Summary
İn vitro model sistemi, akciğer skuamöz karsinomu (LUSC) ilerlemesi sırasında kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF) 3 boyutlu (3D) bir ortak kültürde doku mimari değişikliklerini yakalamak için geliştirilmiştir. Bu organoid sistem tümör fenotip modüle çeşitli tümör hücre içsel ve dışsal değişikliklerin rollerini araştırmak için benzersiz bir platform sağlar.
Abstract
Tümör-stroma etkileşimleri akciğer skuamöz karsinom (LUSC) gelişiminde kritik bir rol oynamaktadır. Ancak, bu dinamik etkileşimlerin tümörigenez sırasında gözlenen doku mimari değişikliklerine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak, uygun modellerin olmaması nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Bu protokolde, TUM622 olarak bilinen Bir LUSC birincil hücre kültürünü kullanarak bir 3B coculture modelinin oluşumunu tanımlıyoruz. TUM622 hücreleri Bir LUSC hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) kuruldu ve bir bazal membran matris tohumlu zaman acinar benzeri yapılar oluşturmak için benzersiz özelliği var. 3D kokültürdeki TUM622 acini'nin LUSC ilerlemesi sırasında doku mimarisinin temel özelliklerinin yanı sıra LUSC hücreleri ile tümör mikroortamının (TME) bileşenleri arasındaki dinamik etkileşimleri, hücre dışı matris (ECM) ve kanserle ilişkili fibroblastlar (CAFs). Bu sistemin çeşitli downstream analizleri için nasıl kullanılabileceğini göstermek için temel 3D kültür protokolümüzü daha da uyarlıyoruz. Genel olarak, bu organoid model karsinom ilerlemesi sırasında epitel mimarilerinin bozulmasını teşvik hücre içsel ve dışsal mekanizmalar içine fikir kazanmak için olanak sağlayan bir biyolojik zengin ve uyarlanabilir platform oluşturur ve yardımcı olacaktır yeni terapötik hedefler ve tanı belirteçleri için arama.
Introduction
Akciğer kanseri dünya çapında kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenidir. Akciğer skuamöz hücreli karsinom (LUSC), hangi olmayan küçük hücreli akciğer kanseri ikinci en yaygın türüdür (NSCLC) ve tüm akciğer kanserinin yaklaşık% 30 hesapları, genellikle ileri evrelerde teşhis edilir ve kötü prognoz vardır1. LUSC hastaları için tedavi seçenekleri, LUSC tümörigenezini yönlendiren altta yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile geliştirilebilen önemli bir karşılanmamış ihtiyaçlardır.
Çoğu insan kanserlerinde olduğu gibi, LUSC patogenezi bozulmamış bozulması ile karakterizedir, iyi sıralanmış epitel doku mimarisi2. Bu süreçte, uygun apikal-bazal hücre polaritesi, hücre-hücre ve hücre-matriks kontaklar kaybolur, kontrolsüz büyüme ve tümör hücrelerinin invaziv davranış sağlar. Kanser hücrelerinin malign özelliklerinin kanser hücreleri ile yerel tümör mikroçevreleri (TME) arasında önemli bir3etkileşim olmadan ortaya çıkarılamadığı artık yaygın olarak takdir edilmektedir 3. Ekstrasellüler matriks (ECM), kanserle ilişkili fibroblastlar (CAFs) yanı sıra endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri sızma dahil TME önemli bileşenleri aktif TME şekil ve tümörigenesis sürücüler4. Bununla birlikte, Tümör hücrelerinin ve TME'deki bu temel bileşenlerin LUSC ilerlemesi sırasında doku mimari değişikliklerini yönlendirmek için nasıl etkileşime girdiğine dair mevcut anlayışımız çok sınırlıdır.
Üç boyutlu (3D) kültür, hem normal hem de hastalıklı dokularda doku mimari değişikliklerini düzenleyen hücre içsel ve dışsal değişikliklerin biyolojik faaliyetlerini incelemek için önemli bir araçtır5. 3B kültürler genellikle geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlerde eksik olan uygun yapısal ve işlevsel bağlamı sağlar. Bu tür sistemlerin eklenen boyutları, hücre fizyolojisi ve hücresel davranışların birçok alanında, çoğalma, farklılaşma, göç, protein ekspresyonu ve ilaç tedavisine yanıt dahil olmak üzere in vivo dokuyu daha yakından taklit eder. Son yıllarda, çeşitli laboratuvarlardan gelen çabalar hem normal akciğer hem de NSCLC6,7,,8için in vitro 3D modellerin geliştirilmesine yol açmıştır. Ancak, tümörigenez sırasında hem dinamik doku mimari değişiklikleri hem de önemli stromal bileşenleri dahil özetleyebilir akciğer skuamöz karsinom için bir model kullanılamaz.
