Summary
Se desarrolló un sistema modelo in vitro para capturar los cambios arquitectónicos del tejido durante la progresión del carcinoma escamoso pulmonar (LUSC) en un cocultivo tridimensional (3D) con fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Este sistema organoide proporciona una plataforma única para investigar las funciones de diversos cambios tumorales-intrínsecos y extrínsecos que modulan el fenotipo tumoral.
Abstract
Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel crítico en el desarrollo de carcinoma escamoso pulmonar (LUSC). Sin embargo, entender cómo estas interacciones dinámicas contribuyen a los cambios arquitectónicos de tejido observados durante la tumorigenesis sigue siendo difícil debido a la falta de modelos apropiados. En este protocolo, se describe la generación de un modelo de cocultivo 3D mediante un cultivo de células primarias LUSC conocido como TUM622. Las células TUM622 se establecieron a partir de un xenoinjerto derivado del paciente LUSC (PDX) y tienen la propiedad única para formar estructuras similares a los acinares cuando se sembran en una matriz de membrana del sótano. Demostramos que TUM622 acini en la cocultura 3D recapitulan las características clave de la arquitectura de tejidos durante la progresión del LUSC, así como las interacciones dinámicas entre las células LUSC y los componentes del microambiente tumoral (TME), incluyendo el extracelular (ECM) y fibroblastos asociados al cáncer (CAC). Adaptamos además nuestro protocolo principal de cultivo 3D para demostrar cómo se podría utilizar este sistema para diversos análisis posteriores. En general, este modelo organoide crea una plataforma biológicamente rica y adaptable que permite obtener información sobre los mecanismos celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la interrupción de las arquitecturas epiteliales durante la progresión del carcinoma y ayudarán a la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas y marcadores de diagnóstico.
Introduction
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. El carcinoma de células escamosas pulmonares (LUSC), que es el segundo tipo más común de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y representa aproximadamente el 30% de todo el cáncer de pulmón, a menudo se diagnostica en etapas avanzadas y tiene un mal pronóstico1. Las opciones de tratamiento para los pacientes con LUSC son una necesidad importante no satisfecha que puede mejorarse mediante una mejor comprensión de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que impulsan la tumorigenesis de LUSC.
Al igual que con la mayoría de los cánceres humanos, la patogénesis de LUSC se caracteriza por la interrupción de la arquitectura intacta y bien ordenada del tejido epitelial2. Durante este proceso, se pierden los contactos adecuados de polaridad celular apical-basal, célula salcelular y matriz celular, lo que permite un crecimiento incontrolado y un comportamiento invasivo de las células tumorales. Ahora se aprecia ampliamente que las características malignas de las células cancerosas no pueden manifestarse sin una interacción importante entre las células cancerosas y su microambiente tumoral local (TME)3. Componentes clave en el TME, incluyendo la matriz extracelular (ECM), fibroblastos asociados al cáncer (CAP), así como células endoteliales e infiltración de células inmunitarias dan forma activa al TME y controla la tumorigenesis4. Sin embargo, nuestra comprensión actual de cómo las células tumorales y estos componentes clave en el TME interactúan para impulsar los cambios arquitectónicos de tejido durante la progresión de LUSC es muy limitada.
El cultivo tridimensional (3D) es una herramienta importante para estudiar las actividades biológicas de los cambios celulares-intrínsecos y extrínsecos en la regulación de los cambios arquitectónicos de tejidos en los tejidos normales y enfermos5. Las culturas 3D proporcionan el contexto estructural y funcional adecuado que generalmente falta en las culturas bidimensionales tradicionales (2D). Las dimensiones añadidas de estos sistemas imitan más de cerca el tejido in vivo en muchos aspectos de la fisiología celular y los comportamientos celulares, incluyendo la proliferación, diferenciación, migración, expresión de proteínas y respuesta al tratamiento farmacológico. En los últimos años, los esfuerzos de varios laboratorios han llevado al desarrollo de modelos 3D in vitro tanto para el pulmón normal como para NSCLC6,7,8. Sin embargo, no estaba disponible un modelo para el carcinoma escamoso pulmonar que puede recapitular tanto los cambios arquitectónicos de tejido dinámico durante la tumorigenesis como incorporar componentes estromales clave.
