Summary
Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.
Abstract
Intravital-Mikroskopie (IVM) ist weit verbreitet, um physiologische und pathophysiologische Prozesse innerhalb der Leukozyten-Rekrutierungskaskade in vivo zu überwachen. Das aktuelle Protokoll stellt eine praktische und reproduzierbare Methode dar, um die Leukozyten-Endothel-Wechselwirkung zu visualisieren, die zu einer Leukozytenrekrutierung im skelettierten Muskelgewebe innerhalb des intakten Organismus der Maus führt. Das Modell gilt für alle Forschungsbereiche, die sich auf die Granulozytenaktivierung und ihre Rolle bei Krankheiten konzentrieren.
Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um die Methode zu durchführen und mögliche Fallstricke und technische Schwierigkeiten aufzuzeigen. Das Protokoll behandelt folgende Aspekte: experimentelle Einstellungen und benötigtes Material, Anästhesie der Maus, Zerlegung des Cremastermuskels sowie Tracheal- und Karotiskannulation, IVM-Aufnahmen und Offline-Analyse. Datenformate wie haftende Leukozyten, Rolling Flux (RF) und Rolling Flux Fraction (RFF) werden ausführlich erläutert und entsprechende Anwendungen diskutiert. Repräsentative Ergebnisse von Dystrophin-Mangel mdx Mäuse nd werden im Ergebnisbereich zur Verfügung gestellt.
IVM ist ein leistungsfähiges Instrument zur Bewertung der Leukozytenrekrutierung in einem In-vivo-Umfeld; Die Abgrenzung z.B. der Endothel- und Leukozytenfunktion kann jedoch eine Kombination mit ex vivo-Setups wie Strömungskammerexperimenten erfordern. Darüber hinaus kann der genetische Hintergrund von Tieren von Interesse die Einstellung von Baselinen stark beeinflussen, was eine individuelle Feinabstimmung des vorgelegten Protokolls erfordert. Trotz seiner Einschränkungen kann IVM als Plattform dienen, um In-vitro-Befunde leicht in einen lebenden Wirbeltierorganismus zu übersetzen.
Introduction
Intravital-Mikroskopie (IVM) ist ein häufig angewandtes Werkzeug auf dem Gebiet der Leukozytenbiologie. Leukozyten Rekrutierung folgt einer Kaskade von genau definierten Ereignissen durch Leukozyten-Capture, Rollen und Adhäsion an der Endothelwand initiiert, und schließlich Transmigration und Extravasation von Leukozyten an die tatsächliche Stelle der Entzündung1. Jeder Schritt wird durch verschiedene Chemokine (z.B. IL-8/CXCL8), Rezeptoren (z.B. LFA-1, Mac-1) und entsprechenden Endothelzelladhäsionsmolekülen (z.B. ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin)2,3. Die Wechselwirkung verschiedener regulatorischer Standorte, Steuerungsfaktoren und Mediatoren der Leukozytenrekrutierungskaskade wie Rezeptor fortschrittlicher Glykationsendprodukte (RAGE), interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), C-X-C-Motivliganden (CXCL)1/2 und deren Rezeptor CXCR2 wurden mit IVM4,5,6,7,8,9.
Die Methode der IVM wurde für viele verschiedene Organe und Gewebe wie der Darm10, Haut11, Lymphknoten12, der embryonale Dottersack13 und andere beschrieben. Die am weitesten untersuchte Methode von IVM ist jedoch das Cremaster-Modell, das zuerst in Ratten14beschrieben wurde. Während noch bei Ratten15verwendet, wird die Methode heutzutage vor allem bei Mäusen aufgrund der hohen Fülle von verschiedenen transgenen Linien angewendet. Unsere Gruppe hat vor kurzem die mögliche Rolle von Cremaster IVM auf dem Gebiet der entzündlichen Muscolopathien wie Duchenne Muskeldystrophie (DMD) Untersuchung dystrophin-deficient mdx Mäuse16hervorgehoben. Aufgrund seiner dünnen verwobenen und leicht zugänglichen Faserzusammensetzung stellt der Cremaster-Muskel den idealen Kandidatenmuskel dar, der als Gesamtberg mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden kann. Leukozytenrekrutierung und Extravasation finden hauptsächlich in postkapillaren Venulen statt, die leicht auf einer kontinuierlichen Muskelschicht im Cremaster-Muskel identifiziert werden können.