Burada, birincil PDX türetilmiş LUSC hücreleri (TUM622 olarak da adlandırılır) ve CAFs9,10kullanarak yeni bir 3 boyutlu (3D) coculture sistemi kurma yöntemlerini açıklıyoruz. Hem TUM622 hem de CAFs, az diferansiye tümörlü NSCLC hastasından türetilmiştir10. ECM'de tek hücre olarak gömülü olduğunda, TUM622 hücrelerinin nadir bir alt popülasyonu uygun apikal bazal hücre polaritesini gösteren acinar benzeri yapılara sahip organoidler oluşturma kapasitesine sahiptir. Bu acinar benzeri yapılar hiperplastiktir, kök benzeri heterojen bir ifade gösterir ve orijinal tümöre benzer farklılaşma belirteçleri gösterirken non-invaziv olarak kalır lar ve böylece LUSC gelişiminin en erken evresini taklit eder. Daha da önemlisi, açinar benzeri yapıların doku mimarisinin hücre içi sinyal yollarının küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya AF gibi ECM'deki anahtar bileşenlerin eklenmesiyle değiştirilebileceğini gösterdik, ikincisi acini oluşumunu geliştirir ve acini'yi yakın mesafede yken invaziv hale getirmek için daha da kışkırtır. Birlikte, bu veriler LUSC organoidlerin bu 3D co-kültür sistemi LUSC hücreleri ve TME arasındaki dinamik karşılıklılık soruşturma için değerli bir platform sağlar ve ilaç tedavisi11LUSC hücrelerinin yanıtını izlemek için adapte edilebilir öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 2B Kültürlerde TUM622 Hücrelerinin ve KAF'lerinin Geçirilmesi ve Depolanması
- TUM622 hücrelerinin geçişi ve culturing'i
- 37 °C'deki TUM622 hücreleri için sıcak 3B kültür ortamı ve hücre dissosyonu reaktifleri (bkz.
- 2D şişelerde %80 birleşmede TUM622 hücreleri bulunur. Genellikle, bu passaging sonra 1 hafta oluşur.
- Eski orta yığımı bir T75 şişesinden atın ve 6 mL HEPES tamponuyla bir kez yıkayın. Doğrudan hücrelere boru lamaktan kaçının.
- HEPES tamponu aspire edin. Hızlı bir durulama için 4 mL tripsin/EDTA (0.25 mg/mL, bkz. Malzemeler Tablosu)ekleyin ve trypsin/EDTA'yı atın.
- 2 mL tripsin/EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5 dk.
NOT: Tripsin'e uzun süre maruz kalmak hücrelere geri dönülmez şekilde zarar verir ve fenotiplerini değiştirir, böylece hücrelerin tripsine maruz kalma süresini sınırlaması önerilir. - Hücreleri ışık mikroskobu (4x veya 10x) altında ayırıp ayırın. 4 mL nötralizasyon arabelleği ekleyin (TNS arabelleği) (Bkz. Malzemeler Tablosundakialt kültür reaktif bilgileri) ve ardından 10 mL 3B kültür ortamı (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Pipet, hücreleri 10 mL'lik bir pipet kullanarak daha fazla ayrıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı. Süspansiyonu 40 m'lik hücresüzden 50 mL konik bir tüpe aktarın.
- Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını sayın.
- Tohum 0.8 x 106 hücre/T75 şişesi 20 mL 3D kültür ortamı (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Harcanan ortamın yarısını taze ortamla değiştirerek hücreleri her gün besleyin.
- Passaging ve kafs culturing
- Hücreler birleştiğinde geçiş CAF'leri oluşur. Genellikle, bu 1:2 bölünmüşten culturing 5 gün sonra oluşur.
- % 20 ısı-inaktive fetal sığır serum, 1% L-Glutamin ve% 1 Penisilin / Streptomisin ile RPMI bazal orta kullanarak CAF orta hazırlayın. Orta yı 37 °C'ye ısıtın.
- Bir T75 şişesinde, fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın CAF'leri bir kez durulayın ve 2 mL tripsin/EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Hücrelerin şişede (4x veya 10x) ayrıştırılmış olduğundan emin olmak için bir ışık mikroskop altında gözlemleyin. Değilse, başka bir 2-3 dakika için kuluçka uzatın.
- Hücreler ayrıldıktan ve ayrıldıktan sonra, 10 mL 3B kültür ortamı ekleyerek trypsin/EDTA'yı nötralize edin ve pipetleri birkaç kez yukarı ve aşağı nötralize edin ve CAF'leri daha da ayrıştırın.
- Hücre süspansiyonuna 50 mL konik bir tüp aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Supernatant atın ve 3D kültür ortamı uygun bir hacimde pelet resuspend (Malzemeler Tablosubakınız) ve iki yeni T75 şişeleri içine geçiş.
2. 3D Culturing için Ekstrasellüler Matristeki Hücrelerin Kapama
- Deneyden bir gün önce, bir gecede 4 °C'lik bir buzdolabında bodrum membran matrisinin şişelerini eritin. Soğutma ve plastik pipetler (2 mL) ve ipuçları -20 °C gecede.
NOT: Tüm bodrum membran matrislerinin tümü TUM622 hücrelerinin 3Boyutlu büyümesini destekleyecek kapasiteye sahip değildir. Bu nedenle, sağlam acini oluşumunu destekleyenleri belirlemek için birden fazla sayıda bodrum membran matrisi elde etmek ve test etmek gerekir. Genellikle, bu matris daha yüksek bir protein konsantrasyonu (16-18 mg / mL) gerektirir. - Deney günü, sıcak 3D kültür ortamı, HEPES tampon, tripsin/EDTA ve tripsin nötralizasyon tamponu (TNS) 37 °C su banyosunda. Kültürü kurmadan hemen önce, çözülmüş bodrum membran matrisini buzdolabından alın ve şişeyi buza koyun.