Aquí, describimos los métodos para establecer un nuevo sistema de cocultura tridimensional (3D) utilizando células LUSC derivadas de PDX primarias (llamadas TUM622) y CAFs9,10. Tanto TUM622 como CAFs se derivan de un paciente NSCLC con tumores mal diferenciados10. Cuando se incrustan como células individuales en ECM, una subpoblación rara de células TUM622 tiene la capacidad de formar organoides con estructuras similares a los acinares que muestran la polaridad celular apical-basal adecuada. Estas estructuras similares a los acinares son hiperplásticas, muestran una expresión heterogénea de marcadores similares a los tallos y diferenciación similares al tumor original, sin dejar de ser invasivos, y por lo tanto imitan la etapa más temprana del desarrollo de LUSC. Es importante destacar que mostramos que la arquitectura tisular de las estructuras similares a los acinares podría ser alterada por la inhibición de las vías de señalización intrínsecas celulares con inhibidores de moléculas pequeñas o la adición de componentes clave en el ECM como los CIF, el último de los cuales mejora la formación de acini y provoca aún más que el acini se vuelva invasivo cuando está cerca. En conjunto, estos datos sugieren que este sistema de cocultivo 3D de organoides LUSC proporciona una plataforma valiosa para la investigación de la reciprocidad dinámica entre las células LUSC y el TME y podría adaptarse para monitorear la respuesta de las células LUSC al tratamiento farmacológico11.
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Protocol
1. Pasar y cultivar células TUM622 y CAFs en cultivos 2D
- Pasar y cultivar células TUM622
- Reactivos cálidos de disociación de células y medios de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)para células TUM622 a 37oC.
- Pasaje de las células TUM622 al 80% de confluencia en matraces 2D. Por lo general, esto ocurre 1 semana después del passaging.
- Deseche el medio viejo de un matraz T75 y lave una vez con 6 ml de tampón HEPES. Evite pipetear directamente sobre las células.
- Aspirar el búfer HEPES. Añadir 4 ml de tripsina/EDTA (0,25 mg/ml, ver Tabla de materiales)para un enjuague rápido y desechar la trippsina/EDTA.
- Añadir 2 ml de trippsina/EDTA e incubar a 37oC durante 5 min. Retire los matraces de la incubadora y toque los matraces para aflojar las células sin crear burbujas de aire y devolver los matraces a la incubadora durante 5 minutos adicionales.
NOTA: La exposición prolongada a la trippsina dañará irreversiblemente las células y alterará su fenotipo, por lo que se recomienda limitar el tiempo que las células están expuestas a la trippsina. - Confirme que las células se han desprendido y disociado bajo un microscopio de luz (4x o 10x). Añadir 4 ml de búfer de neutralización (tampón TNS) (consulte la información del reactivo de subcultivos en la Tabla de materiales) seguido de 10 ml de medio de cultivo 3D (consulte Tabla de materiales).
- Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más las células utilizando una pipeta de 10 ml. Transfiera la suspensión a través de un colador de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml.
- Cuente los números de celda usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
- Semilla 0,8 x 106 células/t75 matraz en 20 ml de medio de cultivo 3D (ver Tabla de materiales).
- Alimente las células cada dos días reemplazando la mitad del medio gastado por un medio fresco.
- Paseado y cultivo de LOS FED
- Pasaje DE los ARCHIVOS convierten cuando las células alcanzan la confluencia. Por lo general, esto ocurre después de 5 días de cultivo de una división 1:2.
- Prepare el medio CAF utilizando un medio basal RPMI con un 20% de suero bovino fetal inactivado por calor, un 1% de L-glutamina y un 1% de penicilina/estreptomicina. Calentar el medio a 37oC.
- En un matraz T75, enjuague los COF con solución salina con fosfato (PBS) una vez y luego agregue 2 ml de trippsina/EDTA e incubaa a 37oC durante 5 min.
- Observar bajo un microscopio de luz para asegurarse de que las células se han disociado en el matraz (4x o 10x). Si no es así, extienda la incubación durante otros 2-3 min.
- Una vez que las células se hayan separado y disociado, agregue 10 ml de medio de cultivo 3D para neutralizar la trippsina/EDTA y la pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para disociar aún más los CAC.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de medio de cultivo 3D (ver Tabla de Materiales)y pasarlo a dos nuevos matraces T75.
2. Placado de células TUM622 en la matriz extracelular para el cultivo 3D
- El día antes del experimento, descongelar los viales de matriz de membrana del sótano en un refrigerador de 4 oC durante la noche. Pipetas de plástico de enfriamiento (2 ml) y puntas a -20 oC durante la noche.
NOTA: No todos los lotes de matriz de membrana del sótano tienen la misma capacidad para apoyar el crecimiento 3D de las células TUM622. Por lo tanto, es necesario adquirir y probar múltiples lotes de matriz de membrana sótano para identificar aquellos que apoyan la formación robusta de acini. Por lo general, esto requiere una mayor concentración de proteínas (16-18 mg/ml) en la matriz. - El día del experimento, medio de cultivo 3D cálido, tampón HEPES, trippsin/EDTA y tampón de neutralización de trippsina (TNS) en un baño de agua de 37 oC. Inmediatamente antes de configurar el cultivo, saque la matriz de membrana del sótano descongelada de la nevera y coloque el vial en hielo.
