Summary
여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.
Abstract
Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 생체 내에서 백혈구 모집 계단식 내의 생리적 및 병리생리학적 과정을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 현재 프로토콜은 마우스의 손상되지 않은 유기체 내에서 골격 근 유래 조직에서 백혈구 모집으로 이어지는 백혈구 내피 상호작용을 시각화하는 실용적이고 재현 가능한 방법을 나타낸다. 이 모델은 과립구 활성화와 질병에서의 역할에 초점을 맞춘 모든 연구 분야에 적용됩니다.
우리는 방법을 안내하고 잠재적 인 함정과 기술적 인 어려움을 강조하기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험 설정 및 필수 물질, 마우스 마취, 크레마스터 근육 의 해부뿐만 아니라 기관 및 경동맥 통조림, IVM 기록 및 오프라인 분석을 다룹니다. 부착 백혈구, 롤링 플럭스(RF) 및 롤링 플럭스 분획(RFF)과 같은 데이터 형식에 대해 자세히 설명하고 적절한 응용 분야에 대해 설명합니다. 디스트로핀 결핍 mdx 마우스로부터의 대표적인 결과는 결과 섹션에 제공된다.
IVM은 생체 내 환경에서 백혈구 모집을 평가하는 강력한 도구입니다. 그러나, 예를 들어 내피 및 백혈구 기능을 delineating 유동 챔버 실험과 같은 전 생체 설정과 조합을 요구할 수 있습니다. 더욱이, 관심 있는 동물의 유전적 배경은 기준선 모집에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 제공된 프로토콜의 개별적인 미세 조정을 요구한다. 그것의 한계에도 불구하고, IVM은 살아있는 척추 동물 유기체로 시험관 내 사실 인정을 쉽게 번역하는 단상으로 봉사할 수 있습니다.
Introduction
Intravital 현미경 검사법 (IVM)는 백혈구 생물학의 필드에 있는 일반적으로 적용되는 공구입니다. 백혈구 모집은 백혈구 포획, 압연 및 내피 벽에 의한 접착에 의해 시작된 잘 정의된 사건의 연속을 따르며, 마지막으로 염증의 실제 부위로 백혈구의 이주 및 사치를이월한다 1. 각 단계는 다양한 케모카인(예를 들어, IL-8/CXCL8), 수용체(예를 들어, LFA-1, Mac-1) 및 상응하는 내피 세포 접착 분자(예를 들어, ICAM-1, VCAM-1 및 E-Selectin)에 의해 매개및 조절된다2,,3. 상이한 조절 부위의 상호작용은, 백혈구 모집의 조절인자 및 중재자가 고급 당화 말단 제품(RAGE), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), C-X-C 모티프 리간드(CXCL)1/2 및 수용체 CXCR2를 사용하여 IVM,4,5,6,6,,7,,8,9를사용하여 발견하였다.
IVM의 방법은 장10,피부11,림프절12,배아 노른자 자루13 등과 같은 많은 상이한 장기 및 조직에 대해 기술되었다. 그러나, IVM의 가장 널리 연구된 방법은 래트14에서처음 기술된 크레마스터 모델이다. 쥐15에서아직도 아직도 이용되는 동안, 방법은 다른 형질전환 선의 높은 풍부 때문에 마우스에서 주로 최근에 적용됩니다. 우리 그룹은 최근 듀첸 근 이영양증 (DMD)과 같은 염증성 muscolopathies의 분야에서 cremaster IVM의 잠재적 인 역할을 강조하고 있다 dystrophin 결핍 mdx 마우스 를 공부16. 얇은 결합 및 쉽게 접근 할 수있는 섬유 조성으로 인해, cremaster 근육은 빛 또는 형광 현미경 검사법을 사용하여 전체 마운트로 연구 할 수있는 이상적인 후보 근육을 나타냅니다. 백혈구 모집 및 사치는 주로 cremaster 근육에 있는 연속적인 근육 층에 쉽게 확인될 수 있는 포스트 모세관 매경에서 일어날 것입니다.