- Buz üzerine yerleştirilen metal bir platform soğutucu üzerinde doku kültür plakaları soğuma. Santrifüj tüpleri metal bir soğutma rafına buz üzerine yerleştirin.
- Adım 1.1.7'den elde edilen TUM622 hücreleri kullanılarak, kaplama için gerekli olan hücre sayısını hesaplar. Tipik olarak, 15.000-30.000 hücreleri 24-well plaka iyi başına gereklidir. RNA ekstraksiyonu veya batı lekeleme için hücre toplarken daha düşük yoğunluk görüntüleme ve niceleme için daha uygundur.
- Hücre süspansiyonunu soğutulmuş bir santrifüj tüpüne (üç kat kaplama için hücre içeren her tüp) aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca asılı bir kova santrifüjünde 300 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Supernatant'ı filtrelenmemiş bir uça (20 μL) bağlı bir boru yla dikkatlice aspire edin ve tüpte ortamın yaklaşık 100°L'sini bırakabilirsiniz (kılavuz olarak tüpüzerindeki işaretleri kullanın).
- Soğutma rafına geri vermeden önce peleti çıkarmak ve çıkarmak için tüpün yan tarafına hafifçe dokunun.
- 2 mL önceden soğutulmuş pipetleri kullanarak, şişeyi buzla temas halinde tutarken birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak matrisi hafifçe karıştırın. Bu işlem sırasında matrisiçine kabarcıklar girilmesin diye düzgün ve orta hızda pipet.
- Matrisin uygun hacmini her santrifüj tüpüne aktarın. 24 kuyulu bir plakaiçinde kaplama triplicates için, her tüp için 1.1 mL bazal membran matris ekleyin.
- Önceden soğutulmuş ipuçları kullanarak, pipet tek tip bir hücre süspansiyon yapmak için her tüp yukarı ve aşağı yaklaşık 10 kez matris.
- Önceden soğutulmuş 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya 310 μL hücre/matris süspansiyonu aktarın. Pipet plaka yüzeyine 90° açıyla yerleştirilir ve süspansiyon kuyunun ortasına eklenir. Süspansiyon, plakayı yatırmaya gerek kalmadan tüm kuyuyu kapsamalı ve yayılmalıdır.
- Downstream immünororesans analizini kolaylaştırmak için hücre/matris süspansiyonu 2 kuyulu oda slaytlarına paralel olarak plakalayın. 100 μL hücre/matris süspansiyonu 2 kuyulu bir hazne kaydırağının ortasına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Bu matris çok daha küçük hacimli bir kubbe gibi bir yapı oluşturmak için izin verir.
- Plakayı ve hazneyi bir doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün ve matrisin katılaşabilmesi için 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tek hücrelerin matris (4x veya 10x) içinde eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için plakayı/kaydırağı ışık mikroskobu altında inceleyin.
- Her kuyuya önceden ısıtılmış 3D kültür tam orta 1 mL ve oda slayt her kuyuya 3D kültür orta 1 mL ekleyin sonra kuvöz onları geri dönün.
3. Hücre Dışı Matrikste TUM622 Hücrelerinin ve KF'lerinin 3Boyutlu Kokülatyonu
- Tum622 ve CAF'lerin hücre süspansiyonlarını bölüm 2'ye göre hazırlayın.
- 10 μL hücre süspansiyonu alarak ve 10 μL trypan mavisi ile karıştırarak CAF hücre yoğunluğunu sayın.
- Hücre yoğunluğunu saymak ve hesaplamak için bir hemacytometre üzerindeki iki odanın her birine karışımın 10 μL'sini ekleyin.
NOT: CAF'ler düzensiz şekillere sahiptir ve otomatik hücre sayacında doğru bir şekilde sayılamaz. - Temel membran matrisinde TUM622 hücrelerini ve CAF'lerini birlikte katıştırma
- Hücre yoğunluğu bilgilerine dayanarak, kaplama için kullanılan hücre sayısını hesaplayın. CAF'ler TUM622 hücrelerinin 2:1 oranında tohumlanır. Örneğin, tohumlanmış 30.000 TUM622 hücresi için 60.000 CAF birlikte gömülür.
- TUM622'nin uygun hacmini ve CAFs hücre süspansiyonunun aynı santrifüj tüpüne aktarılmasını ve 24 kuyulu plakalara kaplama için 2.5-2.11 adımlarını takip edin. İmmünofloresans için, adım 2.12'de açıklandığı gibi TUM622/CAFkarışımının 60 μL'lik kısmını oda slaytlarına aktarın.
- Tum622'nin bodrum membran matrisinde kaplı CAM'ları ile birleştirme (bkz. Malzeme Tablosu)
- TUM622 mono-kültürünü 2.5-2.13 adımlarına göre ayarlayın.