- Refresque las placas de cultivo de tejido en un enfriador de plataforma metálica colocado en hielo. Coloque los tubos de centrífuga en un estante de enfriamiento de metal sobre hielo.
- Usando las células TUM622 obtenidas del paso 1.1.7, calcule el número deseado de celdas necesarias para el chapado. Típicamente, 15,000-30,0000 células son necesarias por pozo de una placa de 24 pocillos. La densidad más baja es más adecuada para la toma de imágenes y la cuantificación, mientras que se prefiere una mayor densidad al recolectar células para la extracción de ARN o la hincha occidental.
- Transfiera la suspensión celular en un tubo centrífugo refrigerado (cada tubo que contiene células para chapado triplicado) y gire hacia abajo a 300 x g en una centrífuga de cubo colgante a 4 oC durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta aspirante unida a una punta sin filtrar (20 l), dejando aproximadamente 100 l del medio en el tubo (utilice las marcas en el tubo como guía).
- Toque suavemente en el lado del tubo para desalojar y disociar el pellet antes de devolverlo al bastidor de refrigeración.
- Con las pipetas preenfriadas de 2 ml, mezcle suavemente la matriz pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces mientras mantiene el vial en contacto con el hielo. Pipetear a una velocidad uniforme y moderada para que no se introduzcan burbujas en la matriz durante este procedimiento.
- Transfiera el volumen adecuado de la matriz a cada tubo centrífugo. Para triplicados de chapado en una placa de 24 pocillos, agregue 1,1 ml de matriz de membrana de sótano a cada tubo.
- Usando puntas preenfriadas, pipetee la matriz en cada tubo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para hacer una suspensión celular uniforme.
- Transfiera 310 l de suspensión de celda/matriz a cada pocal de una placa de 24 pocillos preenfriada. La pipeta se coloca en un ángulo de 90o con respecto a la superficie de la placa y la suspensión se añade al centro del pozo. La suspensión debe extenderse y cubrir todo el pozo sin necesidad de inclinar la placa.
- Para facilitar el análisis de inmunofluorescencia aguas abajo, placa relte la suspensión celular/matriz en paralelo en diapositivas de cámara de 2 pocillos. Transfiera 100 l de suspensión de celda/matriz al centro de un pozo de diapositivas de cámara de 2 pozos (ver Tabla de Materiales). Esto permite que la matriz forme una estructura similar a una cúpula con un volumen mucho más pequeño.
- Devolver la placa y la cámara a deslizarse de nuevo en una incubadora de cultivo de tejidoe e incubar durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique. Examine la placa/deslizamiento bajo un microscopio de luz para asegurarse de que las células individuales se distribuyen uniformemente dentro de la matriz (4x o 10x).
- Añadir 1 ml de cultivo 3D precalentado medio completo en cada pocata y 1,5 ml de medio de cultivo 3D a cada pocal de la corredera de la cámara y luego devolverlos a la incubadora.
3. Cocultura 3D de células y CAF TUM622 en la matriz extracelular
- Preparar suspensiones celulares de TUM622 y CAF según la sección 2.
- Cuente la densidad celular de CAF tomando 10 s de suspensión celular y mezclándola con 10 s de color azul trypan.
- Añadir 10 l de la mezcla a cada una de las dos cámaras en un hemacitómetro para contar y calcular la densidad celular.
NOTA: Los CAC tienen formas irregulares y es posible que no se cuenten con precisión en un contador de celdas automático. - Co-incorporando células TUM622 y CAFs en la matriz de membrana del sótano
- En función de la información de densidad de celdas, calcule el número deseado de celdas utilizadas para el chapado. Los COF se sembran en una proporción de 2:1 de células TUM622. Por ejemplo, para 30.000 células TUM622 sembradas, 60.000 CRI se co-integran.
- Transfiera el volumen adecuado de TUM622, así como la suspensión celular de los COF en el mismo tubo de centrífuga y siga los pasos 2.5-2.11 para el chapado en placas de 24 pocillos. Para la inmunofluorescencia, transfiera 60 ml de mezcla de TUM622/CAP a portaobjetos de cámara como se describe en el paso 2.12).
- Coculturándose TUM622 con CAFs superpuestos en matriz de membrana de sótano (ver Tabla de Materiales)
- Configure el monocultivo TUM622 según los pasos 2.5-2.13.