생체외 에서 의 외 세포 내 세포 화상 진찰의 이점은 살아있는 유기체에 있는 그것의 생물학 문맥이다. 동시에, 변경된 백혈구 모집에 세포 특정 기여를 delineating 는 유동 실 또는 내피 검술과 같은 추가 시험관내 모형을 요구할 수 있습니다. 여러 메서드의 조합은 가장 설득력있는 데이터를 생성합니다. 어떤 외과 조작든지 증가한 백혈구 인신 매매 및 모집으로 이끌어 낼 것이기 때문에 과학자는 cremaster 모형의 한계를 알고 있어야 합니다. 따라서, 기준 모집은이 방법으로 추정하기 어렵다. 광범위한 응용 에도 불구하고, cremaster의 IVM은 도전이 될 수 있으며, 새로운 설정은 설정하는 데 시간과 자원이 걸릴 수 있습니다. 우리는 지금 IVM에서 일반적인 실수의 일부를 방지하는 데 도움이 될 것입니다 쉬운 프로토콜을 제공합니다. 또한 제한 사항에 대해 논의하고 해당되는 경우 무료 방법이 강조 표시됩니다.
cremaster의 IVM은 염증성 및 전염성 연구 분야에서 구현되는 이상적인 접근법을 나타낸다. 보다 구체적으로, cremaster 모형은 선동적인 질병의 맥락에서 골격 근육 생물학을 공부하는 과학자에 높은 관심사일지도 모릅니다.
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Protocol
동물은 IBF(인터파쿨테르 바이오메디치니쉬 포르충세인리히퉁), 하이델베르크에서 통제되고 특정 병원균이 없는 조건 하에 수용되었다. 여기에 설명된 모든 절차는 현지 IRB와 독일 바덴뷔르템베르크의 레히에룽스프라에시듐 카를스루에에 의해 승인되었습니다.
1. 마취 관리
- 125 mg/kg 케타민과 12.5 mg/kg 자일라진의 복강 내 (즉) 볼러스 주사로 마우스를 마취시다.
- 마우스의 체온을 유지하기 위해 가열 패드 상에 등쪽 재배치 위치에 마우스를 놓고 고정합니다(36.5-38°C). 흡수되지 않는 멸균 봉합사(6/0)를 사용하여 정면 치아 주위의 간단한 루프를 감고 봉합사의 접합 끝을 가열 패드에 테이프로 테이프로 보입니다. 이 고정은 호흡에 있는 방해를 피하기 위하여 입을 열어 두는 것을 목표로 합니다.
- 디지털 발가락 핀치에 의해 마취의 적절한 깊이를 마우스를 확인 (철수는 볼 수 없습니다).
- 충분한 마취에 도달하면 외과 준비를 진행합니다. 진행 중인 실험을 따라 30분마다 반복적으로 마취를 확인합니다.
- 평형 생리염 용액 (PSS, 조성: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04,2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)5% CO 2/95% N2를 15분 동안.2 실험 전반에 걸쳐 5%2CO 2/95%N2로 PSS를 지속적으로 포동 포동하게 하고 37°C에서 유지한다.
2. 기관 및 경동맥의 외과 적 준비 (선택 사항)
- 중간선에 핀셋으로 피부를 부드럽게 당겨 목 부위에서 피부를 해부합니다. 가위를 사용하여 직경 1-2cm의 원형 컷을 적용하여 수술 준비를위한 충분한 공간을 제공합니다.
- 핀셋을 사용하여 주변 근육, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 해부하십시오.
- 작은 수술 가위를 사용하여 기관에 횡방향 절단 (~ 1.3 mm)을 만들고 상부 기도를 고정하기 위해 기관의 꼬리 끝 내부에 폴리에틸렌 튜브 (I.D x O.D. 0.034"x 0.050")를 소개합니다.
- 단일 원형 매듭 봉합사 (6/0 USP)에 의해 기관에있는 튜브를 고정합니다.
- 기관의 오른쪽을 따라 경동맥을 찾아 경동맥 벽에서 주변 조직을 해부합니다. 양자택일로, 경정맥 또는 또한 꼬리 정맥은 i.v. 접근을 위해 이용될 수 있었습니다. 미갈 신경에 부상을 피하십시오.
- 경동맥 아래에 봉합사 2개(6/0)를 전달합니다. 경동맥의 분기에 가까운 첫 번째 두개골 봉합사를 근위하게 배치하고 영구적으로 묶으하십시오. 제2 봉합사는 제1 봉기로부터 약 5-8 mm 말단에 위치하고 나중에 경동맥내의 튜브를 고정하는데 사용될 것이다. 아직 묶지 마십시오.
