्णता के लिए गणना किए गए आंकड़ों के आंकड़े खराब होंगे, गैर-गोलाकार ट्रंकेशन के कारण। अंडाकार पूर्णता के उच्चतम संकल्प ों के साथ 88% था: क्रमशः 1.88 Å, 2.10 Å और 2.55 Å के साथ एक *, बी * और सी धुरी।

13. संरचना समाधान

  1. पीएचईनिक्स22में मैरेज21 का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन के लिए एक खोज मॉडल के रूप में जीसीएन4 (पीडीबी: 4डीएमडी)15 की एक्स-रे संरचना का उपयोग करें। 4डीएमडी संरचना को एमरेज में "कलाकारों की टुकड़ी" के रूप में परिभाषित किया गया था, और एमरेज समाधान ने सफलतापूर्वक एन-टर्मिनल कुंडलित-नीलक्टर के अनुरूप संरचना भाग का निर्माण किया, जो खोज मॉडल के मुताबिक़, डिमर में दोनों श्रृंखलाओं के लिए था।
    नोट: PHASER में एनिसोट्रोपी सुधार बंद करें, या डेटा को आगे वापस पहुंचा दिया जाएगा।
  2. संरचना के शेष का निर्माण करने के लिए फेनिक्स और मैनुअल बिल्डिंग (कूट24में 2एफओ-एफसी और एफओ-एफसी मानचित्रों का उपयोग करना) में ऑटोबिल्ड23 के लगातार दौर का उपयोग करें।
  3. कूट24का उपयोग करके 2Fo-Fc और एफओ-एफसी मानचित्रों के आधार पर मॉडल में अभी भी गायब अवशेषों का मैन्युअल रूप से निर्माण करें।
    नोट: अंतिम चरण में प्रत्येक मोनोमर के लिए 4 एन-टर्मिनल अवशेषों और 4 सी-टर्मिनल अवशेषों का निर्माण शामिल था। साइडचेन प्लेसमेंट को भी आवश्यकतानुसार मैन्युअल रूप से समायोजित किया गया था।
  4. PHENIX और संरचना की 10% चूक का उपयोग करके एक समग्र ओमिट मानचित्र की गणना करें।

14. संरचना शोधन

  1. फेंसीएक्स रिफाइन के साथ संरचनाओं को परिष्कृत करें। बल्क-सॉल्वेंट और स्टीरियोकेमिस्ट्री वजन के खिलाफ प्रारंभिक शोधन चलाएं, क्रमशः आरएमसबॉन्ड और आरएमसांगल बाधाओं को 0.01 और 1.0 तक आराम दें। व्यक्तिगत बी-कारकों, टीएलएस मापदंडों और ऑक्यूपेंसियों पर शोधन जारी रखें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और NEMO के IKK बाध्यकारी डोमेन की शुद्धि।
प्रोटोकॉल ने निमो-ईईएए(चित्रा 1ए)के अंतिम अनुक्रम को प्राप्त करने के लिए इस अध्ययन में पालन किया, जिसमें विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल का उत्पादन किया गया, जिसमें सभी मध्यवर्ती निर्माणों की अभिव्यक्ति और लक्षण वर्णन शामिल था, जिसमें एन-और या सी-टर्मिनस, म्यूटेशन C76A, C95S और म्यूटेशन E56A, E57A में कुंडलित-कुंडली एडाप्टर के अलावा शामिल है। चित्रा 1बी चित्रा 1सीमें योजना में वर्णित शुद्धिकरण प्रक्रिया में एकत्र नमूनों का एक एसडीएस-पेज जेल प्रदर्शित करता है। प्रोटीन ई. कोलाई में अधिक व्यक्त किया जाता है और एसडीएस-पेज जेल (लेन 3, फसल पर एकत्र कोशिकाओं और 8 एम यूरिया द्वारा पूरक Laemmli नमूना बफर में lysed) पर लगभग 14 केडीए मेगावाट वजन मार्कर पर एक बैंड के रूप में प्रकट होता है। प्रोटीन पहले IMAC कॉलम के बाद शुद्ध दिखाई देता है और SDS-PAGE जेल (लेन 9) पर 14 और 28 केडीए मेगावाट मार्कर के स्तर पर एक मोनोमर और एक डिमर बैंड प्रदर्शित करता है । TEV दरार व्यावहारिक रूप से प्रोटोकॉल का पालन पूरा हो गया है और प्रोटीन के माध्यम से प्रवाह के साथ लगभग पूरी तरह से एक डामर के रूप में, अपेक्षित मेगावाट (28 केडीए से नीचे बैंड) पर पूरा हो गया है । आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी 60-65 मिलीग्राम के बीच एक चोटी को पतला करता है और हमारे अनुभव में डिमर(चित्रा 1डी)के लिए इसी तरह प्रदर्शित करता है। कुंडलित कुंडली के लम्बे आकार और फलस्वरूप बड़े हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या10के कारण एसईसी पर अपेक्षा से पहले की तुलना में मंदक कुंडलित कुंडली हमेशा बढ़ जाती है । एसईसी पीक से अंशों में NEMO-EEAA अभी भी एक मोनोमर और एसडीएस-पेज जेल (लेन 14-15) पर एक डामर के रूप में दिखाई देता है। एकाग्रता पर नमूना संभावित एकत्रीकरण और वर्षा को रोकने के लिए एक उभारा-सेल केंद्रित का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।