- Transfiera el doble de la suspensión de CAF (en comparación con el número de células TUM622 sembradas) en un tubo de centrífuga y gire hacia abajo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender los COF en 1 mL de medio de cultivo 3D.
- Transfiera la suspensión de 1 ml de CAF al pozo que contiene las células TUM622 integradas.
4. Cosecha de TUM622 Acini para la extracción de ARN/proteína y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
- Preparar el tampón de lavado y el tampón de cosecha celular de acuerdo con el protocolo del kit de cosecha de células 3D el día anterior y enfriar durante la noche a 4 oC.
- Mantenga las placas en un enfriador de placas y otros reactivos en hielo antes de iniciar el proceso de extracción.
- Aspirar los medios de los pozos de cultivo 3D sin tocar la matriz y lavar suavemente el pozo 3 veces con 1 ml de tampón de lavado.
- Aspirar el lavado final y añadir 1 ml de tampón de cosecha celular a cada poca.
- Utilice una punta de pipeta p1000 para raspar la matriz de cada poca.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar aún más la matriz.
- Transfiera 1 ml de la mezcla a un tubo cónico pre-enfriado de 15 ml. Añadir otro 1 ml de tampón de cosecha al mismo pozo.
- Repita los pasos 4.5-4.7 y transfiera toda la mezcla del mismo pozo en un tubo cónico de 15 ml.
- Tapar los tubos y la roca a 4oC durante 30 min.
- Llene cada tubo con PBS helado de hasta 10 ml y luego centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 oC.
- Aspirar al sobrenadante sin tocar el pellet. El sobrenadante debe contener fragmentos de matriz, pero todos los esferoides deben recogerse en la parte inferior del tubo.
- Agregue PBS helado para un segundo lavado. Invierta el tubo varias veces para disociar el pellet. Gire hacia abajo a 300 x g durante 5 min.
- Durante el hilado, prepare el tampón de lisis para la recolección de proteínas y ARN.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir tampón de lisis para el procesamiento aguas abajo para recoger proteína o ARN. Alternativamente, las celdas podrían ser resuspendidas para el análisis de flujo/clasificación FACS o el passaging serial.
5. Inmunofluorescencia de TUM622 Acini
- Preparar tampón de inmunofluorescencia (buffer IF: PBS con 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,2% Triton X-100 y 0,05% Tween-20), tampón de bloqueo primario (tampón IF con 10% de suero de cabra), tampón de bloqueo secundario (buffer de bloqueo primario con 20 g/ml de cabra antiratón F(ab')2)
- Aspirar el medio de los portaobjetos de la cámara de 2 pocillos, enjuague una vez con PBS y ponga el portaobjetos en el enfriador de placas metálicas sobre hielo. El portaobjetos de la cámara debe permanecer en el enfriador de la placa metálica para el resto del protocolo.
- Añadir pre-enfriado 4% PFA para fijar el acini e incubar en hielo durante 20 min.
- Retire 4% PFA y lave tres veces con 2 ml de PBS pre-enfriado cada uno durante 5 minutos con un suave balanceo en un balancín.
- Aspirar PBS y permeabilizar con 1,5 ml de 0,5% De Tritón X-100 en PBS (pre-enfriado) durante 20 min. Al final de este procedimiento, la estructura de dome se aflojará.
- Aspirar suavemente el búfer de permeabilización de la corredera de la cámara para evitar la pérdida de muestras. Esto se logra añadiendo una punta fina (20 l) a la pipeta aspirador y presionando la punta hacia la esquina de la cámara.
- Lavar tres veces con 2 ml de PBS pre-enfriado cada uno durante 5 minutos con un suave balanceo en un balancín.
- Bloquee la muestra con el búfer de bloqueo primario en hielo durante 1 h.
- Quite el búfer de bloqueo primario y agregue el búfer de bloqueo secundario y el bloque durante 30 minutos.
- Añadir anticuerpos primarios en el tampón de bloqueo primario e incubar durante la noche a 4 oC.
NOTA: La concentración de los anticuerpos utilizados aquí debe ser mayor de lo que se utiliza normalmente para la tinción de células en el cultivo 2D. La mayoría de los anticuerpos primarios utilizados en este estudio se diluyen a 1:100 de dilución (ver Tabla de Materiales). - Retire los anticuerpos primarios y lave la muestra 3 veces con 2 ml de tampón IF frío.
NOTA: Las muestras podrían estar sueltas, tenga mucho cuidado al aspirar. - Incubar las muestras en anticuerpos secundarios diluidos en tampón de bloqueo primario durante 1 h a RT. Los anticuerpos secundarios preferidos deben ser altamente adsorbidos para reducir la tinción de fondo. La mayoría de los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio se diluyen a 1:200 de dilución.