- 식염수로 채워진 1 mL 주사기 바늘에 끝 부분을 구부려 30cm의 길이로 폴리에틸렌 튜브 (I.D x O.D. 0.011"x 0.024")를 준비합니다. 엄격한 홍조는 준비 하는 동안 공기 색증을 방지 하기 위해 중요 하다.
- 7mm 용기 클립을 사용하여 두 번째 봉합사의 경동맥을 비탈리로 고정시다.
- 경동맥에서 작은 횡방향 절단(~0.5 mm)을 수행하고 멸균 폴리에틸렌 튜브를 도입합니다. 전에 제조된 두 번째 봉합사를 사용하여 동맥 내의 튜브를 고정시다.
- 용기 클립을 제거하고 폴리에틸렌 튜브에 연결된 주사기에 약간의 장력을 부드럽게 가합니다. 이 경동맥 카테터는 이제 약물을 투여하거나 필요한 경우 혈액 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있으며, 각 장치에서 혈압 또는 맥박수의 모니터링도 가능합니다.
3. 크레마스터 근육의 외과 적 준비
- 가열 패드 (가열 패드와 함께)에 마우스를 나중에 현미경 검사를위한 무대를 들고 사용자 정의 플라스틱 프레임으로 전송합니다. 현미경 단계를 향한 음낭으로 마우스를 오리엔테이션하십시오.
- 진행하기 전에 마취의 깊이를 재평가; 필요한 경우 마취의 절반 복용량에 분기를 다시 관리.
- 음낭을 현지화하고 핀셋을 사용하여 가장 단부 부분에 들고 부드럽게 당기고 직경이 약 5mm인 음낭 피부의 원형 부분을 잘라냅니다. cremaster 근육과 같은 기본 구조를 손상시키지 않도록하십시오. 식염수로 개방 조직을 잘 수화하십시오.
- 두 개의 핀셋을 사용하여 느슨한 결합 조직을 해부하고 두 고환을 지역화하십시오.
- 한 고환을 단수적으로 잡고 부드럽게 당겨서 주변 결합 조직을 단계적으로 제거하십시오.
- 고환이 외부에 있으면 말단끝을 무대 를 둘러싼 고무 링에 고정합니다. 외장화 시, 전체 공정 중에 식염수로 조직에 수분을 공급하십시오.
- 중요 단계: 조심스럽게 기본 cremaster 근육을 해치지 않고 결합 조직을 제거. 과잉 결합 조직은 나중에 현미경 검사법에 있는 비전을 방해할 수 있고 흐릿한 심상을 생성할 수 있습니다.
- 고환의 말단 부분을 아래로 고정하고 작은 횡방향 절단 (약 1mm)에 의해 cremaster 근육을 열고, 근위 끝까지 매우 원위절부에서 세로 절개. 결과적으로 cremaster 근육은 구형으로 열어야합니다. 거시적으로 보이는 혈관은 혈역학에 영향을 미칠 수 있기 때문에 절단해서는 안됩니다.
- 조심스럽게 유리 단계에 근육을 확산하고 고무 링에 고정. 현미경 검사법은 여기에서 수행될 것이기 때문에 중앙 지역을 만지거나 해치지 않도록 하십시오.
주의: 과도한 스트레칭은 혈류를 방해할 수 있습니다. - 나머지 고환을 따로 고정하여 관심 영역에 액세스할 수 있도록 합니다. 건조를 방지하기 위해 PSS로 반복해서 적시십시오. 장착 된 근육은 이제 현미경 검사법에 대한 준비가되어 있습니다.
4. 활력 내 현미경 검사법
- 장착된 cremaster 근육을 수직 현미경에 놓고 40x 목표를 사용하여 현미경 검사를 수행합니다.
- 높은 처리량 이미징 관광을 사용하여 데이터를 획득하고 내보내기.
- 예열 (35-37 °C) PSS17와연속 과급에서 녹음을 수행합니다. 근육 조직에 목표와 함께 PSS의 지속적인 물방울을 허용하기 위해 현미경의 직립 목표에 녹화 된 작은 튜브에 의해 수퍼 퓨전을 적용합니다.