एनएमओ-ईईएए का क्रिस्टलीकरण
प्रारंभिक क्रिस्टल पीजीए का उपयोग करके एक वाणिज्यिक स्क्रीन से प्राप्त किए गए थे (सामग्री की तालिकादेखें), 2 एमएम ट्रिस, 100 एमएम एएनसीए, 2 एमएम डीटीटी, पीएच 8.0 में निमो-ईईएए के 1.65 μg/mL का उपयोग किया गया था। ठीक स्क्रीनिंग 0.1 एम Tris पीएच 8.9, 5% पीजीए-एलएम, 3.6% खूंटी 20k(चित्रा 2ए),जो एक बीज स्टॉक का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया गया में क्रिस्टल का उत्पादन किया। अंतिम क्रिस्टल 0.1 एम ट्रिस पीएच 8.0, 5.8% पीजीए-एलएम, 5.45% खूंटी 20k(चित्रा 2बी)में सीडिंग के साथ प्राप्त किए गए थे।

डेटा संग्रह और संरचना निर्धारण
निमो-ईईएए क्रिस्टल मोज़ेकिटी और एनीसोट्रोपी से पीड़ित हैं। क्रिस्टल पी 1 21 1 अंतरिक्ष समूह में गठित, डेटा संकल्प के साथ एक *, बी * और सी * धुरी (1.88 Å, 2.10 Å और 2.55 Å) में बदलती है। विवर्तन प्रोफाइल के उदाहरण चित्र 3में हैं । एनएसएलएस II के एएमएक्स (17-आईडी-1) बीमलाइन पर डेटा हासिल किया गया था, जिसका बीम आकार 7 x 5 माइक्रोन2था। क्रिस्टल के वांछित हिस्से(चित्रा 2बी)पर ध्यान केंद्रित करने और डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए छोटे बीम आकार आवश्यक था।

संरचना निर्धारण के लिए सफल प्रोटोकॉल के लिए STARANISO27 सर्वर(http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi)का उपयोग कर डेटा के एनिसोट्रोपिक ट्रंकेशन की आवश्यकता होती है, जिसके बाद फेनिक्स22 के भीतर MRage21 का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरणबद्ध और डिमेरिक जीसीएन4 (पीडीबी: 4DMD)15 की संरचना एक खोज मॉडल के रूप में होती है। इस संरचना चरणबद्ध के समाधान में शुरू में सेमेट के साथ देशी मेथिओनीन को लेबल करके प्रयास किया गया था। असंगत संकेत बहुत कमजोर था, शायद निमो के अनबाउंड रूप में Met95 की विलायक उजागर प्रकृति के कारण (SeMet95 सफलतापूर्वक NEMO/IKKο संरचना9के चरणबद्ध के लिए इस्तेमाल किया गया था) ।

