Summary
Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsilerini indüklemek ve yara kapanışını gerçek zamanlı olarak izlemek için prosedürün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Ayrıca yara yatağının histolojik, immünohistokimyasal ve moleküler analizleri için dokuların hazırlanması için yöntemler sağlanmaktadır.
Abstract
Gastrointestinal (GI) sistem hastalıkları incelerken akut yaralanma yanıtının yanı sıra yara iyileşme sürecinde meydana gelen doku ve hücresel değişikliklerin anlaşılması son derece önemlidir. Murine kolonik çimdik biyopsi modeli bu süreçleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Ayrıca, bağırsak parlak içeriği (örneğin, mikroplar) ve kolon arasındaki etkileşim incelenebilir. Bununla birlikte, yara indüksiyonu ve zaman içinde yara kapatmayı güvenilir bir şekilde takip etme yeteneği zor olabilir. Ayrıca, histolojik ve moleküler değişiklikleri en iyi şekilde sorgulamak için doku hazırlama ve yönlendirme standart bir şekilde yapılmalıdır. Burada biyopsi kaynaklı yaralanmayı ve tekrarlayan kolonoskopiler yoluyla yara kapatmanın izlenmesini anlatan ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Yara boyutunun tutarlı ve tekrarlanabilir ölçümlerini, moleküler analizler için yara yatağını toplama yeteneğini ve dokuların kesitleri üzerine yara yatağını görselleştirmeyi sağlayan bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu teknikleri başarıyla yerine getirme yeteneği, kolon içindeki akut yaralanma yanıtı, yara iyileşmesi ve luminal konak etkileşimlerinin çalışmalarına izin verir.
Introduction
Gastrointestinal (GI) sistem, birden fazla işlevi, konak hücre tipleri (örneğin epitel, bağışıklık, stromal vb.) ve trilyonlarca mikrop göz önüne alındığında karmaşık bir organ sistemidir. Bu karmaşıklığın ışığında, GI kanalı hastalıkları genellikle tüm bu faktörlerin etkileşimini içerir. Örneğin, enflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), enflamatuar hücrelerin aktivasyonunu, disbiyozu ve epitel onarımı 1, 2 ,3,4,5,6,7'yi içeren GI kanalında iltihaplanma ve remisyon döngüleri ile ilişkilidir. GI sisteminin IBD ve diğer enflamatuar durumlarını incelemek için uygun model sistemlerine sahip olmak, hastalığın patogenezini emmek için kritik öneme sahiptir. Genetik olarak tasarlanmış fareler ve kemirgenlerde dektran sodyum sülfat (DSS) gibi kimyasalların kullanımı da dahil olmak üzere IBD patogenezini incelemek için çeşitli modellervardır 8,9,10. Bu modellerin sınırlamaları, iltihabın indüksiyonunu hassas bir şekilde kontrol edememenin yanı sıra yara iyileşmesini değerlendirmede zorluklar içerir. IBD patogenezinin yönlerini taklit etmek için alternatif yöntemler tedaviler geliştirmek için yararlı olabilir.
Farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri, enflamatuar yanıtın patogenezini, yara iyileşmesini ve kolondaki konak mikrop etkileşimlerini incelemek için yararlı bir model sistemi sunar. Bu yaklaşım ilk olarak 2009 yılında akut inflamatuar yanıtı ve bağırsaktaki yara iyileşmesini incelemek için yardımcılığını gösteren deneysel bir araç olarak kullanılmıştır11. Daha sonrakiçalışmalar, kolon yaraiyileşmesinde 11 , 12 , 13 , 14 , 15,16,17,18'de bağırsak mikrobiyotasının yanı sıra farklı sinyal yollarının rollerini değerlendirmek için bu tekniği kullandı. Daha yakın zamanda, grubumuz kolon hasarına akut yanıtta sphingosine-1-fosfat sinyalinin ve bakterilerin önemini araştırmak için bu modeli kullandı19. Yararlı olmasına rağmen, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak ve sonraki doku değişikliklerini değerlendirmek teknik olarak zor olabilir. Örneğin, yaralanmanın indüksiyonu üzerine bağırsağın delinmesinin gerçekleşmesi ve seri kolonoskopiler yoluyla yara yatağının tutarlı ölçümlerinin sağlanması zor olabilir. Ek olarak, histolojik veya immünohistokimyasal analizler için yara yatağını görselleştirmek için kolonik dokuyu düzgün bir şekilde yönlendirmek zor olabilir. Her ne kadar bu yöntemlerle ilgili bazı bilgiler mevcut olsa da18,20Bu tekniklerin kesin bir adım açısından açıklaması, bu modelin güvenilirliğini ve daha geniş yararını geliştirmeyi vaat eden görsel yardımlar sağlayacaktır. Burada, farelerde kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsileri yapmak, zamanla yara kapatmayı izlemek ve yara yatağının histolojik ve moleküler analizlerini sağlamak için dokuyu hazırlamak için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu teknikleri gerçekleştirmek için standart bir yöntem oluşturmak, GI iltihabı ve yara onarımı için potansiyel olarak önemli olan daha önce araştırılmamış arabulucuları incelemek için bu modelin kullanımını genişletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm prosedürler Weill Cornell Tıp Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı." To: "Burada açıklanan tüm prosedürler Weill Cornell Tıp ve Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.
1. Kolonoskopi ve yara indüksiyonu
- Önce 1,9 mm sert delikli endoskopu kılıma takarak endoskopun bileşenlerini önceden monte edin (Şekil 1A-B). Hava pompasını (kolonik insufflation sağlamak için) sağlanan boruyu kullanarak, çalışma kanalının yanındaki kılıfın sol tarafındaki gaz vanasına takın(Şekil 1C).
NOT: Burada açıklanan lens 0° olmasına rağmen, bu amaçla 30° lens de kullanılabilir. - Çalışma kanalının açık konumda olduğundan emin olun ve çalışma kanalından 3 Fr biyopsi forseps yerleştirin ve kılıfa kadar ilerletin (kılıfa çıkıntı çıkarmamasını sağlarken) (Şekil 1C). Monte edilen endoskopu, üreticinin talimatlarına göre ışık kaynağına ve video görüntüleme cihazına takın.
- Fareyi bir indüksiyon odasında oksijen ile% 5 izofluran ile uyuşturun. Daha sonra fareyi ventral tarafında bir ısıtma sistemi (hipotermiyi önlemek için) içeren endoskopik bir hazırlama platformuna taşıyın ve oksijenli% 2 izofluran içeren bir burun konisi kullanarak anestezi altında saklanın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem ekleyin. Bir refleksi test etmek için arka ayağı hafifçe sıkıştırarak farenin tamamen uyuşturulduğından emin olun.
NOT: Farelerin herhangi bir türü veya cinsiyeti bu teknikle kullanılabilir; bununla birlikte, farelerin en az 8 haftalık olması tercih edilir, bu nedenle prosedür için yeterince büyüktürler.- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhem ekleyin.
- Bir refleksi test etmek için arka ayağı hafifçe sıkıştırarak farenin tamamen uyuşturulduğından emin olun.
- 3 mL'lik bir şırıngayı oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile ekli bir sıçan gavage iğnesi ile doldurun. Farenin anüsüne yaklaşık 1 cm iğne yerleştirin ve dışkı malzemesini temizlemek için PBS'yi hafifçe demleyin. Aşılanan PBS ile birlikte fareden birkaç dışkı peleti çıkmalıdır.
NOT: Aşırı miktarda PBS'nin aşılanması, lümende köpük oluşumuna neden olabilir ve bu da lümenin görüntülenmesini gizleyebilir. - Monte edilen endoskopu farenin anüsüne 0,5 cm yerleştirin. Biyopsi forsepslerini, forsepslerin tam 'çeneleri' (menteşe dahil) kılıbun ucunun ötesine geçene kadar (video monitöründe gözlemlendiği gibi) rektumun lümenine ilerletin (Ek Video 1). Çeneleri doğu-batı yönünde açacak şekilde 90° çevirin (Ek Video 1).