Der Vorteil der In-vivo-Bildgebung im Vergleich zu anderen In-vitro-Assays ist ihr biologischer Kontext in einem lebenden Organismus. Gleichzeitig kann die Abgrenzung zellspezifischer Beiträge zur veränderten Leukozytenrekrutierung zusätzliche In-vitro-Modelle wie Strömungskammern oder endotheliale Assays erfordern. Die Kombination mehrerer Methoden liefert überzeugende Daten. Wissenschaftler sollten sich der Einschränkungen des Cremaster-Modells bewusst sein, da jede chirurgische Manipulation zu einem verstärkten Leukozytenhandel und Rekrutierung führen wird. Daher ist die Einstellung von Baselinen mit dieser Methode schwer abzuschätzen. Trotz seiner breiten Anwendung kann IVM des Cremasters eine Herausforderung sein und ein neuartiges Setup kann Zeit und Ressourcen in Anspruch nehmen. Wir stellen jetzt ein einfaches Protokoll zur Verfügung, das dazu beitragen wird, einige der häufigsten Fehler in IVM zu vermeiden. Außerdem werden Einschränkungen diskutiert und gegebenenfalls kostenlose Methoden hervorgehoben.
IVM des Cremasters stellt einen idealen Ansatz dar, der im Bereich der entzündlichen und infektiösen Studien umgesetzt werden kann. Genauer gesagt, kann das Cremaster-Modell von hohem Interesse für Wissenschaftler sein, die Skelettmuskelbiologie im Kontext von entzündlichen Erkrankungen studieren.
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Protocol
Die Tiere wurden in der IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung) in Heidelberg unter kontrollierten und spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden vom örtlichen IRB und dem Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Württemberg, Deutschland genehmigt.
1. Anästhesie-Verwaltung
- Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale (i.p.) Bolusinjektion von 125 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin.
- Platzieren und fixieren Sie die Maus in einer dorsalen Liegeposition auf einem Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus (36,5-38 °C) aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie eine nicht resorbierbare sterile Naht (6/0), um eine einfache Schlaufe um die Stirnzähne zu wickeln und die Verbindungsenden der Naht an das Heizkissen zu kleben. Diese Fixierung zielt darauf ab, den Mund offen zu halten, um Störungen in der Atmung zu vermeiden.
- Überprüfen Sie die Maus auf angemessene Tiefe der Anästhesie durch interdigitale Zehenklemme (Entzug sollte nicht gesehen werden).
- Sobald eine ausreichende Anästhesie erreicht ist, gehen Sie zur chirurgischen Vorbereitung. Bestätigen Sie wiederholt die Anästhesie entlang des laufenden Experiments alle 30 min. Bei Bedarf erneut Medikamente wie oben beschrieben.
- Gleichgewichtsphysiologische Salzlösung (PSS, Zusammensetzung: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) mit 5% CO2/95% N2 für 15 Minuten. Kontinuierlich Blasen PSS mit 5% CO2/95%N2 während des gesamten Experiments und halten sie bei 37 °C.
2. Chirurgische Vorbereitung der Luftröhre und Halsschlagader (optional)
- Sezieren Sie die Haut aus dem Nackenbereich, indem Sie die Haut sanft mit einer Pinzette in der Mittellinie ziehen. Verwenden Sie eine Schere, um einen kreisförmigen Schnitt von 1-2 cm Durchmesser aufzutragen, um genügend Platz für die chirurgische Vorbereitung zu geben.
- Sezieren Sie vorsichtig die umgebenden Muskel-, Fett- und Bindegewebe mit einer Pinzette.
- Machen Sie einen Querschnitt (ca. 1,3 mm) mit einer kleinen chirurgischen Schere in die Luftröhre und führen Sie ein Polyethylenrohr (I.D x O.D. 0,034" x 0,050") in das kaudale Ende der Luftröhre ein, um die oberen Atemwege zu sichern.
- Befestigen Sie das Rohr in der Luftröhre durch eine einzige kreisförmige Knotennaht (6/0 USP).
- Suchen Sie die Halsschlagader entlang der rechten Seite der Luftröhre und sezieren Sie das umgebende Gewebe von der Halsschlagaderwand. Alternativ könnte die Jugular- oder auch die Schwanzvene für den i.v. Zugang verwendet werden. Versuchen Sie, Verletzungen des Vagalnervs zu vermeiden, da er sich in der Nähe befindet.
- Passieren Sie zwei Stücke der Naht (6/0) unter der Halsschlagader. Platzieren Sie die erste Schädelnaht proximal, in der Nähe der Bifurkation der Karotisarterien und binden Sie sie dauerhaft. Die zweite Naht wird etwa 5-8 mm distal von der ersten befinden und später verwendet werden, um das Rohr in der Halsschlagader zu sichern. Binden Sie es noch nicht.
- Bereiten Sie ein Polyethylenrohr (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") mit einer Länge von 30 cm vor, indem Sie das Endteil auf eine 1 ml Spritzennadel biegen, die mit Salin (0,9% NaCl) gefüllt ist. Strenge Spülung ist wichtig, um Luftembolisation während der Vorbereitung zu verhindern.