- Bir santrifüj tüpüne CAF süspansiyonunun iki katı kadar (tohumlu TUM622 hücre sayısına göre) aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de aşağı doğru döndürün.
- Supernatant aspire ve 3D kültür ortamı 1 mL CAFs resuspend.
- 1 mL'lik CAF süspansiyonuna gömülü TUM622 hücrelerini içeren kuyuya aktarın.
4. RNA/Protein Ekstraksiyonu ve Floresan Aktive Hücre Ayıklama (FACS) için TUM622 Acini Hasat
- Önceki gün 3D hücre hasat kiti protokolüne göre yıkama tamponu ve hücre hasat tamponu hazırlayın ve 4 °C'de gece boyunca soğutun.
- Ekstraksiyon işlemine başlamadan önce plakaları bir tabak soğutucusunda ve buz üzerinde diğer reaktifler üzerinde tutun.
- Matris dokunmadan 3D kültür kuyuları aspire medya ve yavaşça yıkama tampon 1 mL ile iyi 3 kez yıkayın.
- Son yıkama aspire ve her kuyuya hücre hasat tampon 1 mL ekleyin.
- Her kuyunun matrisini kazımak için p1000 pipet ucu kullanın.
- Pipet yukarı ve aşağı daha fazla matris ayrıştırmak için.
- Karışımın 1 mL'sini önceden soğutulmuş 15 mL konik tüpe aktarın. Aynı kuyuya 1 mL daha toplama tamponu ekleyin.
- Adımları 4,5-4,7'yi tekrarlayın ve aynı kuyunun tüm karışımını 15 mL konik bir tüpe aktarın.
- Tüpleri ve kayaları 4 °C'de 30 dk kaplayın.
- Her tüpü 10 mL'ye kadar buz gibi PBS ile doldurun ve ardından 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
- Pelet dokunmadan supernatant aspire. Süpernatant matris parçaları içermelidir, ancak küresel lerin hepsi tüpün alt kısmında toplanmalıdır.
- İkinci bir yıkama için buz gibi PBS ekleyin. Peleti dağıtmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. 5 dk için 300 x g aşağı spin.
- Dönerken protein ve RNA toplama için lysis tamponu hazırlayın.
- Dikkatle supernatant aspire ve protein veya RNA toplamak için aşağı işleme için lysis tampon ekleyin. Alternatif olarak, hücreler akış analizi/FACS sıralama veya seri geçiş için yeniden askıya alınabilir.
5. TUM622 Acini'nin immünoresansı
- İmmünofloresan tamponu (IF tampon: PBS %0.1 büyükbaş serum albumini (BSA), %0.2 Triton X-100 ve %0.05 Ara-20), birincil engelleme tamponu (%10 keçi serumu ile tampon varsa), sekonder bloke tampon (20 μg/mL keçi anti-mousef(ab(ab(2)ile birincil blokaj tamponu
- 2 kuyuluk oda slaytlarından aspirasyon ortamı, PBS ile bir kez durulayın ve kaydırağı buz üzerinde metal plaka soğutucusuna yerleştirin. Oda slayt protokolün geri kalanı için metal plaka soğutucu üzerinde kalmalıdır.
- Önceden soğutulmuş 4% PFA acini düzeltmek ve 20 dakika buz üzerinde kuluçka ekleyin.
- %4 PFA'yı çıkarın ve her biri 5 dakika boyunca 2 mL önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın ve bir kaya nın üzerinde hafif çetrelen.
- PBS'yi aspire edin ve 20 dakika boyunca PBS'de (önceden soğutulmuş) %0,5 Triton X-100 ile permeabilize edin. Bu işlemin sonunda kubbe benzeri yapı gevşer.
- Örnek kaybını önlemek için oda kaydıraktan permeabilizasyon tamponunu yavaşça aspire edin. Bu, boru nun kesişme pipete ince bir ucu (20 μL) eklenmesi ve ucun odanın köşesine doğru bastırılması yla elde edilir.
- Her biri 5 dakika boyunca 2 mL önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın ve bir rocker üzerinde hafif çetrelen.
- 1 saat buz üzerinde birincil engelleme tampon ile örnek blok.
- Birincil engelleme arabelleği kaldırın ve 30 dakika boyunca ikincil engelleme arabelleği ve blok ekleyin.
- Primer blokaj tamponuna primer antikorlar ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Burada kullanılan antikorların konsantrasyonu 2B kültüründeki hücrelerin boyanması için normalden daha yüksek olmalıdır. Bu çalışmada kullanılan birincil antikorların çoğu 1:100 seyreltme de seyreltilir (bkz. Malzemeler Tablosu). - Birincil antikorları çıkarın ve numuneyi 2 mL soğuk IF tamponu ile 3 kez yıkayın.
NOT: Örnekler gevşek olabilir, aspirating zaman ekstra dikkatli olun. - Numuneleri, rt'de 1 saat boyunca primer blokaj tamponunda seyreltilmiş ikincil antikorlarda kuluçkaya yatırın. Tercih edilen ikincil antikorlar arka plan boyama azaltmak için yüksek çapraz adsorbe edilmelidir. Bu çalışmada kullanılan sekonder antikorların çoğu 1:200 seyreltme de seyreltilir.