- Biyopsi yapmak için forsepsleri açın ve yaklaşık 1 cm ilerleyin, forsepsleri kapatın ve tek bir düzgün hareketle forsepsleri kapalı bırakırken hızlı bir şekilde geri çekin (Ek Video 1).
- Biyopsi yaparken kolonu tamamen enflamaktan kaçının. Bu nedenle, bu adım sırasında gaz vanasının sağ tarafını açık bırakın; her ne kadar kümesleri açıldıktan sonra kolon bu pozisyondayken mukozaya zarar verme riski olduğu belirtilmelidir.
2. Yara yatağının görselleştirilmesi ve ölçülmesi
- Kolonoskop kayıt cihazına bağlı ayak pedalı basarak biyopsiden hemen sonra video kaydını başlatın. Havayı endoskopa ve dolayısıyla kolona zorlamak için açıklığı tamamen kapatmak için gaz vanasının sağ tarafına bir işaret parmağı bastırarak kolonu tamamen insufflate edin.
NOT: Bu protokol, hava akışının manuel olarak kontrol ettiği bir hava pompasının kullanımını açıklasa da, kontrollü hava beslemeli bir peristaltik pompa da kullanılabilir. - Forsepsleri kılıfa geri ve kapalı konumdayken rektal lümene ilerletin (Ek Video 1). Çenelerin tabanı görüntüleme alanının üst kenarı ile hizalanana kadar kaleleri yaranın hemen üzerine rektal duvara yerleştirin(Şekil 2 ve Ek Video 1). Yaranın net bir görünümü gözleninene kadar kolonu tamamen ensufflating devam edin.
NOT: Endoskop lensi ile lezyon arasında tutarlı bir mesafe sağlamak için incelenen her fare için forsepslerin sadece çenelerini tabana kadar ortaya çıkaracak kadar uzatılmasına özen gösterilmelidir(Şekil 2, beyaz ok). - Aynı gün birden fazla fare üzerinde biyopsi yapıyorsanız, önceki farenin biyopsilenmiş dokusunu kümeslerden çıkarın (sağlanan temizleme fırçasını kullanarak) ve bir sonraki farede bir yaraya neden olmadan önce temizlemek için lens kılımını% 70 etanol ile silin.
NOT: Bu protokolde fare başına tek bir biyopsi yapılması açıklansa da, daha sonraki biyopsilerde tam biyopsi yapılabilmesini sağlamak için önceki biyopsiden alınan dokununpstan çıkarılması koşuluyla tek bir fare üzerinde birden fazla biyopsi yapılabilir. - İşlemi tamamladıktan sonra anesteziden kurtulana kadar hava yolunu açık tutmak için fareyi diğer farelerin kafes boşluğuna ve bir havlunun üzerine yerleştirin. Aktiviteyi geri kazanarak belirtildiği gibi anesteziden iyileştiğinden emin olmak için fareyi izleyin.
NOT: Yarayı indüklemek ve yara yatağını 0. günde görselleştirmek için iki kişi gerekir (biri endoskopu, diğeri biyopsi forsepsini çalıştırma) ancak sonraki günlerde yaraları görselleştirmek için sadece bir kişiye ihtiyaç vardır (aşağıda açıklandığı gibi). - Yaranın indüksiyonu dışında, yukarıda 1.1-1.4 bölümlerinde açıklandığı gibi, sonraki yara ölçümleri için fare ve kolonoskopinin hazırlanması için aynı prosedürü izleyin (genellikle biyopsiden sonraki 2, 4 ve 6. günler).
- Endoskopu taktıktan sonra video monitöründeki yara yatağını bu zaman noktalarında bulun ve biyopsi forsepsini (kapalı konumda) yara yatağının hemen üstüne ilerletin, kolonu alt edin ve bölüm 2.1 ve 2.2'de açıklandığı gibi video kaydını başlatın (Şekil 2).