- Verwenden Sie einen 7 mm Gefäßclip, um die Halsschlagader distal der zweiten Naht zu klemmen.
- Führen Sie einen kleinen Querschnitt (ca. 0,5 mm) in der Halsschlagader durch und führen Sie das sterile Polyethylenrohr ein. Sichern Sie die Röhre in der Arterie mit der zweiten Naht zuvor vorbereitet.
- Entfernen Sie den Gefäßclip und tragen Sie vorsichtig eine kleine Spannung auf die Spritze auf, die mit dem Polyethylenrohr verbunden ist. Dieser Karotiskatheter kann nun zur Verabreichung von Medikamenten oder zur Entnahme von Blutproben verwendet werden, bei Bedarf ist sogar eine Überwachung des Blutdrucks oder der Pulsfrequenz mit entsprechenden Geräten möglich.
3. Chirurgische Vorbereitung des Cremaster-Muskels
- Übertragen Sie die Maus auf dem Heizkissen (zusammen mit dem Heizkissen) auf den maßgeschneiderten Kunststoffrahmen, der die Bühne für die spätere Mikroskopie hält. Richten Sie die Maus mit ihrem Hodensack zur Mikroskopstufe.
- Die Tiefe der Anästhesie neu bewerten, bevor Sie fortfahren; bei Bedarf eine Viertel- bis halber Anästhesiedosis erneut verabreichen.
- Lokalisieren Sie den Hodensack, halten Sie ihn an seinem distalsten Teil mit einer Pinzette, ziehen Sie ihn sanft und schneiden Sie einen kreisförmigen Abschnitt der scrotalen Haut mit einem Durchmesser von etwa 5 mm ab. Achten Sie darauf, die zugrunde liegenden Strukturen wie den Cremaster-Muskel nicht zu beschädigen. Achten Sie darauf, das offene Gewebe gut hydratisiert mit Einer Saline-Lösung zu halten.
- Sezieren Sie loses Bindegewebe mit zwei Pinzetten und lokalisieren Sie beide Hoden.
- Halten Sie einen Hoden distally und sanft beginnen, es herauszuziehen, entfernen Umgebendes Bindegewebe Schritt für Schritt.
- Sobald der Hoden aussenisiert ist, fixieren Sie sein distales Ende an den Gummiring, der die Bühne umgibt. Bei der Exteriorisation das Gewebe während des gesamten Prozesses mit einer Salinelösung hydratisieren.
- Kritischer Schritt: Entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe, ohne den darunter liegenden Cremaster-Muskel zu schädigen. Überschüssiges Bindegewebe kann das Sehvermögen in der späteren Mikroskopie behindern und verschwommene Bilder erzeugen.
- Pin den distalen Teil des Hodens nach unten und öffnen Sie den Cremaster-Muskel durch einen kleinen Querschnitt (ca. 1 mm), gefolgt von Längsschnitt vom sehr distalen bis zum proximalen Ende. Dadurch sollte sich der Cremaster-Muskel sphärisch öffnen. Makroskopisch sichtbares Gefäß sollte nicht abgetrennt werden, da dies die Hämodynamik beeinträchtigen kann.
- Den Muskel vorsichtig über die Glasbühne verteilen und an den Gummiring heften. Achten Sie darauf, den zentralen Bereich nicht zu berühren oder zu beschädigen, da hier die Mikroskopie durchgeführt wird.
Achtung: Überschüssige Dehnung kann den Blutfluss behindern. - Pin die restlichen Hoden beiseite, um den Zugang zu der Region von Interesse zu geben. Achten Sie darauf, mit PSS wiederholt zu befeuchten, um ein Trocknen zu verhindern. Der montierte Muskel ist nun für die Mikroskopie bereit.
4. Intravitale Mikroskopie
- Legen Sie den montierten Cremaster-Muskel in das aufrechte Mikroskop und führen Sie die Mikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv durch.
- Erfassen Sie Daten und exportieren Sie sie mithilfe der Bildspektrographie mit hohem Durchsatz.
- Führen Sie Aufnahmen unter kontinuierlicher Überfusion mit vorgewärmten (35-37 °C) PSS17durch. Tragen Sie die Superfusion durch einen kleinen Schlauch auf, der auf das aufrechte Ziel des Mikroskops geklebt wurde, um ein kontinuierliches Abtropfen von PSS neben dem Objektiv auf das Muskelgewebe zu ermöglichen.
- Identifizieren Sie postkapillare Venulen (Zusammenfluss von zwei kleineren Gefäßen) und messen Sie die Mikrozirkulation an Venulen mit einem Durchmesser von 20-40 m.