- 모세관 후 매실(두 개의 작은 용기의 합류)을 식별하고 직경 이 20-40 μm의 베누아의 미세 순환을 측정합니다.
- 30 초의 시간 범위에서 cremaster 근육에서 미세 순환의 고해상도 이미지를 기록합니다. 기록 하는 동안 근육 조직의 약간의 수축 및 이완 있을 수 있습니다., 지속적으로 초점을 조정 해야 합니다. 일반적으로, 마우스는 약 2시간 동안 안정적인 순환을 나타내는 경향이 있다. 다른 지역에서 다른 선박의 여러 기록을 획득 할 수있다. 하나 또는 둘 다 고환을 나중에 사용할 수 있습니다.
참고 : 이것은 염증의 모델이기 때문에, 유도의 일반적인 방법은 다음과 같습니다 : 전신 응용 프로그램 또는 프로 염증 성 중재제의 국소 음낭 주입뿐만 아니라 예를 들어 N-Formylmethionyl-leucyl-페닐라닌 (fMLP)과 함께 수퍼퓨전. 국소 TNF-α 자극은 백혈구 모집을 유발하기 위해 일반적으로 사용된다; LPS-유도 내독증은 SIRS 가혹한 조직 염증의 모형입니다.
5. 백혈구 시각화
참고: 추가 시각화 없이 백혈구를 쉽게 볼 수 있습니다. 자유롭게 움직이는 백혈구의 중심선 속도를 확인하려면 차동 염색을 수행합니다.
- eGFP 표지된 마우스가 이용되는 경우에, 형광 현미경 검사법에 의해 직접 그(것)들을 분석하십시오.
- 비 eGFP 라벨 마우스 균주에 대 한, 로다민 염색을 사용 하 여.
- 0.2 mg/kg 체중에서 로다민 6G를 관리하십시오. 반복 된 복용량 충분 한 염색 강도를 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. 볼륨이 클수록 혈역학 매개 변수에 영향을 줄 수 있기 때문에 작은 볼륨을 유지해야 합니다.
- 백혈구의 즉각적인 염색을 위해 경동맥을 통해 얼룩을 관리하십시오. 경동맥 해부가 수행되지 않은 경우, 동일한용량(18)을사용하여 i.p. 적용에 의해 충분한 염색이 이루어질 수 있다. 경동맥 카테터화의 대안으로 다른 정맥 카테터화를 수행 할 수 있습니다.
참고: 로다민 염색은 eGFP 라벨링과 달리 형광 강도의 시간 감소뿐만 아니라 더 높은 농도에서 백혈구의 약 80 %의 전반적인 염색 최대를 보여줍니다. - 형광 현미경 검사법에 의해 자유롭게 움직이는 로다민 염색 백혈구를 시각화하십시오.
6. 실험 종료
참고: 이 프로토콜을 수행하는 데 는 전체 예상 시간이 90~150분이어야 합니다.
- 자궁 경부 탈구에 의한 안락사와 실험을 종료합니다.
- 추가 분석을 위해, 이민과 같은, PFA에 있는 cremaster 근육을 아직도 무대에 뻗어 필요에 따라 운동학을 위해 염색하는 동안.
7. 오프라인 분석
- 비디오 재생 중에 다음 매개 변수를 단순 개수로 분석합니다.
- 롤링 플럭스 [수/분]: 가상 의 선/분통과 압연 셀의 수 계산
- 접착 [숫자/mm2]: 시야 내의 혈관 벽에 접착된 셀의 수 ≥ 30 s/혈관 표면[mm2].2
- 다음의 혈역학 및 미세 혈관 파라미터를 측정하여 ImageJ를 사용하여 측정한다.
- 용기 직경[μm]을 내벽 지름으로 계산합니다.
- 용기 의 중심선 길이로 용기 길이 [μm]를 계산합니다.
- 중심선에서 자유롭게
움직이는 백혈구의 프레임 간 비디오 분석에서 얻은 중심선 속도를 계산합니다.
- 다음 방정식을 추정으로 사용합니다.
- [mm2]에서혈관 표면을 계산합니다: 용기 길이 [μm] x 용기 직경 [μm] x π x10-6.