- İkincil antikorları çıkarın ve numuneyi 2 mL soğuk IF tamponu ile 3 kez yıkayın.
NOT: Örnekler gevşek olabilir, aspirating zaman ekstra dikkatli olun. - Çekirdeği lekelemek için son yıkama sırasında DAPI (1:1.000 seyreltme) ile PBS ekleyin. PBS başka bir 2 yıkıntı gerçekleştirmek.
- Örnekleri 3 gün içinde konfokal mikroskopta görüntüleyin.
NOT: Organoidlerin büyüklüğü ve hedefin çalışma mesafesindeki sınırları nedeniyle numuneler genellikle 10x veya 20x büyütme de görüntülenir.
6. İmmünohistokimya için 3D Kültür Örneklerinin Hazırlanması
- 2 kuyulu oda kaydıraktan aspire ortamı ve PBS ile bir kez durula.
- 3D kültürleri bir gecede 37 °C'de %4 PFA'da sabitle.
- %4 PFA'yı çıkarın, 2,5 mL histoloji örnek jeli ile kültürleri çevreler (Bkz. Malzeme Tablosu)ve en az 1 saat katılaşmak için kaydırağı 4 °C'ye yerleştirin.
- Histolojik numune jeli ile çevrili örnekleri doku kasetlerine aktarın ve bir gecede otomatik doku örneği işlemcisinde işleyin.
- Örnekleri parafin balmumuna gömün ve12.
7. Bileşik Tarama için 3D Sitotoksisite Tsay (Örnek Bir 96-well Plaka)
- Deneye başlamadan önce bir plaka soğutucusuna 96 kuyuluk bir plaka, bir rezervuar soğutucusuna 25 mL rezervuar ve buz üzerinde 15 mL konik tüpler ayarlayın.
- Tum622 hücrelerinin hücre matris süspansiyonlarını önceden soğutulmuş 15 mL polipropilen konik tüpte, bazal membran matrisinin uygun hacmini hücrelere ekleyerek hazırlayın. TUM622 hücreleri için istenilen yoğunluk, 70-75 μL bazal membran matrisinde 10.000 hücredir. Pipet birkaç kez yukarı ve aşağı bile matris içinde hücrelerin karıştırma izin vermek.
- Transfer sırasında bodrum membran matrisinin buzla temasını önlemek için, plaka soğutucusu ve rezervuar soğutucusu ile buzdan kuru bir yüzeye doğru hareket ettirin.
- Kabarcıklar oluşturmadan soğutma rezervuar matris hücre karışımı aktarın.
- Mekanik çok kanallı pipet (10-300 μL) kullanarak, karışım hücrelerinin 70-75 μL'sini 96 kuyulu bir plakanın her uygun kuyuya aktarın.
- 37 °C'de kuluçka plakası ve 30 dk için %5 CO2 katılaşmak için.
- Tüm satırlara 100 μL ortam ekleyin ve plakayı kuvöze geri döndürün.
- Denemenin amacına bağlı olarak ertesi gün veya daha sonra bileşik dosing başlatın.
- Sferoidler, harcanan ortam 8 veya 12 kuyulu vakum manifoldu ile 10 güne kadar her 2-3 günde bir yeniden beslenebilir ve yeniden dozlanabilir ve istenilen bileşikler olsun veya olmasın taze ortamla değiştirilebilir.
- TUM622 spheroidlerinin sayısı üreticinin protokolüne göre 3D görüntüleyici kullanılarak ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TUM622 ve 2D kültüründe CAF'ler
Şekil 1, TUM622 hücrelerinin ve KAF'lerin 2B kültüründe tipik morfolojisini sunar. TUM622 hücreleri büyük çekirdeklerle yuvarlanırken, CAF'ler düz ve uzundur. TUM622 hücreleri kültürde %80-90 biraraya gelebilir. Daha fazla çoğalma daha fazla yol açar, ancak daha küçük hücreler doğrudan temas etmez kolonilerde toplanır. Buna karşılık, CAFs yüksek hücre yoğunluğunda büyümeye tercih ve yeterli besin sağlandığı takdirde tam bir kesişme de çoğalmaya devam edecektir.
TUM622 acini'nin 3D EC M'de büyüme ve morfolojisiM
Şekil 2, 3D kültürde tohumlanmış TUM622 hücrelerinin zaman dersi deneyini sunar. Veriler, tek BIR TUM622 hücresinin gömülü olduğunda acinar benzeri morfolojileri olan organoidler oluşturabildiğini göstermektedir. 5 ve 7.Figure 2A Her acinus, içi boş lümençevreleyen hücrelerin bir monolayer oluşan, vivo akciğer epitel benzer uygun apikal-bazal polarite görüntüler (Şekil 2B). Bu acinar benzeri yapılar hiperplastiktir ve yeterli besin sağlandığı sürece büyümeye devam ederler. ECM tamamen parçalanmadan önce kültür 24 güne kadar korunabilir (Şekil 2C). Seyreltme testini (LDA) (veriler gösterilmez) sınırlandırarak, sadece NADIR bir TUM622 hücresi nin alt popülasyonunun (<0.02%) olduğu tahmin edilmektedir acinar benzeri yapılar oluşturma kapasitesine sahip9.