- Zeichnen Sie hochauflösende Bilder der Mikrozirkulation aus dem Cremaster-Muskel in einem Zeitbereich von 30 s auf. Da es während der Aufnahme zu einer leichten Kontraktion und Entspannung des Muskelgewebes sein kann, stellen Sie sicher, dass Sie den Fokus kontinuierlich anpassen. In der Regel neigt die Maus dazu, eine stabile Zirkulation für etwa 2 Stunden zu zeigen. Es ist möglich, mehrere Aufnahmen von verschiedenen Schiffen aus verschiedenen Regionen zu erwerben. Ein oder beide Hoden können nachträglich verwendet werden.
HINWEIS: Da dies ein Modell der Entzündung ist, sind häufige Wege der Induktion: systemische Anwendung Noder lokale skrotale Injektion von pro-inflammatorischen Mediatoren sowie Superfusion mit zum Beispiel N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (fMLP). Lokale TNF-A-Stimulation wird häufig verwendet, um Leukozytenrekrutierung auszulösen; LPS-induzierte Endotoxämie ist ein Modell der schweren systemischen Entzündung von SIRS.
5. Leukozyten-Visualisierung
HINWEIS: Haftende und rollende Leukozyten sind ohne weitere Visualisierung leicht zu sehen. Um die Mittelliniengeschwindigkeit frei beweglicher Leukozyten zu bestimmen, führen Sie Differentialfärbungen durch.
- Wenn eGFP-gekennzeichnete Mäuse verwendet werden, analysieren Sie sie direkt durch Fluoreszenzmikroskopie.
- Für nicht-eGFP beschriftete Mausstämme, verwenden Sie Rhodamine Färbung.
- Rhodam in 6G bei 0,2 mg/kg Körpergewicht verabreichen. Wiederholte Dosen können erforderlich sein, um ausreichende Färbeintensitäten zu erreichen. Achten Sie darauf, kleine Volumes beizubehalten, da größere Volumes hämodynamische Parameter beeinflussen können.
- Für die sofortige Färbung von Leukozyten, verabreichen Sie den Fleck über die Halsschlagader. Wenn keine Karotisarteriensektion durchgeführt wurde, kann eine ausreichende Färbung durch i.p. Anwendung mit der gleichen Dosis18erreicht werden. Als Alternative zur Karotisarterienkatheterisierung kann jede andere venöse Katheterisierung durchgeführt werden.
HINWEIS: Beachten Sie, dass die Rhodamine-Färbung im Gegensatz zur eGFP-Kennzeichnung den Zeitlichenzerfall der Fluoreszenzintensität sowie ein Gesamtfärbemaximum von etwa 80 % der Leukozyten in höheren Konzentrationen aufweist. - Visualisieren Sie frei bewegliche Rhodamine-gefärbte Leukozyten durch Fluoreszenzmikroskopie.
6. Ende des Experiments
HINWEIS: Die geschätzte Gesamtzeit für die Ausführung dieses Protokolls sollte 90 – 150 Minuten betragen.
- Beenden Sie das Experiment mit Euthanasie durch zervikale Dislokation.
- Für weitere Analysen, wie z.B. Transmigration, fixieren Sie den Cremaster-Muskel in PFA, während sie noch auf der Bühne gestreckt und für die Histologie nach Bedarf gefärbt sind.
7. Offline-Analyse
- Analysieren Sie die folgenden Parameter als einfache Zählungen während der Videowiedergabe.
- Berechnen des Rollflusses [Zahl/min]: Anzahl der Rollzellen, die eine imaginäre Linie/min passieren
- Berechnung der Haftung [Anzahl/mm2]: Anzahl der Zellen, die innerhalb des Sichtfeldes an der Gefäßwand kleben [ mm2].
- Messen Sie die folgenden hämodynamischen und mikrovaskulären Parameter werden mit ImageJ gemessen.
- Berechnen Sie den Gefäßdurchmesser [m] als Innenwanddurchmesser.
- Berechnen Sie die Gefäßlänge [m] als mittlere Linienlänge des Schiffes.
- Berechnen Sie
die Mittelliniengeschwindigkeit, die aus der Frame-to-Frame-Videoanalyse frei beweglicher Leukozyten in der Mittellinie ermittelt wird.
- Verwenden Sie die folgenden Gleichungen als Schätzung.
- Berechnen Sie die Gefäßoberfläche in [mm2]: Gefäßlänge [m] x Gefäßdurchmesser [m] x x 10-6.
- Berechnen Sie die
Wandscherrate : 4,9 x (8 x Mittelliniengeschwindigkeit x 0,625/Gefäßdurchmesser [m]). - Berechnen Sie die mittlere Durchblutungsgeschwindigkeit : Mittelliniengeschwindigkeit x 0,625.