- 벽 전단
속도 계산 : 4.9 x (8 x 중심 선 속도 x 0.625 / 용기 직경 [μm]). - 평균 혈류 속도 계산 : 중심선 속도 x 0.625.
- 총 백혈구 플럭스
계산 : 전신 백혈구 수 
x (평균 혈류 속도 x 60/1000) x π x. 
- 롤링 플럭스 분수 [%]: 롤링 플럭스/총 백혈구 플럭스 x 100을 계산합니다.
움직이는 백혈구의 프레임 간 비디오 분석에서 얻은 중심선 속도를 계산합니다.
속도 계산 : 4.9 x (8 x 중심 선 속도 
계산 : 전신 백혈구 수 
x (평균 혈류 속도 
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Representative Results
제공된 프로토콜에 따라 IVM은 골격 근에서 백혈구 모집의 폭포에 대한 독특한 통찰력을 얻을 것이다. 결과 섹션에서는 IVM에서 얻은 일반적인 결과에 중점을 두고 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 강조 표시합니다.
위활력 현미경 검사법에 대한 실험 설정은 그림 1에설명되어 있습니다. cremaster 근육의 준비 및 결합 조직의 제거는 균일 한 표면으로 집중된 현미경 이미지를 얻기 위해 중요합니다. 과잉 결합 조직은 결국 IVM을 수행할 때 흐릿한 현미경 이미지(보충 비디오 1)로이어집니다. 도 2는 IVM을 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 현미경 이미지를 나타낸다. 첫째, 직경이 20-40 μm 사이여야하는 모세관 후 매블은 두 개의 작은 혈관의 합류로 식별됩니다. 부착물 및 롤링 백혈구만 시각화할 수 있으며, 순환 백혈구는 녹화된 비디오의 슬로우 모션 리플레이에서만 추적할 수 있습니다. 부착백혈구의 수는 30초의 시간에 걸쳐 고정된 백혈구로 정의되고 용기 표면의mm2당 발현된다(도2). 용기의 이전에 정의된 단면을 통과하는 압연 백혈구의 수가 계산됩니다. 롤링 속도는 오프라인 분석에서 얻을 수 있습니다. 압연은 롤링 플럭스(RF = 미리 정의된 라인/분위에 압연 셀수) 또는 롤링 플럭스 분획(RFF = RF/총 백혈구 플럭스 플럭스)으로 표현될 수 있습니다. RF는 순환 세포의 수에 크게 의존하는 반면 RFF는 백혈구 수의 변화에 덜 영향을 받습니다(WBC). 대부분의 경우 백혈구 준수 및 롤링은 반비례합니다. 부착 백혈구의 높은 수는 자유롭게 순환 세포의 풀을 감소시키고 따라서 백혈구 압연을 약화 시킬 수 있습니다.
기술적 과제 및 잠재적 인 함정
크레마스터 근육은 고환을 둘러싸고 구형 구조를 조립합니다. 기록 단계에 근육을 장착하려면 구를 열려면 세로 절개가 필요합니다. 이것은 작은 혈관이 절단될 수 있기 때문에 전반적인 미세 혈관 구조에 영향을 미칠 수 있습니다. 변경 된 혈액 흐름에 편견을 피하기 위해, 재정렬에 대 한 중앙 영역을 선택 하는 것이 좋습니다. 이 영역은 만지지도 조작해서는 안 됩니다. 추가적으로, microcautery는 microvascular 혈역학에 있는 출혈 그리고 변경을 방지할 수 있습니다. 주변 모세 혈관의 혈류는 일반적으로 순환이 관심 분야 내에서 준비로 인해 영향을받는 경우 귀중한 힌트를 제공합니다. 일반적으로, 더 근접 혈관 (마우스의 몸을 향해) 더 나은 미세 순환을 보여주는 경향이, 그러나 이미지 캡처 증가 운동 과 동물의 호흡에서 발생 하는 장애에 의해 복잡 할 수 있습니다.