- Retire los anticuerpos secundarios y lave la muestra 3 veces con 2 ml de tampón IF frío.
NOTA: Las muestras podrían estar sueltas, tenga mucho cuidado al aspirar. - Añadir PBS con DAPI (1:1,000 dilución) durante el último lavado para manchar el núcleo. Realizar otros 2 lavados en PBS.
- Imagen de las muestras en un microscopio confocal en un plazo de 3 días.
NOTA: Debido al tamaño de los organoides y los límites en la distancia de trabajo del objetivo, las muestras generalmente se crean imágenes a una ampliación de 10x o 20x.
6. Preparación de muestras de cultivo 3D para la inmunohistoquímica
- Aspirar el medio de los portaobjetos de la cámara de 2 pozos y enjuaga una vez con PBS.
- Arreglar cultivos 3D en 4% PFA a 37 oC durante la noche.
- Retirar el 4% de PFA, rodear los cultivos con 2,5 ml de gel de muestra de histología (ver Tabla de Materiales)y colocar la diapositiva a 4oC para solidificar durante al menos 1 h.
- Transfiera muestras rodeadas de gel de muestra histológico a casetes de tejido y procesadas en un procesador automatizado de muestras de tejido durante la noche.
- Incruste muestras en cera de parafina y prepárese para el seccionamiento12.
7. Ensayo de citotoxicidad 3D para cribado compuesto (ejemplo para una placa de 96 pocillos)
- Ponga una placa de 96 pocillos en un enfriador de placas, un depósito de 25 ml en un refrigerador de depósito y un tubo cónico de 15 ml sobre hielo antes de iniciar el experimento.
- Preparar suspensiones de matriz celular de células TUM622 en un tubo cónico de polipropileno pre-enfriado de 15 ml añadiendo el volumen adecuado de matriz de membrana de sótano a las células. La densidad deseada para las células TUM622 es de 10.000 células por matriz de membrana de sótano de 70-75 l. Pipetear hacia arriba y hacia abajo un par de veces para permitir incluso la mezcla de células dentro de la matriz.
- Mueva la placa con el enfriador de placas y el depósito con un enfriador de depósito lejos del hielo a una superficie seca para evitar el contacto de la matriz de membrana del sótano con hielo durante la transferencia.
- Transfiera la mezcla de células de matriz al depósito de enfriamiento sin crear burbujas.
- Usando una pipeta mecánica multicanal (10-300 l), transfiera 70-75 l de las células de mezcla a cada poceto apropiado de una placa de 96 pocillos.
- Placa de incubación a 37oC y 5% CO2 durante 30 min para que la matriz de membrana del sótano se solidifique.
- Añadir 100 s de soporte en todas las filas y devolver la placa a la incubadora.
- Comience la dosificación compuesta al día siguiente o más tarde dependiendo del objetivo del experimento.
- Los esferoides se pueden volver a alimentar y volver a realizar la dosificación cada 2-3 días durante un máximo de 10 días, eliminando los medios gastados con un colector de vacío de 8 o 12 pozos y reemplazándolo con medios frescos con o sin compuestos deseados.
- El número de esferoides TUM622 podría cuantificarse utilizando el imager 3D de acuerdo con el protocolo del fabricante.
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Representative Results
TUM622 y CAC en la cultura 2D
La Figura 1 presenta la morfología típica de las células TUM622 y los CAC en el cultivo 2D. Las células TUM622 se redondean con núcleos grandes, mientras que los CAC son planos y alargados. Las células TUM622 pueden alcanzar una confluencia del 80%-90% en el cultivo. Una mayor proliferación conduce a más, pero las células más pequeñas agregadas en colonias que no entran en contacto directo. Por el contrario, los CAC prefieren crecer a mayor densidad celular y seguirán proliferando con plena confluencia si se proporcionan nutrientes suficientes.
Crecimiento y morfología de TUM622 acini en 3D ECM
La Figura 2 presenta un experimento de curso de tiempo de células TUM622 sembradas en cultivo 3D. Los datos muestran que las células TUM622 individuales son capaces de formar organoides con morfologías similares a las de un cinar cuando están incrustadas. Entre los días 5 y 7, un lumen se hace evidente en las estructuras similares a los acinares y permanece hueco a partir de entonces(Figura 2A). Cada acinus, compuesto por una monocapa de células que rodean el lumen hueco, muestra una polaridad apical-basal adecuada similar a la del epitelio pulmonar in vivo(Figura 2B). Estas estructuras similares a los acinares son hiperplásicas y siguen creciendo mientras se proporcionen nutrientes suficientes. El cultivo se puede mantener hasta 24 días antes de que el ECM se desintegre por completo(Figura 2C). Mediante la limitación del ensayo de dilución (LDA) (datos no mostrados), se estima que sólo una subpoblación rara de células TUM622 (<0,02%) tienen la capacidad de formar estructuras similares a los acinares9.