- Berechnen Sie den gesamten
Leukozytenfluss 
: systemische Leukozytenzahl x (mittlere Durchblutungsgeschwindigkeit x 60/1000) x x 
. - Berechnen Sie die Walzstromfraktion [%]: Rollfluss/Gesamt-Leukozytenfluss x 100.
die Mittelliniengeschwindigkeit, die aus der Frame-to-Frame-Videoanalyse frei beweglicher Leukozyten in der Mittellinie ermittelt wird.
Wandscherrate : 4,9 
Leukozytenfluss 
: systemische Leukozytenzahl x (mittlere Durchblutungsgeschwindigkeit 
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Representative Results
IVM nach dem bereitgestellten Protokoll liefert einzigartige Einblicke in die Kaskade der Leukozytenrekrutierung im Skelettmuskel. Der Ergebnisabschnitt konzentriert sich auf typische Ergebnisse von IVM und hebt potenzielle Probleme auf, die auftreten können.
Der Versuchsaufbau für die intravitale Mikroskopie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Vorbereitung des Cremaster-Muskels und die Entfernung des Bindegewebes ist entscheidend, um fokussierte mikroskopische Bilder mit einer gleichmäßigen Oberfläche zu erhalten. Überschüssiges Bindegewebe führt schließlich zu verschwommenen mikroskopischen Bildern (Ergänzendes Video 1) bei der Durchführung von IVM. Abbildung 2 zeigt repräsentative mikroskopische Bilder, die mit IVM gewonnen werden können. Zunächst werden postkapillare Venulen, die zwischen 20 und 40 m Durchmesser haben sollten, durch zusammentretenvon zwei kleineren Gefäßen identifiziert. Nur anhaftende und rollende Leukozyten können visualisiert werden, zirkulierende Leukozyten dürfen nur in Zeitlupenwiedergabe von aufgenommenen Videos verfolgt werden. Die Anzahl der anhaftenden Leukozyten wird als stationäre Leukozyten über einen Zeitraum von 30 Sekunden definiert und pro mm2 der Gefäßoberfläche ausgedrückt (Abbildung 2). Die Anzahl der rollenden Leukozyten, die einen zuvor definierten Querschnitt des Schiffes passieren, wird gezählt; Rollgeschwindigkeiten können in der Offline-Analyse ermittelt werden. Das Walzen kann als Rollfluss (RF = Anzahl der Walzzellen über einer vordefinierten Linie/min) oder als Rollflussfraktion (RFF in % = HF/Gesamt-Leukozytenfluss, der das Gefäß passiert) ausgedrückt werden. RF ist in hohem Maße von der Anzahl der zirkulierenden Zellen abhängig, während RFF weniger von Veränderungen der Anzahl weißer Blutkörperchen (WBCs) betroffen ist. Beachten Sie, dass in vielen Fällen Leukozyten-Haftung und Walzen umgekehrt zusammenhängen; eine hohe Anzahl an anhaftenden Leukozyten kann den Pool frei zirkulierender Zellen reduzieren und somit das Walzen von Leukozyten dämpfen.
Technische Herausforderungen und mögliche Fallstricke
Der Cremaster-Muskel umschließt den Hoden und montiert eine kugelförmige Struktur. Um den Muskel auf die Aufnahmebühne zu montieren, ist ein Längsschnitt erforderlich, um die Kugel zu öffnen. Dies kann die gesamte Mikrovaskulatur beeinträchtigen, da kleine Gefäße abgetrennt werden können. Um Eine Verzerrung gegenüber verändertem Blutfluss zu vermeiden, ist es ratsam, den zentralen Bereich für die Neuordnung zu wählen. Dieser Bereich darf weder berührt noch manipuliert werden. Darüber hinaus kann Mikrokauterie Blutungen und Veränderungen in der mikrovaskulären Hämodynamik verhindern. Der Blutfluss der umliegenden Kapillaren liefert in der Regel einen wertvollen Hinweis, wenn die Durchblutung durch die Vorbereitung im Interessengebiet beeinträchtigt wird. Im Allgemeinen neigen mehr proximale Gefäße (in Richtung des Körpers der Maus) dazu, eine bessere Mikrozirkulation zu zeigen, aber die Bildaufnahme kann durch erhöhte Bewegung und Störungen, die durch das Atmen des Tieres entstehen, erschwert werden.
Um zu verhindern, dass der Cremaster-Muskel während der mikroskopischen Aufnahme austrocknet, ist eine permanente Superfusion des Gewebes hervorragend. Unzureichende oder unterbrochene Befeuchtung führt zum Trocknen des Gewebes und zum Scheitern des Experiments.