NOT: Biyopsiden 6 günden fazla bir süre sonra yara yatağını bulmak zor olabilir. - Endoskop lensi ile lezyon arasında günler boyunca tutarlı bir mesafe sağlamak için forsepsleri sonraki günlerde lümene 0 gün ile aynı mesafeye ilerletin. Lens ve lezyon arasında tutarlı bir mesafe sağlamak, zaman içinde ölçümlerin doğruluğunu artıracaktır.
NOT: Bu günlerde bir kişi ölçüm yapabilir (endoskop sağ elle çalıştırılır ve biyopsi önpsleri sol elle ilerletilir). - Tüm ölçümler tamamlandıktan sonra, seri kolonoskopilerin video kayıtlarını videodan hareketsiz çekimler oluşturulmasını sağlayan video düzenleme yazılımında açın.
- Videoyu, yara yatağının kolayca görselleştirilebildiği, kapalı forsepslerin yara yatağının üstünde ve rektal duvara karşı olduğu ve duvarın gergin olduğu bir noktayı gösteren bir kareye ilerletin. Bu çerçevenin bir anlık görüntüsünü alın ve yara yataklarının ölçümlerinin kör bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlamak için dosya adını kodla.
- Yara yatağının boyutunu ölçmek için NIH ImageJ'de kodlanmış dosya adlarına sahip görüntüleri açın. Çözümle sekmesinin altında Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve Alan kutusunu işaretleyin.
- Ana menü çubuğundan Serbest seçim aracını seçin ve yaranın etrafına bir çevre çizin (bkz. Şekil 2). Analiz Et sekmesinin altında Ölçü'nün altında Ölçü'nün altında, bu ölçümün değeri Sonuçlar penceresinde otomatik olarak doldurulur.
- Tüm görüntüler için ölçümleri tamamladıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki Dosya sekmesinin altında Farklı Kaydet'i seçerek ve uzantıyı elektronik tablo dosyası olacak şekilde değiştirerek sonuçları bir elektronik tabloya dışa aktarma.
- Yaranın indüksiyonunu izleyen günlerde (yani 2, 4 ve 6. günler) yaranın boyutunu, bir elektronik tablodaki 0. Bunu, her gün yaranın boyutunu 0.
NOT: Bu kolonoskopik görüntüleme yöntemi kullanılarak normal koşullarda, yaranın en büyük kapanması ilk 2 günden sonra (~%75 boyut küçülme) ve 4 ve 6. günlerde daha kademeli kapanma (~%80 ve ~%95 boyut küçülme) gözlenir.
3. Moleküler analiz için yara yatağının toplanması
- Biyopsiyi takip eden seçilen günde CO2 boğulmasını ve ardından servikal çıkığı (veya eşdeğer tekniği) kullanarak fareyi ötenazi yapın.
- Vücut boşluğunu açığa çıkarmak için deriyi ve karın kasını açarak kolonun distal bölgesini hasat edin. Kapalı makası kolonun altına yerleştirin ve alttaki mezentery'den serbest bırakmak için hafifçe kaldırın ve ardından fareden çıkarmak için kolonu orta noktasında ve anüste kesin.
- Dışkı içeriğini, buz gibi 1x PBS ile doldurulmuş 20 mL şırıngaya bağlı bir sıçan gavage iğnesi kullanarak yıkayın, ardından kolonu filtre kağıdına yatırın.
- Kolonu filtre kağıdında boylamsal olarak kesin ve mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü kalmasını sağlayın. Doku hala filtre kağıdındayken bir sıkma pipet kullanarak mukozaya% 0.2 metilen mavisi uygulayın ve ardından fazla metilen mavisini boşaltın. Kolonu bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve yara yatağını bulun (Şekil 3A).
- 4 inç mikro iris makası kullanarak, yara yatağının kenarını kesin(Şekil 3A,kesik daire) kas tabakasını kesmemeye dikkat edin (kas istenmediği sürece) ve parçalanan yara yatağını çıtçıt dondurma veya istenen depolama yöntemi için ince nokta cımbız kullanarak bir tüpe aktarın.
NOT: Bu şekilde toplanan doku miktarı RNA-seq veya eşdeğer analiz için RNA çıkarmak için yeterlidir.