प्रारंभिक डेटा विश्लेषण 2.3 Å करने के लिए डेटा के गोलाकार ट्रंकेशन के साथ प्रयास किया गया था. इस डेटा सेट को आणविक प्रतिस्थापन द्वारा सफलतापूर्वक चरणबद्ध नहीं किया जा सकता था, लेकिन एक खोज मॉडल (पीडीबी: 3BRV)9के रूप में IKKο (701-745) के साथ जटिल में एमआर-रोसेटा25 और NEMO (44-111) की संरचना का उपयोग करके एक समाधान प्राप्त किया गया था। इस प्रारंभिक मॉडल को सफलतापूर्वक परिष्कृत नहीं किया जा सका। हमने डेटा को काटना और एनिसोट्रोपिक स्केलिंग द्वारा एनिसोट्रोपी को हटाने के लिए यूसीएलए26 में विवर्तन एनीसोट्रोपी सर्वर का उपयोग किया। नए प्रसंस्कृत डेटासेट को आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरणबद्ध किया जा सकता है । डेटा को और बेहतर बनाने के लिए, हमने डेटा और आयामों के एनिसोट्रोपिक ट्रंकेशन के लिए स्टारानिसो27 सर्वर को बायसियन अनुमान28के साथ एक एनिसोट्रोपिक सुधार कारक के साथ सही किया गया। इस डेटा, जिसके परिणामस्वरूप अद्वितीय प्रतिबिंबों की संख्या में 19,560 की वृद्धि हुई, संरचना शोधन के लिए उपयोग किया गया था। समग्र छोड़ नक्शे जहां PHENIX के साथ गणना की, एक समय में परमाणुओं के 10% को छोड़कर, और अंतिम संरचना मॉडल के साथ तुलना में, पुष्टि करने के लिए कि संरचना परमाणु मॉडल द्वारा पक्षपातपूर्ण नहीं था । क्रिस्टलोग्राफिक मॉडल निमो-ईईएए की श्रृंखला ए में पहले और अंतिम अवशेषों को छोड़कर पूरा हो गया है, जिसके लिए कोई इलेक्ट्रॉन घनत्व नहीं देखा गया था।

NEMO-EEAA लंबाई में ~ 175 Å की एक होमो-डिमेरिक, अनियमित, समानांतर कुंडलित कुंडली है। नियमित कुंडलित-कुंडलित क्षेत्र में एन-टर्मिनस (अवशेष 20-50) पर आदर्श कुंडलित-कुंडली एडाप्टर अनुक्रम और निमो के पहले दो हेप्टाड उचित अनुक्रम (अवशेष 51-65) शामिल हैं। एक नियमित रूप से कुंडलित कुंडली सी-टर्मिनस में भी मौजूद है, जो निमो अवशेष 97 से शुरू होती है और सी-टर्मिनल आदर्श कुंडली-कुंडली एडाप्टर(चित्रा 4ए)को शामिल करती है। केंद्रीय भाग, NEMO अवशेषों को शामिल 66-98 बड़ा अंतरीय दूरी प्रदर्शित करता है (interhelical रिक्ति नियमित रूप से कुंडलित कुंडली संरचना में 7.6 Å के औसत मूल्य से अनियमित क्षेत्र में अधिकतम 11.5 Å तक जाती है) और एक आदर्श कुंडलित कुंडली के साथ तुलना में असतत हाइड्रोफोबिक इंटरफेस। NEMO का यह क्षेत्र भी IKKο बाध्यकारी के लिए इंटरफेस का प्रतिनिधित्व करता है और लिगाण्ड बाध्यकारी पर एक प्रवर्तक परिवर्तन से गुजरता है। IKKο-बाध्य संरचना इस क्षेत्र में 1.0 से 2.2 Å(चित्रा 4बी)12तक बड़े अंतर स्थान के साथ लिगांड को समायोजित करने के लिए एक अधिक खुली कुंडलित-कुंडली संरचना प्रदर्शित करती है। एपीओ संरचना अवशेषों में Leu93, Met94, Lys96, Phe97 और Arg101 कुंडलित कुंडली के केंद्र की ओर स्थानांतरित करने के लिए लिगांड बाध्यकारी जेब पर आक्रमण कर रहे है (Cα-Phe97 के लिए Cα-Cα दूरी २.९ Å द्वारा सख्त है), बड़े हाइड्रोफोबिक फांक जो IKKο में ligand मेजबान बंद करने के समग्र प्रभाव के साथ बाध्य संरचना ।