Das Anheften des Cremastergewebes ist notwendig, um es gedehnt und an Ort und Stelle zu halten. Um den gestreiften Muskel abzuflachen, ist eine sanfte Dehnung erforderlich. Zu wenig Dehnung führt zu ungleichmäßigem Gewebe, das die Mikroskopie erschwert, übermäßige Dehnung wird den Blutfluss einschränken und das Gewebe schädigen. Auch hier bietet kapillarer Blutfluss einen zuverlässigen Status des gesamten Kreislaufzustandes des Gewebes. Erfahrung und Praxis ist erforderlich, um den Dehnungsgrad bei der Montage des Gewebes zu bestimmen.
Lange Vorbereitungszeiten beeinflussen den allgemeinen Entzündungszustand des Organismus und Bias-Daten. Konzentrieren Sie sich daher bei der Planung des Experiments auf die Frage des Interesses und halten Sie die Vorbereitungszeiten so kurz wie nötig. Wenn keine Arzneimittelverabreichung, Monitor oder Bluttests erforderlich sind, kann eine einzigartige Vorbereitung von Cremaster-Gewebe ausreichen.
In den meisten Umgebungen werden verschiedene Versuchsgruppen mit Wildtieren verglichen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dafür zu sorgen, dass hämodynamische und mikrovaskuläre Parameter zwischen experimentellen Gruppen ähnlich sind (Tabelle 1). Eine Vielzahl von Parametern kann die Leukozytenrekrutierung in vivo beeinflussen, einschließlich Herzleistung, Gefäßdurchmesser, Mittelliniengeschwindigkeit, Wandschergeschwindigkeit und die Anzahl der zirkulierenden Leukozyten. Tabelle 1 zeigt Daten von zwei verschiedenen transgenen Mauslinien, der Dystrophin-Mangelmaus und der Lys-eGFP-Maus (ausdrückend eGFP unter dem Lys-Promotor in Neutrophilen und Makrophagen). Während Parameter wie der Gefäßdurchmesser vom Prüfer gesteuert werden können, hängen Mittelliniengeschwindigkeit und Schergeschwindigkeit von der Hämodynamik der einzelnen Versuchsgruppe oder der Mausdehnung ab. Es ist klar, dass die Mittelliniengeschwindigkeit und die Wandscherrate zwischen mdx- und lys-eGFP-Mäusen (Tabelle 1) signifikant unterscheiden, was einen aussagekräftigen Vergleich von IVM-Daten unmöglich macht (statistische Analyse durch t-Test mit Welchs Korrektur, Signifikanz wurde auf P < 0,05) gesetzt). Die Mittelliniengeschwindigkeit wird durch Herzleistung, periphere Gefäßresistenz und Intravasalvolumen beeinflusst. Zum Beispiel erhöht ein großes Volumen von Rhodamine oder einer anderen experimentellen Substanz, die über den Karotiskatheter gegeben wird, die Geschwindigkeit der postkapillaren Mittellinie und hemmt die Leukozytenaufnahme und das Walzen (Supplemental Video 2). Im Gegenteil, Herzinsuffizienz, tiefe Anästhesie oder Unterkühlung können den postkapillaren Fluss verringern. Bevor man sich der Offline-Analyse von IVM-Daten nähert, sollten Anforderungen an die Datenqualität (z. B. hämodynamische Parameter innerhalb physiologischer Bereiche) definiert werden, um aussagekräftige Schlussfolgerungen zu ziehen und Verzerrungen zu verringern.
Um die Mittelliniengeschwindigkeit zu bestimmen, müssen frei zirkulierende Leukozyten visualisiert werden. Entweder können fluoreszierende Leukozyten (wie bei Lys-eGFP-Mäusen) verwendet werden oder Leukozyten müssen mit fluoreszierenden Reagenzien wie Rhodamine gefärbt werden (Abbildung 3). Rhodamine kann über den Karotiskatheter oder als i.p. Injektion angewendet werden. Da Rhodamine nach und nach auch von anderen Zelltypen aufgenommen wird, ist eine Titration von Dosierung und Zeit unerlässlich. Überschüssige Dosierung und lange Intervalle erzeugen während der Mikroskopie einen signifikanten Hintergrund.