4. Histolojik analiz için dokunun hazırlanması
- Fareyi ötenazi edin ve 3.1-3.2 adımında açıklandığı gibi iki nokta üst üste hasat edin.
- Kolonu filtre kağıdında boylamsal olarak kesin ve mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü kalmasını sağlayın. Bir sıkma pipeti kullanarak% 4 paraformaldehit (veya tercih edilen fiksatif) hafifçe uygulayın ve dokuyu parafilm ile örtün. Kapalı bir kapta 4-6 saat boyunca düz bırakın.
- Dokuları depolama için% 70 etanol aktarın. Dokuları işlemeye hazır olduğunuzda, parafilmi çıkarın ve doku hala filtre kağıdı üzerindeyken bir sıkma pipet kullanarak mukozaya% 0.2 metilen mavisi uygulayın. Sonra fazla metilen mavisini boşaltın.
- Kolonu bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin ve yara yatağını bulun (Şekil 3A). #10 bıçaklı bir neşter kullanarak, doğrudan yara yatağının ortasından kesin ve kolonun geri kalanını düz bir çizgide kesmeye devam edin, böylece kolon ikiye bölünmüş, uzunluk açısından(Şekil 3A, siyah çizgi).
- Kolonu işleyin ve daha sonra parafin gömme (kesildikten sonra kalan bir veya her iki taraf) neşter tarafından kesilen taraf (bizeksiyondan önce yara yatağının merkezi olan taraf) parafin içinde yüzüstü olacak şekilde gömün. İstenilen lekeler veya yapıcılar için kesme bölümlerine ve boyamaya devam edin.
- Belirli bir boyama için kriyoseksiyonlar gerekiyorsa, kolonu adım 3.1'de açıklandığı gibi hasat edin ve filtre kağıdında uzunlamasına açın, mezenterik tarafın filtre kağıdına karşı yüzüstü olmasını sağlayın.
- 4.5. adımda açıklandığı gibi yara yatağını taze hasat edilmiş kolon içinde ikiye ayırın ve kolonu (kesildikten sonra kalan bir veya her iki taraf) neşter tarafından kesilen tarafın doku dondurma ortamı ile yarı dolu bir taban kalıbına yüzüstü olacak şekilde gömün.
- Dokuyu ince cımbızla yerine sabitleyin ve donma ortamını sertleştirmek için baz kalıbı kuru buzun üzerine metal bir plakaya yerleştirin. Ortamın alt kısmı dondurulduktan (ve doku yerinde tutulduktan) sonra, dokuyu serbest bırakın ve baz kalıbın kalan hacmini donma ortamıyla doldurun ve kuru buza geri yerleştirin.
- Tüm donma ortamı hacmi dondurulduktan sonra, kesilene kadar -80 ° C dondurucuya aktarın.
- Parafin veya dondurulmuş bölümler için, çalışmaya özgü boyamaya geçmeden önce yara yatağının bölüme yakalandığından emin olmak için H&E tarafından ek bölümleri kesin ve lekelendirin. Şekil 3B, yara yatağının açıkça gözlemlenebildiği bir bölüm örneği göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyopsi yapmak için gereken küçük öğeler (lens, kılıt, biyopsi tokmakları) bu bileşenlerin uygun montaj göstergeleri ile birlikte Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2, yara yatağının boyutunu ve yaranın kapanma oranını doğru bir şekilde ölçmek için yara yatağının kabul edilebilir görünümlerinin temsili görüntülerini göstermektedir. Yara yatağının eks vivo görünümünün bir örneği Şekil 3A'da, yara yatağının çevresinin göstergeleri (moleküler analiz için eksize edilecek bölgeyi gösteren) ve kesit üzerine yara yatağının görselleştirilmesini sağlamak için dokunun nerede kesileceği dahil olarak gösterilmiştir. Şekil 3B, yara yatağının açıkça gözlemlenebildiği H&E lekeli bir bölümün temsili bir görüntüsünü göstermektedir. Ek Video 1, biyopsi prosedürünün farenin kolonunun içinden bir görünümünü sağlar.