Figure 1
चित्र 1: निमो-ईईएए का शुद्धिकरण। (क) होमो सेपियंस, मस मस्कुलस और बोस बोविस और इंजीनियर निमो-ईईएए से निमो का अनुक्रम संरेखण । कुंडलित-कुंडलित एडाप्टर अनुक्रम को रेखांकित किया जाता है, और म्यूटेशन को नारंगी रंग में हाइलाइट किया जाता है। (ख) अभिव्यक्ति और शुद्धि के दौरान एकत्र किए गए अंशों का एसडीएस-पेज जेल (जैसा कि लेबल और प्रवाह चार्ट 1 सी में संदर्भित किया गया है)। 10% एक्रिलामाइड, एमईएस बफर। (ग) निमो-ईईएए के शुद्धिकरण के लिए एक प्रवाह चार्ट । (ख) आकार-बहिष्कार प्रोफाइल जो निमो-ईईएए (नीला) के डामर को दर्शाता है । हरे रंग में आणविक वजन मार्कर (केडीए) इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आकृति विज्ञान और निमो-ईईएए क्रिस्टल का आकार। (क) प्रारंभिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन से निमो-ईईएए का क्रिस्टल, गैर वरीयता प्राप्त। क्रिस्टल के इस प्रकार के बाद क्रिस्टलीकरण प्रयास (०.१ एम Tris पीएच 8.0, 5% पीजीए-एलएम, 3.6% खूंटी 20k; 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, पीएच 8.0) में एक प्रोटीन समाधान के साथ के लिए सीडिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था। (ख) क्रिस्टल डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया (०.१ एम Tris पीएच ८.०, ५.८% पीजीए-एलएम, ५.४५% खूंटी 20k, 2 mM Tris, १०० m M NaCl 2 mM DTT, पीएच ८.०) में एक प्रोटीन समाधान के साथ । डेटा संग्रह के लिए उपयोग किए जाने वाले अनुमानित क्षेत्र को लाल रंग में परिक्रमा की जाती है। 100 माइक्रोन लंबाई के लिए स्केल बार को आंकड़े में परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: निमो क्रिस्टल से प्राप्त क्रिस्टलोग्राफिक डेटा। (क) प्रारंभिक निमो क्रिस्टल का एक्स-रे विवर्तन प्रोफ़ाइल: लम्बी धारियां क्रिस्टल में मोज़ेकता का संकेत देती हैं। (ख) अनुकूलित निमो-ईईएए क्रिस्टल का एक्स-रे विवर्तन प्रोफ़ाइल। संकल्प अंगूठी २.५ Å के एक स्थानिक संकल्प पर तैयार की है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अनबाउंड निमो की संरचना। (क) निमो-ईईएए डिमर को रिबन, हल्के नीले = कुंडलित-कुंडली एडाप्टर, नीले = निमो (51-112) के रूप में दिखाया गया है। (ख) इकेके-बाउंड संरचना (ग्रे, पीडीबी: 3बीआरवी, IKKο प्रदर्शित नहीं किया गया है) से एपीओ NEMO-EEAA संरचना (नीला, पीडीबी: 6MI3) और NEMO (44-111) का सुपरपोजिशन प्रदर्शित नहीं किया गया है; संरचनाओं