Schließlich weisen wir auf die biologische Vielfalt verschiedener Mausstämme hin. Neben genetisch veränderten Stämmen können auch allgemein anerkannte Wildtypstämme physiologische Varianz aufweisen. Abbildung 4 vergleicht häufig verwendete schwarze 6 (C57BL/6) mit schwarzen 10 (C57BL/10ScSn) Mäusen. Schwarze 6-Mäuse zeigen deutlich verbessertes Walzen, Verhaften und Transmigration von Leukozyten im Vergleich zu schwarzen 10 Mäusen (statistische Analyse durch einwegig ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test; Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt), obwohl beide Stämme als Wildtyp bezeichnet würden. Daher sollte ein korrekter genetischer Hintergrund in Betracht gezogen werden, insbesondere bei der Verwendung transgener Mäuse. In unserem experimentellen Umfeld würde ein Vergleich von schwarzen 6 Mäusen und transgenen Mdx-Mäusen (schwarzer 10-Hintergrund) den verbesserten entzündlichen Zustand von Dystrophin-Mangel-Mdx-Mäusen über ihren korrekten schwarzen 10-Wild-Typ-Hintergrund weitgehend verbergen(Abbildung 4).
Abbildung 1:Schematische Versuchseinrichtung von IVM auf Cremaster-Muskel. Nach der Anästhesie wird die Luftröhre kanüliert und ein Katheter in die Halsschlagader gelegt. Der Cremaster-Muskel wird mit Hilfe der Lichtmikroskopie oder der Fluoreszenzmikroskopie auf einem aufrechten Mikroskop für die intravitale Mikroskopie ausgesetzt und für die intravitale Mikroskopie vorbereitet. Videos werden für eine spätere Offline-Analyse abgerufen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives Postkapillarvenule-Segment aus der intravitalen Mikroskopie mit sequentiellen Rahmen. Die linke Spalte zeigt lichtmikroskopische Bilder, zur besseren Visualisierung ist das Gefäß mit gepunkteten Linien umrandet. Das Venule wird durch Konfluentgefäße (gekennzeichnet durch rote Sternchen) und einen Gefäßdurchmesser von <40 m identifiziert. Die rechte Spalte zeigt eine schematische Darstellung des entsprechenden linken Bildes, die Leukozyten in Rot zeigt. Die ersten vier Zeilen zeigen sequenzielle Bilder desselben Schiffes im Laufe der Zeit. Die untere Zeile zeigt anhaftende Leukozyten an. In der schematischen Darstellung sind einzelne Leukozyten und ihr Walzabstand markiert. In der Offline-Analyse können die Haftung pro Quadratmillimeter, Rollfluss sowie Rollgeschwindigkeit berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Rollende Leukozyten können durch transgene Expression von fluoreszierenden Markern oder durch sekundäre Färbung mit Rhodamin visualisiert werden. Repräsentative mikroskopische Bilder der Leukozytenrekrutierung von eGFP-Leukozyten und Rhodam-markierten Leukozyten von n = 3 Tieren. Rollende Neutrophile, die eGFP unter dem Lys-Promotor von lys-eGFP transgenen Mäusen exzieren, können direkt durch immunfluoreszierende Mikroskopie (linke Spalte) nachgewiesen werden. Leukozyten ohne Fluoreszenzhersteller können durch intravenöse oder intraperitoneale Injektion von Rhodalin (rechte Spalte) gefärbt werden. Bemerkenswert ist, Rhodamine wird nicht ausschließlich von Neutrophilen aufgenommen, was wesentlich mehr Hintergrund gibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich der Leukozytenrekrutierung in verschiedenen transgenen und wilden Mausstämmen. (A) Rolling Flux Fraction, (B) Adhäsion und (C) Transmigration von Leukozyten wird verglichen zwischen schwarz 6 (C57BL/6J), schwarz 10 (C57BL/10ScSnJ) und mdx Mäusen (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), dargestellt als Mittelwert + SEM. Schwarze 6 Mäuse zeigen eine verbesserte Leukozytenrekrutierung im Vergleich zu schwarzen 10 Mäusen. In ähnlicher Weise haben mdx-Mäuse eine größere Rekrutierung im Vergleich zu schwarzen 10, aber nicht im Vergleich zu schwarzen 6 Wild-Typ-Mäusen. Diese Daten zeigen, wie wichtig es ist, korrekte genetische Kontrollen zuzuweisen. Daten von mindestens n = 3 Tieren pro Gruppe. Statistische Analyse durch einwegige ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Analyse. Die Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Maus-Stamm | Nein. von Mäusen | Nein. von venules | Behälterdurchmesser | Mittelliniengeschwindigkeit | Wandscherrate | Systemischer WBC |
| N | N | Μm | s/m/s | s-1 | /l | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 x 4 | 1150 bei 50 | 1010 bei 100 | 5200 bei 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 x 2 | 2220 bei 90 | 2030 bei 90 | 5800 bei 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabelle 1: Relevante hämodynamische und mikrovaskuläre Parameter aus zwei verschiedenen transgenen Mauslinien. Gefäßdurchmesser, Mittelliniengeschwindigkeit, Wandschergeschwindigkeit und systemische WBCs werden für mdx-Mäuse ohne Dystrophin und Lys-eGFP-Mäuse angezeigt. In diesem Beispiel zeigen mdx-Mäuse (C57BL/10J, schwarzer 10-Hintergrund) und Lys-eGFP-Mäuse (C57BL/6J, schwarzer 6-Hintergrund) statistisch unterschiedliche Mittelliniengeschwindigkeit und Wandscherrate und sollten nicht mit IVM verglichen werden. Beispielhafte Daten von mindestens n = 3 Tieren pro Gruppe werden als Mittelwert dargestellt. Statistische Auswertung durch ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. Die Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt.