Şekil 1: Biyopsi yapmak için gerekli maddeler. (A) Lens (a), kılıt (b) ve biyopsi apse (c) görüntüsü. (B) Lensin kılıma yerleştirilmesi. (C) Kılışın çalışma kanalından (katı ok) kümes uçlarının yerleştirilmesi. Kesikli ok, hava pompasının takılması için doğru konumu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Biyopsiden sonra yara yatağının kolonoskopik görüntüleri. Biyopsiden hemen sonra (Gün 0) ve 2, 4 ve 6 gün sonra kolonoskopilerin video kayıtlarından hareketsiz görüntüler oluşturuldu. Mavi çizgiler her zaman noktasında yara yataklarının kenarlarını gösterir. Ok, zaman içinde yara yatağının tutarlı ölçümlerini sağlamak için lensten rektal duvara uygun mesafeyi sağlamak için lümene tokaların doğru uzunluğunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yara yatağının ex vivo ve bölümlenmiş görüntüleri. (A) Biyopsiden 2 gün sonra bir fareden kolon toplanmış, %0,2 metilen mavisi ile boyanmış ve diseksiyon mikroskobu altında görüntülenmiştir. Kesikli daire yara yatağının kenarlarını gösterir. Siyah çizgi, bölümleme için gömmeden önce yara yatağını / kolonunun ikiye ayrıştırılacağı yeri gösterir. (B) Yara yatağının H&E lekeli bölümünün temsili görüntüsü. Yıldız işaretleri yara yatağını gösterir ve oklar yaralı bölgenin sınırlarını gösteren yara yatağına bitişik bozulmamış mahzenleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Biyopsi prosedürü ve yara yatağı görüntüleme. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu modelde yara kapatma oranını etkili bir şekilde değerlendirmeye çalışırken tutarlı ve doğru biyopsilerin yanı sıra yara büyüklüğü ölçümlerinin sağlanması son derece önemlidir. Bu nedenle, prosedürlerin doğru şekilde yürütüldüğünden emin olmak için çeşitli önlemler alınmalıdır. İlk olarak, biyopsinin derinliği çok sığ veya derin olmamalıdır. Çok sığsa, yara kapatmayı değerlendirmek için yeterli bir pencere olmayacaktır. Şekil 2, 0. günde en uygun biyopsi derinliğini ve boyutunu göstermektedir. Yara yatağının etrafındaki mukoza ile yara yatağının altında kalan doku arasındaki açık ayrıma dikkat edin (Şekil 2). Biyopsi çok derinse, perforasyon oluşabilir, böylece paha biçilmez bir fare ile sonuçlanabilir. 0. günde biyopsi sonrası insufflation üzerine, farenin karnı ciddi şekilde distanded olursa, perforasyon meydana gelmiştir ve fare değerlendirme için kullanılamaz ve ötenazi yapılmalıdır. Aynı bireyin tutarlılığı daha da sağlamak için belirli bir çalışma için biyopsileri gerçekleştirmesi yararlıdır. İkincisi, biyopsinin daha proksimal bir bölgede değil, rektumda yapılması kritik öneme sahiptir. Rektumun kolonun daha proksimal bölgelerinden daha kalın olduğu göz önüne alındığında, perforasyon olasılığı belirgin şekilde azalır. Kılışın dışına uçtan 0,5 cm uzaklıkta bir işaret yapılmalı ve endoskop sadece biyopsi tokmaklarının rektumun ötesine uzanmayacağından emin olmak için o noktaya kadar yerleştirilmelidir. Üçüncüsü, hem biyopsi sırasında hem de yara yatağını görselleştirmek için doğru miktarda insufflation'a sahip olmak esastır. Biyopsi sırasında, kolon çok şişmişse, kolon duvarı çok gergin olacaktır ve biyopsi için yeterli miktarda mukoza olmayacaktır. Bu nedenle, endoskopu işleten bireyin, kolona minimum hava akışı sağlamak için işaret parmağını gaz vanasının açık ucuna bastırmaması önerilir. Ancak yara yataklarını yara boyutunu ölçmek amacıyla görselleştirirken tam tersi bir yaklaşım kullanılmalıdır. Yara yerleştirildikten sonra, işaret parmağını gaz vanasının açık ucuna sıkıca bastırarak kolonu tamamen insufflate edin ve istenen bir görünüm elde edilene kadar orada tutun. Kolonik duvar bu amaç için mümkün olduğunca gergin olmalıdır. Not olarak, kolonun tam insufflation da yara yatağının tutarlı yanal görünüm sağlamak için önemlidir. Son olarak, aynı farelerdeki birden fazla kolonoskopi üzerinde doğru ölçümler sağlamak için lens ve yara arasında tutarlı bir mesafenin korunmasını sağlamak önemlidir. Daha yakın bir mesafe yapay olarak yara yatağının olduğundan daha büyük görünmesini sağlayacak ve daha uzak bir mesafe daha küçük görünmesini sağlayacaktır. Bu nedenle, biyopsi tokmaklarını mesafeyi korumak için bir rehber olarak kullanmak çok faydalıdır.