को केवल चेन ए, क्षेत्र 44-111 पर गठबंधन किया जाता है। इस आंकड़े को पिछले प्रकाशन12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अनबाउंड रूप में एनओएमओ के क्रिस्टलीकरण के प्रयास असफल रहे, जिनमें पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का उपयोग करने के प्रयास और आईकेके-बाध्यकारी डोमेन को शामिल करते हुए कई ट्रंकेशन निर्माण शामिल हैं। परिपत्र डिक्रोज़्म, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और फ्लोरेसेंस एनसोट्रोपी द्वारा निमो (अवशेष 44-111) के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन के हमारे जैव भौतिक लक्षण वर्णन ने संकेत दिया कि निर्माण, हालांकि IKKको बांधने में सक्षम, संरचना विनिमय की स्थिति में मौजूद था, क्रिस्टलीकरण9,10के लिए उपयुक्त नहीं है। हमारे दृष्टिकोण में निमो के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का निर्माण शामिल था जिसने अधिक स्थिर, मुड़ा हुआ और देशी-जैसी संरचना अपनाई, जिससे क्रिस्टलीकरण को रोकने वाले लचीलेपन को नष्ट किया गया। एन -और सी-टर्मिनी के लिए जुड़े आदर्श कुंडलित-कुंडल डोमेन एडाप्टर (44-111) अनुक्रम देशी नीमो के डिमेरिक कुंडल-कुंडली गुना को स्थिर करने और क्रिस्टलीकरण14को सुविधाजनक बनाने का लाभ प्रदान करते हैं। प्रोटीन निर्माण की एक श्रृंखला के व्यवहार पर प्रत्येक चरण में एसडीएस-पेज, आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी, परिपत्र डिक्रोज़्म, फ्लोरेसेंस एनिसोट्रोपी और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की गई थी, जैसा कि पहले10,12वर्णित था। सभी वांछित मापदंडों में प्रगतिशील सुधार के बावजूद म्यूटेशन E56A, E57A पेश किए जाने तक कोई निर्माण विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल नहीं मिला। उत्परिवर्तन सतह एंट्रोपी रिडक्शन सर्वर एसईआरपी29 द्वारा सुझाए गए उच्चतम प्रभाव उत्परिवर्तन थे जिसमें IKKο के लिए बाध्यकारी के हॉट-स्पॉट में फंसाए गए अवशेषशामिल नहीं थे, जैसा कि निमो/IKKο जटिल संरचना में था । यद्यपि साइस्टीन डिसुल्फिफ लिंकेज के माध्यम से निमो के आईकेआर-बाध्यकारी डोमेन की आदेशित संरचना को स्थिर करने वाले अन्य निर्माणों को30वर्णित किया गया है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल अनबाउंड रूप में निमो के आईकेआर-बाध्यकारी डोमेन के संरचना निर्धारण के लिए पहले सफल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है।