TUM622-CAFs coculture'un büyüme ve morfolojisi
Şekil 3, TUM622-CAF kokültürlerinin kurulum ve temsili sonuçlarını göstermektedir. CAF'ler, matrisin üzerine üst üste boyatılarak veya TUM622 hücreleriyle birlikte gömülü olarak ortak kültüre entegre edilebilir. Kurulumne bakılmaksızın, CAF'lerin varlığı oluşan küresellerin sayısını ve boyutunu büyük ölçüde artırdı (Şekil 3B). İlginçtir ki, TUM622 acini CAFs ile yakın hale geldiğinde, onlar invaziv olmak ve CAFs doğru göç acini neden, yapılar gibi "gözyaşı damla" oluşturan(Şekil 3C). Monokültürdeki TUM622 acini'nin invaziv davranışlar sergilemediğini ve sadece CAF'lere yakın olduğunda yapılar gibi "gözyaşı damlası" oluşturduğunu unutmayın.
Temsili immünofloresan ve immünohistokimya boyama sonuçları
Şekil 4, 10 günlük kültürden sonra TUM622 acini'nin immünororesans ve immünohistokimya boyamasından elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Konfokal görüntüler immünoresanslekeli TUM622 acini'nin ekvatoral düzleminde çekilmiştir (Şekil 4A). Buna karşılık, immünohistokimya örneğinden her bir bölüm farklı düzlemlerde acini yakalayabilir(Şekil 4B). Her iki sonuç da her acinus içinde kök benzeri ve farklılaşmış hücrelerin heterojen ekspresyonu gösterdi.
WNt yol inhibitörü kullanılarak TUM622 3D sitotoksisite töz
Şekil 5, bir tankyrase inhibitörü olan XAV939 ile tedavi edilen TUM622 acini'nin doz yanıtını göstermektedir (Şekil 5A,B). XAV939 kaplama dan 1 gün sonra kültüre eklendi ve toplam 10 gün boyunca her 2 günde bir yenilendi. Deneyin sonunda, acini sayısı bir görüntüleyici tarafından ölçüldü. Daha yüksek büyütme de Brightfield görüntüleri de xav939 tedavi kuyular karşı kontrol küresel lerin morfolojisi yakalamak için elde edildi(Şekil 5C). Genel olarak, XAV939 acini oluşumunda doza bağlı inhibisyon görüntüler ve oluşan spheroidlerin doku mimarisini değiştirir. Bu sonuçlar TUM622 acinar morfogenez sırasında kanonik Wnt yolunun aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: TUM622 ve 2D kültüründe CAF'ler. TUM622 hücrelerinin ve 2B olarak kültürlenmiş CAF'lerin temsili parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam Chen ve ark.9'dan değiştirilmiştir ve izin le kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TUM622 acini'nin 3D ECM'de büyüme ve morfolojisi. (A) 10 günlük bir süre içinde bazal membran matriskültürTUM622 hücrelerinin Zaman ders görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Tum622 acini immünofloresans apikal-bazal hücre polarite işaretleri ile boyanmış, Golgi-enzim (GM-130, yeşil, apikal) ve Integrin alfa 6 (CD49f, bazal, kırmızı). (C) Kültürde 24 gün boyunca 24 kuyulu bir plaka içinde üç kat şeklinde kaplanmış acini sayısının (sağ eksen, kırmızı) ve ortalama acini boyutunun (sol y ekseni, mavi) ölçülmesi. Hata çubukları SD'yi temsil eder. Bu rakam Chen ve ark.9'dan değiştirilmiştir ve izin le kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TUM622-CAFs coculture büyüme ve morfolojisi. (A) TUM622-CAFs coculture kurulumuşekbilgi çizimi. CAF'ler ECM'deki TUM62 hücreleriyle birlikte yerle bir edilir veya birlikte gömülür. Coculture 6-12 gün sonra, TUM622 hücreleri mono-kültür ile karşılaştırıldığında daha fazla ve daha büyük acini oluşturmak ve CAFs ile yakın ve doğrudan temas halinde ECM işgal edebiliyoruz. İnvaziv fenotipin sadece ortak kültürde görülebileceğini unutmayın. (B) Tum622 3D kültürlerin 8 gün sonra overlaid CAFs varlığında veya yokluğunda Brightfield görüntü. Ölçek çubukları = 200 μm. (C) CaF'lerden bağımsız olarak konik kültürlerde oluşan gözyaşı damlası şeklindeki acini gösteren Brightfield görüntüleri, ECM'ye yerlebir edilir veya birlikte gömülüdür. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakam Chen ve ark.9'dan değiştirilmiştir ve izin le kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili immünofloresan ve immünohistokimya boyama sonuçları. (A)Kök/progenitor hücrelerinin (CXCR4 ve SOX2), mezenkimme (Vimentin), epitel diferansiyasyonu (Involucrin), apoptoz (Cleaved-Caspase-3) ve çoğalma (Ki67) yeşil, DAPI mavi, E-kadherin ve Phalloidin belirteçleri ile acini antikor boyama kırmızı. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) TUM622 acini'nin FFPE bölümlerinde immünohistokimya. Ölçek çubuğu = 100 μm (üst) ve 50 μm (alt). Bu rakam Chen ve ark.9'dan değiştirilmiştir ve izin le kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: TUM622 3D sitotoksisite titreti wnt yol inhibitörü kullanılarak. (A) TUM622 hücrelerinin dimetil sülfoksit (Kontrol) veya XAV939 ile tedavi edildiği 96 kuyuluk bir plakadaki küresel sayıların sayısallaştırılması. Her durum triplicates olarak titretedilir. Hata çubukları SD. temsil eder. (B) Acini oluşumu üzerinde XAV939 inhibitör etkilerini gösteren bir görüntüleyici ile çekilen 24 kuyuplaka tüm kuyu görüntüleri. (C) XAV939 tedavisinin neden olduğu morfolojik değişiklikleri gösteren kontrol ve tedavi kuyularından temsilen brightfield görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakam Chen ve ark.9'dan değiştirilmiştir ve izin le kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümörler, kanserle ilişkili fibroblastlar, endotel hücreleri ve ECM içindeki bağışıklık hücreleri gibi stromal hücrelerle yan yana bulunan kanser hücrelerinden oluşan heterojen dokulardır. Birlikte, bu çeşitli bileşenleri çapraz konuşmak ve tümör mikroçevre etkisi, tümörigenez sürüş aktif bir rol oynarken, tümör mimarisinde ilerleyici değişiklikler içeren bir süreç. İdeal olarak, tümör gelişiminin in vitro modeli, in vivo insan tümörlerinde gözlenen dinamik doku mimari değişikliklerini, tümör mikroortamındaki çeşitli hücre tiplerinin karmaşık etkileşimini ve aynı zamanda izin TME'deki tümör hücreleri ve bileşenleri üzerinde deneysel manipülasyon. Son yıllarda 3D kanser modellerinde çok ilerleme kaydedilmiş olmasına rağmen, bu tür modeller LUSC için hazır bir şekilde ortaya çıkmamıştır. Bugüne kadar bildirilen çoğu model, bu önemli özelliklerin yalnızca birkaç yönünü içermektedir. Burada, LUSC gelişimi sırasında gözlenen önemli doku mimari değişikliklerini eş zamanlı olarak yakalayan 3Boyutlu bir kokuşgülme sistemi ve ECM ve CAF'lar.
Bu sistemin doku mimari değişikliklerini daha doğru bir şekilde modelleme yeteneği, TUM622 hücrelerinin 3D EC'ye gömülü yken acinar benzeri morfolojileri olan organoidleri oluşturan benzersiz özelliğine dayanmaktadır. Kendi kendini yenileyen tek bir hücreden oluşan her acinus, içi boş bir lümeni çevreleyen tek katmanlı hücrelerden oluşur. Hücrelerin bu monolayer apikal-bazal hücre polaritesi sergiler ve non-invaziv kalır, akciğer epitel doku mimarisini andıran. TUM622 3D mono-kültür olarak hiperplastik büyüme gösterirken, CAF'lerin eklenmesi açinar morfogenezi daha da geliştirir ve giderek daha fazla acini oluşmasına neden olur. Daha da önemlisi, IKI hücre tipi yakınolduğunda, TUM622 hücrelerinin apikal-bazal polaritelerini kaybetmesine ve matrisi CAF'lere doğru istila etmesine olanak sağlayan, TUM622 hücrelerinde dinamik doku mimari değişiklikleri başlatır. Bu hipnotik değişiklikler hem erken hiperplazi hem de LUSC'nin geç invaziv evrelerini özetler.
Her küresel oidin birçok hücrenin toplanmasıyla oluştuğu birçok tümör küresel modelinin aksine, her TUM622 acinus tek bir hücreden türetilmiştir9. In vitro LDA ile sadece küçük bir alt popülasyonun (%≤0.02) olduğu tahmin edilmektedir. TUM622 hücrelerinin bukapasite9. Nadir olmasına rağmen, bu hücreler kendi kendini yenilemek gibi 3D seri geçiş geçmesi kapasitesine göre yanı sıra orijinal tümörün benzer hücrelerin heterojen bir nüfus içine ayırt. TUM622 hücrelerinin bu benzersiz özelliği sayesinde, başarılı kültürleme ve aşağı akım analizi için kaplama sırasında Tek TUM622 hücrelerinin ECM içinde eşit şekilde dağıtılmasını sağlamak çok önemlidir. Bu amaca ulaşmak için protokolde, uygun tohumlama yoğunluğunun belirlenmesi, erken katılaşmayı önlemek için hücre ve matrisin karıştırılması sırasında tüm araçları ve reaktiflerin serin tutulması, karıştırma işlemi sırasında kabarcıkların ortaya çıkmasından kaçınılması ve matrisin kültür ortamı eklemeden önce tam olarak katılaşması için yeterli zaman sağlanması da dahil olmak üzere protokolde dikkatle izlenmesi gerekir. Birlikte, bu önlemler tüm gömülü hücreler için daha düzgün bir matris substrat ve kültür durumu elde etmek için yardımcı olacaktır.