Crecimiento y morfología de la cocultura TUM622-CAFs
La Figura 3 representa la configuración y los resultados representativos de los cocultivos TUM622-CAF. Los CAB podrían integrarse en la cocultura superponiendo encima de la matriz o co-integrados con las celdas TUM622. Independientemente de la configuración, la presencia de LOS CAB mejoró en gran medida el número y el tamaño de los esferoides formados(Figura 3B). Curiosamente, cuando TUM622 acini se acerca nado mucho con los CAL, inducen a los acini a ser invasivos y a migrar hacia los CAL, formando "lágrima-gota" como estructuras(Figura 3C). Tenga en cuenta que TUM622 acini en monocultivo no muestran el comportamiento invasivo y sólo forman "lágrima-gota" como estructuras cuando está cerca de LOS CIF.
Resultados representativos de tinción inmunofluorescentes e inmunohistoquímica
La Figura 4 muestra resultados representativos de la inmunofluorescencia y la tinción inmunohistoquímica de TUM622 acini después de 10 días de cultivo. Las imágenes confocales se tomaron en el plano ecuatorial de TUM622 acini teñido inmunofluorescente(Figura 4A). Por el contrario, cada sección de la muestra de inmunohistoquímica puede capturar acini en diferentes planos(Figura 4B). Ambos resultados mostraron una expresión heterogénea de células similares a los tallos y diferenciadas dentro de cada acinus.
Ensayo de citotoxicidad 3D TUM622 utilizando un inhibidor de la vía Wnt
La Figura 5 muestra la dosis-respuesta de TUM622 acini tratado con XAV939, un inhibidor de la tankyrase(Figura 5A,B). XAV939 se añadió a la cultura 1 día después del chapado y se refrestó cada 2 días durante un total de 10 días. Al final del experimento, el número de acini fue cuantificado por un imager. También se adquirieron imágenes de Brightfield con mayor aumento para capturar la morfología de los esferoides en control frente a los pozos tratados con XAV939(Figura 5C). En general, XAV939 muestra la inhibición dependiente de la dosis en la formación de acini y altera la arquitectura tisular de los esferoides formados. Estos resultados sugieren que se requiere la activación de la vía canónica Wnt durante la morfogénesis de acinar TUM622.
Figura 1: TUM622 y CAP en la cultura 2D. Imágenes representativas de campo brillante de células TUM622 y CAC cultivadas en 2D. Barra de escala a 100 m. Esta figura ha sido modificada de Chen et al.9 y utilizada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento y morfología de TUM622 acini en ECM 3D. (A) Imágenes del curso de tiempo de células TUM622 cultivadas en matriz de membrana del sótano durante un período de 10 días. Barra de escala a 100 m. (B) Inmunofluorescencia de TUM622 acini teñida con marcadores de polaridad celular apical-basal, enzima Golgi (GM-130, verde, apical) e Integrin alfa 6 (CD49f, basal, rojo). (C) Cuantificación del número acini (eje Y derecho, rojo) y el tamaño medio del acini (eje Y izquierdo, azul) chapado en triplicado en una placa de 24 pocillos durante 24 días en cultivo. Las barras de error representan SD. Esta figura ha sido modificada de Chen et al.9 y utilizada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Crecimiento y morfología de la cocultura TUM622-CAFs. (A) Dibujo esquemático de la configuración de la cocultura TUM622-CAFs. Los CIF se superponen o se co-integran con las células TUM62 en ECM. Después de 6-12 días en la cocultura, las células TUM622 son capaces de formar más y más grande acini en comparación con el monocultivo e invadir el ECM cuando están cerca y el contacto directo con los COF. Tenga en cuenta que el fenotipo invasivo sólo se podía observar en el cocultivo. (B) Imagen de Brightfield de cultivos 3D TUM622 en presencia o ausencia de FED superpuestos después de 8 días. Las barras de escala de 200 m.(C) Las imágenes de Brightfield que muestran la formación de acini en forma de gota lagrimal en coculturas, independientemente de los CAM, se superponen o se incrustan en el ECM. Barras de escala a 200 m. Esta figura ha sido modificada de Chen et al.9 y utilizada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la tinción inmunofluorescente e inmunohistoquímica. (A) Tinción de anticuerpos de acini con marcadores de células madre/progenitoras (CXCR4 y SOX2), mesenquime (Vimentin), diferenciación epitelial (Involucrin), apoptosis (Cleaved-Caspase-3) y proliferación (Ki67) en verde, DAPI en azul, E-cadherina y Phalloidin en rojo. Barra de escala a 50 m. (B) Inmunohistoquímica en secciones FFPE de TUM622 acini. Barra de escala a 100 m (arriba) y 50 m (abajo). Esta figura ha sido modificada de Chen et al.9 y utilizada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo de citotoxicidad 3D TUM622 utilizando un inhibidor de la vía Wnt. (A) Cuantificación de los números de esferoide en una placa de 96 pocillos donde las células TUM622 fueron tratadas con dimetil sulfóxido (Control) o XAV939. Cada condición se ensayo en triplicados. Las barras de error representan SD. (B) Imágenes enteras de pozos de una placa de 24 pocillos tomadas con un imager que muestra los efectos inhibitorios de XAV939 en la formación de acini. (C) Imágenes representativas de campo brillante del control frente a los pozos tratados que demuestran los cambios morfológicos causados por el tratamiento Con XAV939. Barras de escala a 100 m. Esta figura ha sido modificada de Chen et al.9 y utilizada con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los tumores son tejidos heterogéneos compuestos de células cancerosas que coexisten lado a lado con células estromales como fibroblastos asociados al cáncer, células endoteliales y células inmunitarias dentro del ECM. Juntos, estos diversos componentes hablan cruzadamente e influyen en el microambiente tumoral, desempeñando un papel activo en la conducción de la tumorigenesis, un proceso que implica cambios progresivos en la arquitectura tumoral. Idealmente, un modelo in vitro de desarrollo tumoral debe ser capaz de capturar los cambios arquitectónicos de tejido dinámico observados en los tumores humanos in vivo, la compleja interacción de diversos tipos de células dentro del microambiente tumoral y al mismo tiempo permitir manipulación experimental tanto en las células tumorales como en los componentes del TME. Aunque se han hecho muchos progresos en los modelos de cáncer 3D en los últimos años, estos modelos no han sido fácilmente próximos para LUSC. La mayoría de los modelos reportados hasta la fecha sólo incorporan algunos aspectos de estas características importantes. Aquí informamos de los métodos para un sistema de cocultura 3D de LUSC que captura simultáneamente los cambios arquitectónicos de tejido clave observados durante el desarrollo de LUSC, así como interacciones dinámicas entre las células tumorales y los principales componentes del TME, incluyendo el ECM y Cafs.
La capacidad de este sistema para modelar con mayor precisión los cambios arquitectónicos de tejido se basa en la propiedad única de las células TUM622 en la formación de organoides con morfologías similares a los acinares cuando se incrustan en 3D EC. Formado a partir de una sola célula auto-renovación, cada acinus se compone de una monocapa de células que rodean un lumen hueco. Esta monocapa de células exhibe polaridad celular apical-basal y sigue siendo no invasiva, se asemeja a la arquitectura tisular del epitelio pulmonar. Mientras que TUM622 como un crecimiento hiperplástico de la exhibición mono-cultivo 3D, la adición de CAFs mejora aún más la morfogénesis acinar e induce más y más grande acini para formar. Es importante destacar que los CIF invocan cambios arquitectónicos de tejido dinámico en las células TUM622 cuando los dos tipos de células se acercan, lo que permite que las células TUM622 pierdan su polaridad apical-basal e invadan la matriz hacia los CAC. Estos cambios fenotípicos recapitulan tanto la hiperplasia temprana como las etapas invasivas tardías del LUSC.
A diferencia de muchos modelos de esferoides tumorales donde cada esferoide está formado por la agregación de muchas células, cada adino TUM622 se deriva de una sola célula9. Por LDA in vitro, se estima que sólo una subpoblación menor (0,02%) de células TUM622 tienen tal capacidad9. Aunque raras, estas células podrían renovarse automáticamente como lo demuestra su capacidad para someterse a un paso en serie en 3D, así como diferenciarse en una población heterogénea de células similar a la del tumor original. Debido a esta característica única de las células TUM622, es fundamental asegurar una distribución uniforme de células TUM622 individuales dentro del ECM en el momento del plating para el cultivo exitoso y el análisis descendente. Para lograr este objetivo, es necesario seguir cuidadosamente varios puntos clave en el protocolo, incluida la determinación de la densidad de sembrado adecuada, manteniendo todas las herramientas y reactivos fríos durante la mezcla de células y matriz para evitar la solidificación prematura, evitando la introducción de burbujas durante el proceso de mezcla y permitiendo tiempo suficiente para que la matriz se solidifique completamente antes de agregar el medio de cultivo. Juntos, estas precauciones ayudarán a lograr un sustrato de matriz más uniforme y una condición de cultivo para todas las células incrustadas.