Bu modeli kullanırken dikkate alınması gereken önemli hususlara ek olarak, bu prosedürü etkili bir şekilde gerçekleştirme yeteneğini de etkileyebilecek daha küçük noktalar vardır. Örneğin, kolonoskopi yapılırken kolonik lümenin açık olduğundan emin olunmalıdır. Dışkı malzemesi PBS ile yıkanarak temizlse de, endoskopu taktıktan sonra ek malzeme rektumun içine inebilir. Ayrıca, biyopsiden hemen sonra yara yatağını görselleştirirken, kan alanı gizleyebilir. Bu nedenle, bazen endoskopu rektumdan çıkarmak, luminal kanı temizlemek için kolonu PBS ile yıkamak ve yara yatağını görselleştirmek için endoskopu yeniden tak etmek gerekir. Bazı durumlarda, kan ve diğer ışık içeriği lense yapışabilir ve alanı gizleyebilir. Bu durumlarda, endoskop fareden çıkarılmalı ve görüntülemeye devam etmeden önce fırça kullanılarak lens silinmelidir.
Kolonoskopik güdümlü çimdik biyopsi modelinin ortaya çıkmasından önce, araştırmacılar kolonik yara iyileşmesini araştırmak için sınırlı model sistemlerine sahipti. Bir yaklaşım, DSS8gibi kolonik yaralanmanın kimyasal indükleyicilerine maruz kalmadan geri kazanımı değerlendirmekti. Bununla birlikte, bu yaklaşım, indüklenen yaralanmanın boyutunun veya yaralanmanın kolon boyunca yerinin kesin olarak kontrol edilmesine izin vermez. Ayrıca, mukozal iyileşmenin gerçek zamanlı olarak hassas ölçümleri bu kimyasal modellerle zor olabilir. Yararlı olmasına rağmen, biyopsi modelinin de sınırlamaları vardır. Örneğin, operatörler distal kolonda yaralama yapmakla sınırlıdır. Bu sınırlama, önemli bir klinik konu olan küçük bağırsak ülserasyon çalışmalarını önler. Ek olarak, bu teknik IBD patogenezinin bazı yönlerini yeniden düzenlese de, bu hastalığın gerçek bir modeli olarak kabul edilemez. Teknik olarak, fareler arasında tutarlı yara boyutlarına neden olmak, paha biçilebilir yaralar oluşturmak veya yara iyileşme sürecinin sonraki aşamalarında yara yataklarını bulmak zor olabilir. Bu noktaları dikkate alırken, paha biçilmez örneklerin kaybını hesaba katmak için ek farelerle çalışmalara başlamanız önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Crohn's and Colitis Foundation (D.C.M) ve New York Crohn's Foundation (D.C.M. ve A.J.D.) tarafından desteklendi. Yazarlar, bayan Carmen Ferrara'ya bu makalenin video eşlikini oluşturmada yardımcı olduğu için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