현미경 기록 중에 cremaster 근육이 건조되는 것을 방지하기 위해 조직의 영구적 인 수퍼네이션이 탁월합니다. 불충분하거나 중단된 습혈은 조직의 건조및 실험 실패를 초래할 것이다.
cremaster 조직의 고정은 스트레칭과 장소에 유지하는 데 필요합니다. 줄무늬 근육을 평평하게하려면 부드러운 스트레칭이 필요합니다. 너무 적은 스트레칭은 고르지 않은 조직을 초래하여 현미경 검사를 복잡하게하고 과도한 스트레칭은 혈류를 제한하고 조직에 해를 끼칩니다. 다시 모세관 혈류는 조직의 전반적인 순환 상태의 신뢰할 수있는 상태를 제공합니다. 조직을 장착 할 때 스트레칭의 정도를 결정하기 위해 경험과 연습이 필요합니다.
긴 준비 시간은 유기체 및 바이어스 데이터의 전반적인 염증 상태에 영향을 미칩니다. 따라서 실험을 설계하는 동안 관심 있는 문제에 집중하고 준비 시간을 필요한 만큼 짧게 유지해야 합니다. 약물 투여가 없는 경우, 모니터 또는 혈액 검사가 요구되는 경우 cremaster 조직의 단수 제제만으로도 충분할 수 있다.
대부분의 설정에서, 다른 실험 군은 야생 형 동물과 비교될 것이다. 혈역학 및 미세 혈관 파라미터가 실험군 간에 유사한지 확인하는 것이 매우중요하다(표 1). 다수의 파라미터는 심장 출력, 혈관 직경, 중심선 속도, 벽 전단 속도 및 순환 백혈구 수를 포함하여 생체 내 백혈구 모집에 영향을 미칠 수 있습니다. 표 1은 두 개의 상이한 형질전환 마우스 라인, 디스트로핀 결핍 mdx 마우스 및 lys-eGFP 마우스로부터의 데이터를 디스플레이한다(호중구 및 대식세포에서 의용프로모터 하에서 eGFP를 발현). 용기 직경과 같은 파라미터는 조사자에 의해 제어될 수 있는 반면, 중심선 속도와 전단 속도는 개별 실험군 또는 마우스 스트레인의 혈역학에 따라 달라집니다. 분명히, 중심선 속도와 벽 전단 속도는 MDX와 lys-eGFP마우스(표 1)에서유의하게 다르며 IVM 데이터의 의미 있는 비교가 불가능합니다(웰치의 보정을 통한 t-test에 의한 통계 분석, 유의성은 P< 0.05로 설정하였다). 중심선 속도는 심장 출력, 말초 혈관 저항 및 내체량에 의해 좌우됩니다. 예를 들어, 경동맥 카테터를 통해 주어진 로다민 또는 임의의 다른 실험 물질의 다량은 포스트 모세관 중심선 속도를 증가시키고 백혈구 포획 및 압연을 억제한다(보충비디오 2). 반대로, 심장 부전, 깊은 마취 또는 저체온증은 모세 혈관 후 흐름을 감소시킬 수 있습니다. IVM 데이터의 오프라인 분석에 접근하기 전에 의미 있는 결론을 도출하고 편향을 줄이기 위해 데이터 품질(예: 생리적 범위 내의 혈역학 적 매개 변수)의 요구 사항을 정의해야 합니다.
중심선 속도를 결정하려면 자유롭게 순환하는 백혈구를 시각화해야 합니다. 어느 쪽이든, 형광 백혈구 (lys-eGFP 마우스에서와 같이)가 사용될 수 있거나 백혈구는 로다민과 같은 형광 시제로 염색되어야합니다(그림 3). 로다민은 경동맥 카테터를 통해 또는 i.p. 주사로 적용될 수 있습니다. 로다민은 다른 세포 유형에 의해 점차적으로 채택되기 때문에 복용량과 시간의 적정이 필수적입니다. 과잉 전약 과 긴 간격은 현미경 검사법 도중 중요한 배경을 생성할 것입니다.
마지막으로, 우리는 다른 마우스 긴장의 생물학적 다양성을 지적하고 싶습니다. 유전적으로 변경된 균주 외에, 또한 일반적으로 받아들여지는 야생형 균주는 생리적 차이를 나타낼 수 있다. 그림 4는 일반적으로 사용되는 검정 6(C57BL/6)와 검정 10(C57BL/10ScSn) 마우스를 비교합니다. 블랙 6 마우스는 명확하게 검은 10 마우스에 비해 백혈구의 향상된 압연, 접착 및 이주를 보여줍니다 (Tukey의 포스트 혹 테스트와 단방향 ANOVA에 의한 통계 분석; 유의성은 P <에서 설정되었다; 0.05), 두 균주 모두 야생 유형으로 언급 될 경우에도. 따라서, 정확한 유전 적 배경은 특히 형질 전환 마우스를 활용할 때 고려되어야한다. 우리의 실험 환경에서, 검은 6 마우스와 형질전환 mdx 마우스 (검정 10 배경)의 비교는 크게 그들의 정확한 검은 색 10 야생 형 배경에 디스트로핀 결핍 mdx 마우스의 향상된 염증 상태를 은폐 할 것이다(그림 4).