Başarılı bir şekilde kurulduktan sonra, bu kültür tümörigenezi düzenleyen hücre ve biyokimyasal süreci incelemek için çeşitli downstream analizleri için kullanılabilir. Her kuyuda oluşan acini sayısı ve boyutu parlak alan görüntüleyicileri ile zaman içinde izlenebilir ve TUM622 hücrelerinin proliferatif ve kendini yenileme kapasitesi için bir okuma olarak kullanılabilir. Her anezonun morfogenezinde daha ayrıntılı dinamikler, çeşitli etiketleme boyaları olsun veya olmasın, konfokal mikroskopta canlı görüntüleme ile gözlemlenebilir. Koşullu ortam, hücre hücresi veya hücre-matris çapraz görüşmelerine aracılık eden çözünebilir faktörleri analiz etmek için kültür dönemi boyunca birden çok zaman noktasında toplanabilir. Protokol 4 ile doğrudan ECM'den çıkarılan TUM622 hücreleri, gen ekspresyonu analizi, akış sitometri sitometrisi ölçümü veya hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı FACS sıralaması için RNA ve protein ekstraksiyonu için uygundur. Alternatif olarak, kültürler çeşitli belirteçlerin mekansal-zamansal dağılımlarını anlamak için yerinde immünoresans veya immünohistokimya çalışmaları için sabit olabilir. Benzer olmasına rağmen, immünohistokimya konfokal hedeflerin sınırlı görüntüleme derinliği nedeniyle mümkün olmayabilir tüm acini örnekleme sağlar immünofloresan yöntemleri tamamlar. Bu yöntemlerin her ikisi için de fiksasyon ve permeabilizasyonun yapıldığı zaman ve sıcaklık önemlidir, özellikle TUM622 hücrelerinin yoğun bir matrise (>%90 bazal membran matrisi) gömülü olduğu düşünülürse, diğer birçok 3B kültürün aksine matris yoğunluğu çok daha düşüktür. Bu nedenle, çoğaltıcı sonuçlar elde etmek için standart ve tutarlı fiksasyon ve işlemedikkat gereklidir.
Bu sistemi bir platform olarak kullanarak, tümör hücrelerindeki hücre içsel değişikliklerinin yanı sıra tümör mikroortamındaki hücre-dışsal değişikliklerin epitel mimarisini nasıl etkilediğini ve karsinom oluşumunda rol oynayan erken olayları nasıl etkilediğini araştırabiliriz. Örneğin, tümör doku mimarisini düzenleyen onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin rolleri, tümör hücrelerindeki ilgi genini hedefleyen fonksiyon kaybı veya kazanç veya kayıp deneyi ile incelenebilir. Nitekim, SOX2'nin, genellikle LUSC'de gözlenen aşırı ekspresyonunun, 3D'de hiperplazi kaybı ve displastik büyümeye doğru ilerleme ile kanıtlandığı gibi TUM622 hücrelerinin fenotipini değiştirdiğini gösterdik9. Öte yandan, bir coculture ayarlarında kanser ile ilişkili fibroblastlar normal karşılaştırabilirsiniz, matris bileşenleri veya sertlik etkisi acini büyüme / morfoloji / invazyon nasıl belirlemek, ve bazı sitokinler engelleme hücre-hücre iletişimi ile müdahale edebilir ve sırayla doku mimarisi ve tümör ilerlemesini etkileyebilir. Daha da önemlisi, tüm bu tahliller varlığı veya bazı terapötik ajanların yokluğunda yapılabilir ve çok boyutlu bir okuma ile LUSC hücrelerinin ilaç yanıtı belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir11. Bu sistemin sorgulamak için kullanılabilecek yollar açısından sınırlı olduğunu da belirtmek önemlidir, çünkü sadece bazı ancak tüm önemli sinyal yolları kültürdeki TUM622 organoidlerinin büyümesini ve morfolojisini düzenler (yani Wnt inhibisyonu ancak NOTCh sinyalizasyonu TUM622 hücrelerinin aneristmogenezini etkilemez)9.
Özetle, bu organoid sistemin tümör ilerlemesi sırasında LUSC hücreleri ile tümör mikroortamı arasındaki dinamik etkileşime yeni bakış açısı kazandıracak benzersiz bir platform sağladığını gösteriyoruz. Model sistemimizin ilaç keşfi ve gelişimi için değerli bir platform olacağını öngörüyoruz. Bu bağlamda, yerli tümör doku bağlamında yeni anti-kanser terapötik tarama lusc hedefleyen daha etkili terapötik seçimi ve geliştirilmesinde yardımcı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar Pfizer Inc. çalışanları ve hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Pfizer-Onkoloji Histopatolojisi ve Biyomarker grubundan Magali Guffroy, John Kreeger ve Stephani Bisulco'ya patoloji/histoloji desteği için ve Michael Arensman'a makalenin eleştirel incelemesi için teşekkür ederiz. Ayrıca Pfizer Doktora Sonrası Programı ve Onkoloji Ar-Ge grubuna, özellikle Robert Abraham, Puja Sapra, Karen Widbin ve Jennifer Tejeda'ya programa verdikleri destekten dolayı teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