Una vez establecido con éxito, este cultivo se puede utilizar para una variedad de análisis aguas abajo para diseccionar la célula y el proceso bioquímico que regulan la tumorigenesis. El número y el tamaño de acini formados en cada pozo se pueden monitorear con el tiempo con imágenes de campo brillante y se utilizan como una lectura para la capacidad proliferativa y de auto-renovación de las células TUM622. Se pudo observar una dinámica más detallada en la morfogénesis de cada acinus con imágenes en vivo en un microscopio confocal, con o sin varios colorantes de etiquetado. El medio condicionado se puede recopilar en varios puntos de tiempo durante el período de cultivo para analizar factores solubles que pueden mediar las conversaciones cruzadas de células celulares o matrices celulares. Las células TUM622 extraídas directamente del ECM utilizando el protocolo 4 son adecuadas para la extracción de ARN y proteínas para el análisis de la expresión génica, la cuantificación de citometría de flujo o la clasificación FACS basada en marcadores de superficie celular. Alternativamente, los cultivos podrían fijarse para estudios de inmunofluorescencia in situ o inmunohistoquímica para comprender las distribuciones espacio-temporales de varios marcadores. Aunque similar, la inmunohistoquímica complementa los métodos de inmunofluorescencia en el que permite el muestreo de acini entero que puede no ser posible debido a la limitación de la profundidad de imagen de los objetivos confocales. Para ambos métodos, el tiempo y la temperatura a los que se realizan la fijación y la permeabilización son fundamentales, especialmente teniendo en cuenta que las células TUM622 están incrustadas en una matriz densa (>90% matriz de membrana de sótano) en contraste con muchos otros cultivos 3D donde la densidad de la matriz es mucho menor. Por lo tanto, la atención a la fijación y el procesamiento estandarizados y coherentes es necesario para obtener resultados replicativos.
Usando este sistema como plataforma, se puede investigar cómo los cambios intrínsecos celulares en las células tumorales, así como los cambios celulares-extrínsecos en el microambiente tumoral, influir en la arquitectura epitelial y modelar los primeros eventos involucrados en la formación de carcinoma. Por ejemplo, las funciones de los oncogenes o genes supresores de tumores en la regulación de la arquitectura del tejido tumoral podrían estudiarse mediante experimentos de ganancia o pérdida de función dirigidos al gen de interés en las células tumorales. De hecho, demostramos que la sobreexpresión de SOX2, que se observa comúnmente en LUSC, altera el fenotipo de las células TUM622 como lo demuestra la pérdida de hiperplasia en 3D y la progresión hacia el crecimiento displásico9. Por otro lado, se podría comparar los fibroblastos normales frente al cáncer en entornos de cocultivo, determinar cómo los componentes de la matriz o su rigidez afectan el crecimiento/morfología/invasión de los acini, y si el bloqueo de ciertas citoquinas podría interferir con la comunicación celular y, a su vez, afectar la arquitectura del tejido y la progresión tumoral. Es importante destacar que todos estos ensayos podrían realizarse en presencia o ausencia de ciertos agentes terapéuticos y ser utilizados como una herramienta para determinar la respuesta farmacológica de las células LUSC con una lectura multidimensional11. También es importante señalar que este sistema es limitado en lo que respecta a las vías que podría utilizarse para interrogar, ya que sólo algunas vías de señalización principales, pero no todas, regulan el crecimiento y la morfología de los organoides TUM622 en cultivo (es decir, la inhibición de Wnt pero no la señalización Notch afecta a la mophogénesis acinar de las células TUM622)9.
En resumen, demostramos que este sistema organoide proporciona una plataforma única para generar nuevos conocimientos sobre la interacción dinámica entre las células LUSC y el microambiente tumoral durante la progresión tumoral. Anticipamos que nuestro sistema modelo será una plataforma valiosa para el descubrimiento y desarrollo de fármacos. En este sentido, la detección de nuevas terapias contra el cáncer en un contexto de tejido tumoral nativo debe ayudar en la selección y desarrollo de terapias más eficaces dirigidas a LUSC.
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Disclosures
Los autores son empleados y accionistas de Pfizer Inc.
Acknowledgments
Agradecemos a Magali Guffroy, John Kreeger y Stephani Bisulco del grupo Detopatología y Biomarcador de Pfizer-Oncología por su apoyo a la patología/histología y a Michael Arensman por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Programa Postdoctoral de Pfizer y al grupo de I+D oncológica, específicamente a Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin y Jennifer Tejeda por su apoyo al programa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
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