그림 1: cremaster 근육에 IVM의 개략적 인 실험 설정. 마취 후 기관을 캐뉼로 만들고 카테터를 경동맥에 넣습니다. cremaster 근육은 빛 현미경 검사법 또는 형광 현미경 검사법을 사용하여 직립 현미경에 intravital 현미경 검사법을 위해 드러내고 준비됩니다. 비디오는 나중에 오프라인 분석을 위해 얻어진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 순차프레임을 가진 분과 내 현미경 검사법에서 대표적인 모세관 비누병 세그먼트. 왼쪽 열은 빛 현미경 이미지를 보여 주며, 더 나은 시각화를 위해 용기가 점선으로 윤곽을 그어져 있습니다. 베눌은 동류 용기 (붉은 별표로 표시)와 선박 직경 <40 μm에 의해 식별됩니다. 오른쪽 열은 해당 왼쪽 이미지의 회로도 표현을 나타내며 백혈구를 빨간색으로 표시합니다. 처음 네 행은 시간이 지남에 따라 동일한 선박의 순차적 이미지를 표시합니다. 맨 아래 행은 부착 백혈구를 나타냅니다. 회로도 표현에서 개별 백혈구와 롤링 거리가 표시됩니다. 평방 밀리미터당 오프라인 분석 준수에서 롤링 플럭스와 롤링 속도를 계산할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 압연 백혈구는 형광 마커의 형질전환 발현또는 로다민으로 이차 염색에 의해 가시화될 수 있다. 대표적인 대표적인 현미경 이미지는 n=3마리의 동물로부터 eGFP 백혈구 및 로다민 표지백혈구의 모집이다. 리스-eGFP 형질전환 마우스로부터의 용해기저하에서 eGFP를 발현하는 압연 호중구는 면역형광 현미경 검사법(왼쪽 컬럼)에 의해 직접 검출될 수 있다. 형광 제조자가없는 백혈구는 로다민 (오른쪽 열)의 정맥 또는 복강 내 주사로 얼룩질 수 있습니다. 특히, 로다민은 호중구에 의해 독점적으로 채택되지 않으며 실질적으로 더 많은 배경을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 상이한 형질전환 및 야생형 마우스 균주에서 백혈구 모집의 비교. (A)롤링 플럭스 분획,(B)유혈 및(C)백혈구의 이동은 검정 6 (C57BL/6J), 블랙 10 (C57BL/10ScSnJ) 및 mdx 마우스 (C57BL/10ScSns)와 mdx 마우스 (C57BL/10ScSnxMdxJ) 사이에 비교되며, 평균 + SEM. 블랙 6 마우스를 비교하여 흑마우스를 강화한 10. 유사하게, mdx 마우스는 검정10에 비해 더 큰 모집을 가지고 있지만, 검은 6야생형 마우스에 비해 는 아니다. 이 데이터는 올바른 유전자 제어를 할당하는 것의 중요성을 보여줍니다. 그룹당 적어도 n = 3 마리의 동물의 데이터. Tukey의 사후 분석을 통해 단방향 ANOVA에 의한 통계 분석. 유의는 P < 0.05로 설정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 마우스 변형 | 아니요. 생쥐의 | 아니요. 정맥의 | 용기 직경 | 중심선 속도 | 벽 전단 속도 | 전신 WBC |
| N | N | Μ m | μm/s | s -1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
표 1: 두 개의 서로 다른 형질전환 마우스 라인에서 관련 혈역학 및 미세 혈관 파라미터. 혈관 직경, 중심선 속도, 벽 전단 속도 및 전신 WBC는 디스트로핀 및 lys-eGFP 마우스가 결여된 mdx 마우스에 대해 표시됩니다. 이 예에서 mdx 마우스(C57BL/10J, 검정 10배경)와 lys-eGFP 마우스(C57BL/6J, 블랙 6 배경)는 통계적으로 상이한 중심선 속도 및 벽 전단 속도를 나타내며 IVM을 사용하여 비교해서는 안 된다. 그룹당 적어도 n=3마리의 동물로부터의 예시적인 데이터는 웰치의 보정과 짝이 없는 t-검정에 의한 통계분석으로 평균 ±SEM으로 제시된다. 유의는 P < 0.05로 설정되었습니다.