प्रोटीन उत्पादन और शुद्धिकरण हमारी प्रयोगशाला में मानक प्रक्रियाओं का पालन किया । कोशिका लाइसिस पर प्रोटीन का एक काफी हिस्सा अघुलनशील अंश में मौजूद होता है, यहां तक कि जब 18 डिग्री सेल्सियस पर शामिल होने के बाद कोशिकाओं को बढ़ाते हैं, इसलिए प्रोटीन को कोशिका लाइसिस के बाद 8 एम यूरिया में और शुद्धि से पहले मिला दिया गया था, और जब तक कि बंधी हुई थी, और फिर से मुड़ा हुआ था, जबकि आईमैक कॉलम। कॉलम बाउंड प्रोटीन की व्यापक धुलाई दोनों की स्थिति के तहत और फिर से तह करने के बाद पहले शुद्धिकरण कदम के बाद एक शुद्ध उत्पाद के लिए महत्वपूर्ण हैं। शुद्ध NEMO-EEAA पिछले निर्माण की तुलना में उपजी करने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति है, लेकिन अभी भी क्रिस्टलीकरण की स्थिति के तहत पर्याप्त रूप से घुलनशील है ।

संरचना निर्धारण में एक महत्वपूर्ण कदम सीडिंग का उपयोग था। माइक्रोसीड मैट्रिक्स स्क्रीनिंग31के समान दृष्टिकोण में, विरल मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के दौरान प्राप्त क्रिस्टल से बीज का उपयोग शर्तों की एक अतिरिक्त स्क्रीनिंग में किया जाता था, जिसके बाद अंतिम क्रिस्टलीकरण की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक ठीक स्क्रीनिंग दौर होता था। अंतिम परिस्थितियों में उगाए गए अधिकांश क्रिस्टल उच्च मोज़ेकता प्रदर्शित करते हैं और डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त नहीं हैं। क्रिस्टल के लिए कई यात्राओं पर क्रिस्टल की जांच की गई और क्रिस्टल के किनारे पर डेटासेट एकत्र करके सबसे अच्छी डेटा गुणवत्ता हासिल की गई, जहां नवीनतम विकास हुआ था। के रूप में क्षेत्र है जो पार ध्रुवीकृत छवियों में जाली एकरूपता दिखाया छोटा था, यह एनएसएएलएस द्वितीय में AMX बीमलाइन के लिए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, छोटे बीम आकार के कारण ।

हमने एक खोज मॉडल के रूप में आणविक प्रतिस्थापन द्वारा NEMO-EEAA की संरचना को सफलतापूर्वक निर्धारित किया है, जो जीसीएन415के डिमेरिक कुंडलित-कुंडली की संरचना है, जो एन-और नीमो अनुक्रम के सी-टर्मिनी में जुड़े आदर्श कुंडलित-कुंडली एडाप्टर ों के लिए मैप किया गया था। आणविक प्रतिस्थापन सफल रहा क्योंकि जीसीएन4 एडाप्टर ने निमो से जुड़े होने पर अपनी मूल संरचना को बनाए रखा था। इसके साथ ही, हम यह सत्यापित कर सकते हैं कि निमो ने निमो/IKKο जटिल संरचना में इसी संरचना क्षेत्र के साथ आईकेके-बाध्यकारी में शामिल भागों की तुलना करके अपनी मूल संरचना की तरह संरचना बनाए रखी । एक विकल्प के रूप में, एनईएमओ/IKKο परिसर (PDB: 3BRV)9 में NEMO की संरचना का उपयोग एक आणविक प्रतिस्थापन खोज मॉडल के रूप में संभव हो सकता है, मोनोमर बी पर ध्यान केंद्रित है, जो श्रृंखला है जो ligand बाध्यकारी पर सबसे छोटी संरचना परिवर्तन से गुजरता है से मेल खाती है । इस रणनीति ने फेनिक्स के एमआर-रोसेटा मॉड्यूल का उपयोग करके कुछ प्रारंभिक सफलता दिखाई।

अंत में, यूसीएलए26में स्टारानिसो27 सर्वर या विवर्तन एनीसोट्रोपी सर्वर द्वारा प्रदान किए गए विलय तीव्रता डेटा के एनीसोट्रोपिक कट-ऑफ का सहारा लेकर, डेटासेट में सभी उपलब्ध डेटा का उपयोग करने के लिए एक सफल संरचना निर्धारण के लिए आवश्यक था।

एनएफ-केबी मार्ग में निमो/आईकेके परिसर द्वारा निभाई गई आवश्यक भूमिका इसे चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मार्ग के मॉड्यूलेशन के लिए एक वांछनीय लक्ष्य बनाती है । प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, खासकर जब एक बड़े बाध्यकारी इंटरफ़ेस को शामिल करते हैं, छोटे पेप्टाइड्स या छोटे अणुओं के साथ बाधा बनाना चुनौतीपूर्ण होता है, और संरचना आधारित अवरोधक डिजाइन एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है। एनओएमओ के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन का निर्माण जिसे हमने क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण को सुविधाजनक बनाने के लिए लचीला NEMO (44-111) की सीमाओं को पार करने का विकास किया था। चूंकि निर्माण आसानी से अनबाउंड रूप में क्रिस्टलाइज होता है, हम कल्पना करते हैं कि एक ही प्रोटोकॉल को छोटे अणु अवरोधकों के साथ एनओएमओ के परिसर के क्रिस्टलीकरण में सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है, एक संरचना निर्धारित करने के लिए जो बाध्यकारी मोड पर विवरण प्रदान करेगा और आगे लिगामेंट सुधार की अनुमति देगा।