Ergänzendes Video 1: Mikroskopische Wirkung der unzureichenden Entfernung von Bindegewebe auf Cremaster Muskel. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
Ergänzendes Video 2: Veränderter Blutfluss durch Hypervolämie oder Hypotonie. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
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Discussion
IVM als Methode wurde weit verbreitet verwendet, um verschiedene Zelltypen in verschiedenen Organen zu studieren und wurde ausführlich beschrieben und diskutiert19. Das Hauptziel dieser Studie ist es, einen effizienten Ansatz zu bieten, um IVM im Cremaster-Muskel einzurichten und durchzuführen. Das Üben der Methode führt zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen. Daher sind Planung und Standardisierung Schlüsselfaktoren, um die Technik zu beherrschen. Vor allem ist die Technik sehr abhängig von hämodynamischen und mikrovaskulären Parametern, die genau überwacht und kontrolliert werden müssen. Daher führt eine unterschiedliche Hämodynamik zwischen Gruppen zu irreführenden Ergebnissen.
Trotz seiner Rolle bei der Untersuchung physiologischer und pathologischer Bedingungen, IVM allein kann nicht vollständig entwirren individuelle Beitrag von bestimmten Zelltypen zu Leukozyten Rekrutierung bei Entzündungen. Zu diesem Teil können andere ergänzende Methoden mit IVM kombiniert werden. Ex-vivo-Methoden wie Strömungskammerexperimente können z. B. zwischen den Wirkungen des Endothels oder der Leukozyten ableiten. Auch Strömungskammern sind ausgezeichnete Setups, um Nagetiere Infunde in menschliche Leukozyten zu übersetzen, zum Beispiel bei Neugeborenen20. Darüber hinaus sollten In-vitro-Methoden wie FACS oder Immunhistochemie IVM-Experimente ergänzen. Jede Methode kann spezifische Informationen hinzufügen, die aus einer kontrollierten Umgebung mit wenig verwirrenden Faktoren gewonnen wurden.
Die hier vorgestellte traumatische Cremaster-Vorbereitung ähnelt den physiologischen Ausgangsbedingungen einer Entzündung so genau wie möglich. Doch die obligatorische chirurgische Präparation selbst ist ein Entzündungsreiz, der für die Interpretation in Betracht gezogen werden muss. Pharmakologische TNF-Stimulation des Cremaster-Gewebes kann einen zusätzlichen Modus bieten, um die entzündliche Rekrutierung über den traumatischen chirurgischen Reiz hinaus anzukurbeln16. Darüber hinaus können verschiedene Mausstämme veränderte Reaktionen auf standardisierte Reize zeigen. Wir haben gezeigt, dass selbst häufige Wildtypstämme unterschiedliche Ausgangszustände der Leukozytenrekrutierung aufweisen können. Dies zeigt, wie wichtig es ist, korrekte genetische Kontrollen zuzuweisen und Basisdaten für neue Experimentelle Gruppen bei der Planung von Experimenten festzulegen. Da transgene Stämme heutzutage sehr reichlich vorhanden sind, ist es wahrscheinlich, dass auch die gleichen Stämme im Laufe der Zeit je nach Zucht variieren können.
Insgesamt ist IVM ein leistungsfähiges Instrument zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung im biologischen Kontext der Maus und sollte mit Ex-vivo- und In-vitro-Techniken begleitet werden. Darüber hinaus ermöglicht cremaster IVM eine Vielzahl von verschiedenen Modi, einschließlich spezifischer Zellfärbung, entzündlicher Stimulation oder pharmakologischer Manipulation und Vorbehandlung. Als solche kann es als Plattform dienen, um verschiedene pharmakologische Mediatoren und ihre biologischen Wirkungen in präklinischen Studien insbesondere im Bereich der Entzündung und insbesondere in entzündlichen Muskulaturen zu bewerten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 01GL1746E im Rahmen des PRIMAL-Konsortiums unterstützt. Die Autoren würdigen Britta Heckmann und Silvia Pezer für geschickte technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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