보충 비디오 1: cremaster 근육에 결합 조직의 부족 한 제거의 현미경 효과. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭).
보충 비디오 2: 고 혈당 또는 저 혈압에 의해 변경 된 혈액 흐름. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭).
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Discussion
방법으로서 IVM은 다른 기관에서 다른 세포 유형을 연구하는 데 널리 사용되어 왔으며 광범위하게 기술되고논의된 19. 이 연구의 주요 목적은 cremaster 근육에서 IVM을 설정하고 수행하는 효율적인 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법을 연습하면 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 계획 및 표준화는 기술을 마스터하는 핵심 요소입니다. 무엇보다도 이 기술은 혈역학 및 미세 혈관 파라미터에 매우 의존하며, 이를 면밀히 모니터링하고 제어해야 합니다. 이와 같이, 그룹 간의 다른 혈역학 오해의 소지가 결과 얻을 것 이다.
생리적 및 병리학적 상태를 연구하는 역할에도 불구하고, IVM 만으로는 염증에서 백혈구 모집에 대한 특정 세포 유형의 개별 적인 기여를 완전히 해명하지 않을 수 있습니다. 이를 위해, 다른 상보적인 방법은 IVM과 결합될 수 있다. 예를 들어, 유동 챔버 실험과 같은 생체 내 외 방법은 내피 또는 백혈구의 효과 사이에서 묘사될 수 있다. 또한, 플로우 챔버는 설치류 소견을 인간 백혈구로 번역하는 우수한 설정, 예를 들어 신생아20. 또한, FACS 또는 면역성화학과 같은 시험관내 방법은 IVM 실험을 보완해야 한다. 각 메서드는 혼동 요소가 거의 없는 제어된 환경에서 얻은 특정 정보를 추가할 수 있습니다.
여기에 제시 된 외상성 cremaster 준비는 가능한 한 가깝게 염증의 생리적 기준선 조건과 유사합니다. 그러나 필수 외과 적 준비 자체는 염증의 자극이며 해석을 고려해야합니다. cremaster 조직의 약리학적 TNF 자극은 외상성 외과자극(16)을넘어 염증성 모집을 향상시키는 추가 모드를 제공할 수 있다. 추가, 다른 마우스 긴장 표준화 된 자극으로 변경 된 응답을 보여줄 수 있습니다. 우리는 일반적인 야생 형 균주조차 백혈구 모집의 다른 기준선 상태를 나타낼 수 있음을 입증했다. 이것은 실험을 계획할 때 올바른 유전자 대조군을 할당하고 새로운 실험 그룹에 대한 기준 데이터를 설정하는 것의 중요성을 보여줍니다. 형질전환 균주는 요즘 매우 풍부하기 때문에, 심지어 같은 균주가 번식에 따라 시간이 지남에 따라 다를 수 있습니다 가능성이 높습니다.
종합하면, IVM은 마우스의 생물학적 맥락에서 백혈구 모집을 모니터링하는 강력한 도구이며 생체 외 및 생체 외 내 기술을 동반해야합니다. 또한, 크레마스터 IVM은 특정 세포 염색, 염증 자극 또는 약리학적 조작 및 전처리를 포함하는 다양한 상이한 모드를 허용한다. 이와 같이 염증 분야에서 특히 염증 분야에서, 그리고 보다 구체적으로 염증성 근병증에서 상이한 약리학적 매개체 및 이들의 생물학적 효과를 평가하는 플랫폼으로서 작용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 PRIMAL 컨소시엄의 일환으로 독일 연방 교육 연구부 (BMBF) 01GL1746E에 의해 지원되었다. 저자는 숙련 된 기술 지원에 대한 브리타 헤크만과 실비아 페저를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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