इस काम में हासिल क्रिस्टलाइजेशन की स्थिति में क्रिस्टल पैकिंग का विश्लेषण इंगित करता है कि लिगामेंट सह-क्रिस्टलीकरण को एपो-प्रोटीन क्रिस्टल में लिगामेंट भिगोने के लिए पसंद किया जा सकता है। जबकि क्रिस्टल पैकिंग डिमर की चेन बी के आसपास कुछ जगह प्रदान करता है (निकटतम श्रृंखला के लिए 6 से 10 Å) और लिगाण्ड बाध्यकारी साइट के एक चेहरे पर (लगभग 13 Å Phe82-Phe87 के बीच गर्म स्थान क्षेत्र में), सममित बाध्यकारी जेब पूरी तरह से द्वारा occluded है पास की जंजीरों, लिगामेंट बाइंडिंग को रोकते हैं।

कॉइलकॉइल प्रोटेम में एक महत्वपूर्ण अनुपात में मौजूद हैं और आणविक स्पेसर्स, मचान और16में प्रेक्टिकल परिवर्तनों के संवाद के रूप में उनके कार्य में आवश्यक हैं। उनकी बहुतायत और प्रासंगिक भूमिकाओं के बावजूद, पूर्ण लंबाई कुंडलित कुंडलित प्रोटीन की अपेक्षाकृत कुछ संरचनाएं हैं। कुंडलित कुंडलित एडाप्टर का उपयोग कुंडलित-कुंडलप्रोटीन के संरचनात्मक डोमेन के स्थिरीकरण में सहायता कर सकता है, जबकि उनकी मूल संरचना को संरक्षित करते हुए और संरचनात्मक दृढ़ संकल्प और उनके कार्य के व्याख्या में सहायता करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम इस परियोजना के दौरान कई उपयोगी चर्चाओं के लिए प्रो डी झुंझलाना को धन्यवाद देते हैं । हम प्रो डी बोलन को अनुकूलित GCN4 कुंडलित कुंडलित कुंडलवाले प्लाज्मिड के उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं। हम निमो प्लाज्मिड्स के लिए डॉ बी गुओ को धन्यवाद देते हैं । हम प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए क्रिस्टीना आर अर्नोल्डी, तमाड़ बासीश्विली और एमी ई कैनेडी का शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनके समर्थन के लिए क्रिस्टलोग्राफी उपकरण और बायोएमटी कर्मियों के उपयोग के लिए डार्टमाउथ में बायोएमटी क्रिस्टलोग्राफी कोर सुविधा और रसायन विज्ञान और बायोकेमिस्ट्री और सेल बायोलॉजी के विभागों को धन्यवाद देते हैं। इस शोध में नेशनल सिंक्रोट्रॉन लाइट सोर्स II के एएमएक्स बीमलाइन का इस्तेमाल किया गया, जो अमेरिका के ऊर्जा विभाग (डीओई) ऑफिस ऑफ साइंस यूजर फैसिलिटी का इस्तेमाल किया गया है, जो कॉन्ट्रैक्ट नंबर एक के तहत ब्रुकहेवन नेशनल लेबोरेटरी द्वारा डीओई ऑफिस ऑफ साइंस के लिए संचालित है । डी-एससी0012704। हम एनएसएलएस द्वितीय में कर्मचारियों को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को NIH अनुदान R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 और P20GM113132, और एक मुंक-Pfefferkorn उपन्यास और इंटरएक्टिव अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

बायोकेमिस्ट्री इश्यू 154 एनएफ-बी नीमो आईबी किनेज (आईकेके) निमो बाइंडिंग डोमेन (एनबीडी) कुंडलित कुंडल एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन इंजीनियरिंग संरचना निर्धारण संरचना आधारित दवा डिजाइन
एनईएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter